土壤灭菌的方法

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土壤灭菌的方法范文第1篇

关键词：生物土壤添加剂微生物

Abstract: soil microorganism quantity and activity is marked a soil fertility index [1]. Due to the use of fertilizers, few don't even organic fertilizer, and also as a result of the cause of the continuous cropping obstacles, use normal cultivation and management measures will also happen weak growth potential, yield and quality of the decline of the phenomenon. Many years continuous water management and should not cause soil environmental degradation, soil fertility dropped, and the soil microbial flora disorder, crop the soil-borne increased year by year [2], to crop yield and quality caused very big effect. This kind of phenomenon serious threat facilities vegetables sustainable development. In recent years, research showed that soil microbial can help plant nutrients to adapt to stress environment, improving soil nutrient absorption effect [3].

Keywords: biological soil additives microorganisms

中图分类号：G633.91文献标识码：A 文章编号：

土传病害一直是农业生产中难以解决的问题，为害严重地块会造成全田毁灭。目前我们亟待一种防病措施来更好的发展我国的蔬菜产业，特别是黄瓜的生产——它作为本市主要栽培的保护地蔬菜品种，多年的连作造成枯萎病、根腐病、疫病等土传病害的发生，对其产量造成了很大威胁，损失可达20－30％，严重的可达50％以上，目前解决方法以嫁接和药剂处理土壤为主。一些农业措施如休闲、轮作、熏蒸等效果不错，但受环境及经济条件限制无法普遍实行。利用太阳能杀菌及生物防治，目前正在开发研究中。生物土壤添加剂不仅能够防治传病害，而且能够改良土壤，增加土壤的有机质含量及有益微生物的数量，维持自然界的平衡。与化学防治相比，生物土壤添加剂的应用减少了农药污染及土壤中有毒物质的积累[4]。

利用拮抗菌对土传病原菌的生物防治国内外已有大量报道，然而许多菌株田间防效并不理想，原因之一是直接引用客土的拮抗微生物不能很好地在土壤中定居成为优势种群。有机添加物的施入在某种程度上起到“接种”作用，有机物本身已带有大量生物，其带入的活性有机碳源有是微生物繁殖的主要能源，因此利用有机添加物培养拮抗菌，不仅可以巩固拮抗菌在土壤中的定植，而且增强了抑菌的效果。1999年刘琼光报道利用拮抗菌和土壤添加剂同时施入土壤对 烟草青枯病的防治效果，显著好于两种单独使用的效果[5]。1994年上海农科院周新根报道利用由蚕豆粉、无机盐制成的“MX”有机添加物，灭菌后分别培养三种拮抗菌株，1%的添加量对辣椒疫病、番茄立枯病、猝倒病具有很好的防效，显著高于单用。在灭菌土壤中培养四周后拮抗菌的种群密度比单独施用拮抗菌的处理高50-100倍，且拮抗菌存活时间较长[6]。

木霉菌在真菌中具有重要生防价值，以其存在的广泛性、在环境中易定植、繁殖速度快等优点受到人们的重视。20世纪70年代以来人们对生防机制作了深入研究，证实木霉菌对植物病原真菌具有竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导植物抗病性等生防机制，并从分子水平上探索了其作用机理[7—9，12]。同时人们以木霉菌为材料对多种植物病害的防病效果进行了大量小型试验[10，11，13]，取得了较好效果，并以此为基础研制出了木霉菌生防农药。

本试验就是应用有机、无机营养物质混合后制成的生物土壤添加剂。明显改变了土壤中木霉菌的数量。利用太阳能灭菌和生物土壤添加剂的共同作用，是防治作物病害的一项重要措施，国内外对此均有研究报道。生物土壤添加剂的防病机制综合为无机盐的抑菌作用、有益微生物的拮抗作用、营养物质的促长作用、有机物质增强土壤病原菌的腐生性，削弱其致病性。利用土壤添加剂与其他防治方法相比有很多优点，生物土壤添加剂为拮抗菌及有益丛枝菌根的生物土壤添加剂，缓解设施栽培日益严重的连作障碍，减轻病害的发生，提高产品的产量和质量;有利于环保，对人畜安全，无污染；促进有害生物的无害化治理及可持续发展；有力于质量安全农产品及绿色食品的生产；减少化学农药的使用，改善土壤的理化性质，其应用前景广泛。

2材料和方法

2.1 供试土壤

研究在植物保护研究所院内进行。土壤为大田表土，土样1为耕作层(0-15cm),土壤灭菌(微生物含量最少)；土样2为耕作层土(0-15cm)，土壤未灭菌，(微生物含量最多)；土样3为亚表层土壤(15-30cm),土壤为灭菌(微生物含量次之)。

2.2 培养基的配制

2.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基配制

牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl 2.5g、琼脂7.5g、水500ml、PH为7.0—7.2。

2.2.2 高氏一号培养基配制

可溶性淀粉10g、NaCl0.25g、KNO30.5g、FeSO45mg、K2HPO40.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、琼脂10g、水500ml、PH为7.2—7.4。

2.2.3 马丁培养基配制

葡萄糖5.0g、蛋白胨2.5g、KH2PO40.5g、琼脂10.0g、水500ml、PH为6.4。

2.2.4 PDA培养基配制

土豆200g、琼脂15g、葡萄糖20g、水1000ml、孟加拉红33.3ml。

土壤灭菌的方法范文第2篇

关键词：高温灭菌；GM；芦笋；生长；矿质营养

中图分类号：S644.6 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0061-05

Effect of High-Temperature Sterilization to Matrix on Growth and

Mineral Nutrient Absorption of Asparagus Mycorrhizal Seedlings

Sun Chao1，2， Jin WenJuan2，3， Li WenLu4， Ma Jun2，

Shang Hui1，2， Bai LongQiang1，2，He ChaoXing2*

（1.College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；

2. Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；

3.College of Forestry，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；

4.College of Horticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China）

Abstract To determine the effects of Glomus mosseae（GM） on asparagus seedlings in high-temperature sterilized and non-sterilized matrix （peat：vermiculite=2∶ 1， V/V）， the pot experiments with Jersey Knight as material were conducted by inoculating GM to asparagus. The results showed that GM inoculation greatly promoted the growth of asparagus seedlings， formed stronger infection to asparagus roots， and enhanced the absorption to nine mineral nutrients. Meanwhile， GM inoculation in non-sterilized matrix had much more contribution to seedling growth and mineral nutrients absorption. So， non-sterilization was better for culture of asparagus mycorrhizal seedlings.

Key words High-temperature sterilization； GM； Asparagus； Growth； Mineral nutrient

芦笋（Asparagus officinalis L）又名石刁柏、龙须菜，为百合科天门冬属多年生宿根草本植物。因其富含皂甙、芦丁、氨基酸、蛋白质、维生素等多种营养物质，且具防癌、抗癌、降血压、降血脂、预防心血管疾病等功效，素有“蔬菜之王”的美誉。芦笋一次种植，栽培年限可达15～20年，因此培育壮苗在芦笋栽培中具有重要意义。

丛枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF）是一类与植物根系共生形成菌根而具有改善作物营养、提高作物抗病性、增强作物抗逆性等作用的土壤微生物[1]。摩西球囊霉（Glomus mosseae，GM）属于球囊霉属的丛枝菌根真菌，是一类对环境适应力强、应用范围广的丛枝菌根真菌。前人研究表明，对芦笋接种AMF可增加产笋量、提高嫩茎中人体必需氨基酸的含量[2]，增强芦笋幼苗抗温度胁迫的能力和对镰刀菌根腐病、紫纹羽病等土传病害的抗性[3～5]。前期研究表明，对芦笋进行GM真菌接种处理可以显著促进芦笋幼苗的生长，增强芦笋幼苗对矿质元素的吸收[6]，然而基质灭菌处理是否对芦笋菌根苗生长和矿质营养吸收产生影响尚未见报道。

灭菌处理可有效地杀死基质中的微生物，利于GM真菌在接种后起作用。基质灭菌的方法主要有高温灭菌和60Co辐射灭菌两种，60Co辐射灭菌成本较高，且具放射性不利于推广，生产中宜用高温灭菌的方法。本试验旨在通过研究基质高温灭菌处理对芦笋菌根苗生长和矿质营养吸收的影响，优化芦笋菌根苗的培育方式。

1 材料与方法

11 供试材料

供试芦笋品种为泽西奈特，购自北京市农林科学院。供试菌种为匈牙利科学院土壤科学与农业化学研究所Tunde Takacs博士提供的Glomus mosseae-2（简称GM2），原产地为匈牙利。菌剂是经玉米扩繁的由宿主植物根段、真菌菌丝、孢子、沙土组成的复合物，每克菌剂中孢子数目为2705个，菌根侵染率为714%。供试基质为草炭、蛭石混合物，将两者按体积比2∶ 1混合均匀。营养钵规格为底部直径8 cm，上口直径13 cm，高13 cm，使用前用75%酒精擦拭灭菌。

12 试验设计

试验于2011年9～11月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室进行，设4个处理：灭菌接种、灭菌CK、不灭菌接种、不灭菌CK。每个处理10株，重复3次，共120株。高温灭菌处理为间歇灭菌，即将基质置于恒温箱中连续2 d 160℃烘2 h。接种处理为播种时每播种孔穴施6 g菌剂，CK则加入等量灭活菌剂（160℃烘2 h）以保证营养物和微生物区系条件一致。芦笋种子经质量分数为06%的NaClO溶液浸泡10 min后用蒸馏水冲洗干净，浸种催芽。9月11日选取饱满一致、出芽整齐的种子播种于装有灭菌基质（约占营养钵体积4/5，预先浇透水）的营养钵中，接菌处理后在种子上方盖一层薄的基质，并上覆薄膜保湿，待出苗后揭去薄膜，自然温光条件下常规管理。于播种后20、30、40、50、60、70 d统计芦笋幼苗地上茎长度。播种后70 d时进行植株生物量、芦笋幼苗根系菌根侵染、组织器官矿质元素含量等指标的测定。

13 测定方法

用直尺测量芦笋幼苗地上茎（基质表面到生长点）长度，求和即为地上茎总长度；洗净芦笋幼苗根系，剪成约1 cm长的根段置于FAA溶液（配方为70%酒精∶ 甲醛∶ 冰醋酸=90∶ 5∶ 5，体积比）中固定24 h，用曲利苯蓝染色法[7]检测菌根侵染程度，制片镜检。根据Trouvelot等[8]的方法，按下述公式计算相关菌根侵染指标。

菌根侵染率（%）=有菌根根段数/总根段数×100；

根系中的菌根侵染强度（%）=（95×侵染率90%以上根段数+70×侵染率50%～90%根段数+30×侵染率10%～50%根段数+5×侵染率1%～10%根段数+侵染率1%以下的根段数）/总根段数×100；

根段中的相对菌根侵染强度（%）=根系中的菌根侵染强度×总根段数/有菌根段数×100；

菌根根段丛枝率（%）=（100×mA3+50×mA2+10×mA1）/100

公式中mA3、mA2、mA1分别是A3、A2、A1对应的菌根侵染强度，A3、A2、A1分别为丛枝充足、丛枝中等频率、丛枝少量。

根系丛枝率（%）=菌根根段丛枝率×根系中的菌根侵染强度/100

播种后70 d时将植株从营养钵中小心取出，用蒸馏水洗净，擦干，105℃杀青15 min后75℃烘至恒重测干物质重量。将植株干样按根、茎、拟叶分开并粉碎，半微量凯氏法[9]测定N元素的含量；样品经HNO3-H2O2（体积比5∶ 1）消煮后使用等离子电感耦合发射光谱仪（ICP-OES）测定P、K、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、B等元素的含量。各种元素的含量与各部分生物量的乘积即为该部分某元素的吸收量[10]。

菌根依赖性（%）=菌根植株干重/非菌根植株干重×100[11]；

菌根效应（%）=（接种GM处理元素吸收量-不接种GM处理元素吸收量）/接种GM处理元素吸收量×100

采用DPS软件Duncan’s 新复极差法对试验数据进行统计分析。2 结果与分析

21 基质高温灭菌处理对芦笋菌根苗生物量的影响

GM真菌接种后20 d起测定，图1表明，出苗初期，芦笋菌根苗的地上茎总长度与CK相比差异不显著；接种后30 d起菌根苗的地上茎总长度显著高于CK，且随着时间的延长，差异逐渐增大。接种后70 d时，不灭菌接种的芦笋幼苗地上茎总长度比灭菌接种的增加了97%，说明在基质不灭菌条件下接种GM真菌更有利于芦笋幼苗地上茎的生长。

图1 基质高温灭菌和GM真菌接种处理对芦笋

幼苗地上茎总长度的影响

GM真菌接种后70 d时测定，由表1可知，灭菌基质中芦笋菌根苗的根系、全株干物重分别比CK增加了389%、270%，未灭菌基质中增加了435%、452%；不同处理间茎叶干物重无明显差异。基质灭菌和不灭菌条件下芦笋幼苗的菌根依赖性分别为1270%、1487%，并且差异不显著，说明不论基质灭菌与否，GM真菌接种均可显著促进芦笋幼苗的生长，且两种条件下促进程度相近。同时，不灭菌接种处理的芦笋幼苗总干物重比灭菌接种处理的增加了298%，表明基质未灭菌状态下接种GM真菌更有利于芦笋幼苗的生长。

表1 基质高温灭菌和GM真菌接种处理对芦笋

幼苗干物重和菌根依赖性的影响

（g/株）

处理 根系

干物重 茎叶

干物重 总干物重 根冠比 菌根依赖

性（%）

灭菌接种 025 b 023 a 048 ab 109 ab 1270 a

灭菌CK 018 c 019 a 037 b 095 b -

不灭菌接种 033 a 028 a 061 a 118 a 1487 a

不灭菌CK 023 bc 020 a 043 ab 115 a -

注：表中数值为3个重复的平均值，同列不同小写字母表示差异显著（α=005），下表同。

22 基质高温灭菌处理对芦笋菌根苗根系侵染的影响

GM真菌接种后70 d时测定，灭菌接种和不灭菌接种处理的菌根侵染率、菌根侵染强度、相对菌根侵染强度差异不显著（表2），表明基质高温灭菌处理并未影响GM真菌对芦笋幼苗根系侵染的程度。GM真菌的绝对丛枝率和相对丛枝率在灭菌条件下较不灭菌条件下分别增加了11倍和15倍，说明对基质灭菌更有利于丛枝的发育。

表2 GM真菌对芦笋幼苗根系的菌根侵染情况

（%）

处理 菌根侵

染率 菌根侵染

强度 相对菌根

侵染强度 绝对丛

枝率 相对丛

枝率

灭菌接种 6000 a 3611 a 5947 a 1308 a 3813 a

灭菌CK 0 0 0 0 0

不灭菌接种 6445 a 3922 a 6135 a 609 b 1528 b

不灭菌CK 0 0 0 0 0

23 基质高温灭菌和GM真菌接种处理对芦笋菌根苗矿质营养吸收的影响

GM真菌接种后70 d时测定（表3），根系中N的吸收量灭菌接种比灭菌CK增加了488%，不灭菌接种比不灭菌CK增加了469%，说明基质高温灭菌没有明显影响GM2对根系N吸收的改善作用，Mg、Cu变化趋势与之相同。P、Ca、Zn的吸收量处理之间差异不显著。K的吸收量由高到低依次为不灭菌接种>不灭菌CK>灭菌接种>灭菌CK，其中基质不灭菌条件下接种GM真菌使根系中K的吸收量增加了131%，灭菌条件下增加了159%。Fe的吸收量以灭菌接种最高，不灭菌接种次之，灭菌CK和不灭菌CK最小且差异不显著。B的吸收量，基质不灭菌高于灭菌，接种处理与对照之间差异不显著。

对比接种后70 d时茎叶中元素吸收量可知，N以不灭菌接种的最高，比不灭菌CK的增加了391%，灭菌接种和灭菌CK的次之，且差异不显著，B的变化规律与N相同。P的吸收量为不灭菌接种和不灭菌CK的最高，差异不显著，灭菌接种的次之，灭菌CK最低，说明基质不灭菌更利于茎叶中进行P的吸收。K的吸收量不灭菌接种最高，不灭菌CK和灭菌接种差异不显著，灭菌CK最低。Ca、Mg的吸收量处理之间差异不显著。Zn的吸收量不灭菌CK相对于其他处理有所降低。Cu的吸收量接种处理高于CK，基质灭菌的增加了824%，未灭菌的增加了565%，且灭菌接种与不灭菌接种处理之间差异不显著。

表3

高温灭菌和GM真菌接种处理

对芦笋幼苗矿质元素吸收量的影响

处理 N

（mg） P

（mg） K

（mg） Ca

（mg） Mg

（mg） Zn

（μg） Cu

（μg） Fe

（μg） B

（μg）

根 灭菌接种 622 a 020 a 277 bc 082 a 036 ab 962 a 214 ab 11175a 466 b

灭菌CK 418 b 018 a 239 c 055 a 023 c 756 a 067 c 4308 c 728 b

不灭菌接种 567 a 031 a 388 a 095 a 043 a 957 a 258 a 8800 b 2459 a

不灭菌CK 386 b 019 a 343 ab 067 a 026 bc 777 a 141 bc 3515 c 2613 a

茎叶 灭菌接种 719 b 031 b 346 b 194 a 059 a 1020 a 155 a 3395 b 3971 b

灭菌CK 738 b 022 c 179 c 233 a 069 a 1074 a 085 b 7358 a 3762 b

不灭菌接种 846 a 049 a 577 a 225 a 071 a 1055 a 169 a 7237 a 4860 a

不灭菌CK 608 c 042 a 401 b 177 a 053 a 778 b 108 ab 3136 b 3246 c

全株 灭菌接种 1341 b 050 bc 623 c 276 ab 094 a 1982 a 369 ab 14570b 4438 c

灭菌CK 1156 c 039 c 418 d 288 ab 092 a 1830 a 152 c 11666c 4490 c

不灭菌接种 1413 a 080 a 965 a 319 a 114 a 2012 a 427 a 16037a 7319 a

不灭菌CK 994 d 061 b 743 b 244 b 079 a 1555 a 250 bc 6651 d 5859 b

注：表中数据均为单株的含量。

接种后70 d时，全株中N的吸收量由高到低依次为不灭菌接种>灭菌接种>灭菌CK>不灭菌CK，其中不灭菌接种比灭菌接种增加了54%，Fe具有相同的变化趋势。P的吸收量在基质灭菌状态下因GM真菌接种增加了282%，不灭菌状态下为311%，以不灭菌接种处理的最高，比灭菌接种的增加了600%，表明对基质不灭菌更利于芦笋菌根苗对P的吸收利用。K的吸收量在基质不灭菌状态下生长的幼苗高于灭菌状态下的，由高到低为不灭菌接种>不灭菌CK>灭菌接种>灭菌CK，其中不灭菌接种的比灭菌接种的增加了490%，说明了基质高温灭菌抑制了芦笋幼苗对K的吸收，而芦笋菌根苗在不灭菌的基质中对K的利用率最高。Ca的吸收量以不灭菌接种的最高，其他三个处理之间差异不显著。Mg、Zn的吸收量差异不显著。Cu的吸收量由高到低依次为不灭菌接种>灭菌接种>不灭菌CK>灭菌CK，其中不灭菌接种的比灭菌接种的增加了156%。全株B的吸收量不灭菌接种的最高，不灭菌CK的次之，灭菌接种和灭菌CK的最低。

GM真菌接种后70 d测定菌根效应，表4表明，根系中GM2对元素吸收的菌根效应，N、Mg差异不显著，不灭菌接种的P、Fe显著高于灭菌接种的，而K、Ca、Mg、Zn、Cu低于灭菌接种的；茎叶中不灭菌接种的N、Ca、Mg、Cu、Fe、B高于灭菌接种的，而K、Zn降低，P差异不显著。全株中GM菌根效应的变化趋势与茎叶中的相一致。

表4 GM在基质高温灭菌和不灭菌条件下

的菌根效应

（%）

处 理 N P K Ca Mg Zn Cu Fe B

根 灭菌接种 327 a 05 b 131 a 318 a 359 a 687 a 227 a 419 b -628 b

不灭菌接种 319 a 334 a 74 b 258 b 347 a 443 ab 51 b 567 a -70 a

茎叶 灭菌接种 -27 b 302 a 484 a -212 b -178 b 449 a -48 b -1300 b 54 b

不灭菌接种 280 a 135 a 305 ab 210 a 249 a 330 b 262 a 506 a 332 a

全株 灭菌接种 137 b 203 a 328 a -45 b 23 b 594 a 77 b -165 b -12 b

不灭菌接种 296 a 223 a 227 b 230 a 293 a 398 b 201 a 562 a 199 a

3 结论与讨论

试验表明，基质高温灭菌和不灭菌条件下对芦笋进行GM真菌接种处理均可以显著促进芦笋幼苗的生长，增加生物量，增强芦笋幼苗对矿质元素的吸收和转运，所以试验使用的GM2菌种对芦笋幼苗具有高效性。对比生物量和菌根效应可知，不灭菌条件下GM真菌对芦笋幼苗生长和矿质营养吸收的贡献更大，这可能与栽培基质（草炭∶ 蛭石=2∶ 1，体积比）经过高温灭菌后持水能力下降有关。至于其他类型基质高温灭菌对芦笋菌根苗的影响，有待于进一步研究。试验中发现两种条件下GM真菌对芦笋幼苗根系的侵染强度相近，但在灭菌条件下形成了更多的丛枝，其原因有待明确。

接种GM真菌作为一种生物技术，应用于芦笋栽培可培育壮苗，缩短苗期，节省肥料，提高有机基质的养分利用率[6]。本试验证实在基质（草炭∶ 蛭石=2∶ 1，体积比）不灭菌条件下GM真菌对芦笋幼苗生长具有更好的作用效果，因此，未经过高温灭菌的基质更利于培育具高产优质潜力的芦笋菌根苗，降本提效。参 考 文 献：

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土壤灭菌的方法范文第3篇

1.熟段木栽培。①选料接种。栽培灵芝的树种以榆、杨、柏、枫、刺槐等不含挥发油和杀菌物质的阔叶树为宜。就生料栽培来讲，一般在冬季砍伐，砍伐后自然堆放发酵。大约在接种前10-15天将原木锯成1米左右的段木，段木两端的横切面涂上石灰浆液，以防杂菌侵染。灵芝的母种、原种制法和其他食用菌制种相同，栽培种采用枝条木屑菌种。一般气温在20℃左右时（南方12月，北方3月份）接种。熟料栽培因接种后菌丝生长比生木快，故接种季节比生木晚15-20天。

②加强管理。接种后将段木呈井字形上堆，约经10-15天，菌丝由接种穴向四周蔓延生长时，把段木成排横卧于地面，然后用湿沙覆盖（一半细沙、一半黄土或夹沙土），并喷以适宜的水分保湿。覆沙后约30天，可把段木截成10-15厘米的小段，然后堆砌在阴凉潮湿地方。如湿度不够，应在周围空中喷雾数次，使空气相对湿度保持在85%-95%。1-3天后，若有横切面出现白色薄层，说明灵芝菌丝已在段木内部蔓延生长。这时即可将小段木垂直埋入土中，埋入深度为段木长度的2/3—3/4，埋木地点最好选择在树阴或瓜棚下。埋木期间要经常淋水，以保持土壤湿润，空气相对湿度保持在85%-95%。要注意防止白蚁等为害。生段木栽培，一般接种后2个月长出菌蕾，子实体成熟约需50-60天，从接种到采收需4个月左右。

③灭菌。熟段木栽培主要涉及一个灭菌的问题，首先要将锯好的段木装入塑料袋中，可一根装，也可一捆装。装好塞棉花，袋口束拢、扎紧、口外用纸包住。放入灭菌锅内灭菌。

高压灭菌保持1.5小时；常压灭菌100%保持10小时。高压灭菌时，蒸气压上升和下降的速度必须缓慢，不要排气，让其自然降压。

土壤灭菌的方法范文第4篇

    实验学时与安排

    本实验具有季节性、综合性和持续性的特点,选择在春季5~7月,实验总学时15学时,分5次进行,每次教学指导20min,采用小结实验进度和答疑方式。学生查阅资料、编制方案及实验报告不计入学时,根据报告内容和新颖性推荐发表。

    实验方法

    1样品采集与前处理学生实验前按5人1组分组,通过社会实践或生源地了解林木病害发生情况,实地采集或邮寄林木病害分离用标本,并填写好“林木病害调查记载卡(见图1)”。记载卡记录病害发生的生态环境因子、林地管理情况,对分析发病原因至关重要。采集标本注上标记后,如不能及时分离,要用塑料袋分类装好,冰箱中低温保存备用以防样品变质。

    2培养基制作培养不同的病原菌,要根据它们的需求配制适宜的培养基,对营养有特殊要求的病原菌还要配制特定的选择性培养基。培养基的种类很多,截至1930年,已经报道了将近2500种。学生要对所诊断的病害性质有一基本了解,如真菌病害或细菌病害,选择适宜培养基制作。因此,同学们在实验设计时应选择马铃薯葡萄糖琼胶培养基分离真菌或肉汁冻培养基分离细菌。由于该步骤要加热和高压蒸汽灭菌,有一定危险性,除安全教育外,还要求学生不能在灭菌期间离开实验室。马铃薯葡萄糖琼胶培养基制作时,先将洗净后去皮的马铃薯200g切碎,加水1000ml煮沸0.5h,用纱布滤去马铃薯,再加水补足1000ml;然后加葡萄糖或蔗糖10~20g和琼胶17~20g,加热使琼胶完全熔化后,趁热用纱布或脱脂棉过滤,或者用滤纸和保温漏斗过滤。而后分装试管,加棉花塞后灭菌。作平板培养的每管约10ml,作斜面培养的则每管约5ml。根据工作需要,还可以分装在三角瓶中灭菌。教师必须在实验前说明,高压灭菌器的用法和注意事项:(1)灭菌器中的水,应加水到指定的标度;(2)需要灭菌的器物放在灭菌器内,将盖密闭,打开气门;(3)加热,等空气完全排除后(蒸汽从气门有力地冲出),关闭气门;(4)当压力上升到所需要的指标后,开始计算灭菌的时间,灭菌过程中保持压力不变;(5)达到需要灭菌的时间,停止加热,稍微打开气门,排出蒸汽使压力慢慢下降;(6)当压力降到内外相等时,才能打开高压灭菌器的盖。肉汁冻培养基的方法:取3g牛肉浸膏,蛋白胨5~10g,琼胶17~20g,水1000ml,与马铃薯葡萄糖琼胶培养基的方法相同,这里不再赘述。

    3分离培养(1)超净工作台清毒与分离材料的选择。分离和培养应该在很清洁的条件下进行。打开超净工作台紫外灯灭菌30min,杀死空气中的微生物,关灯5~10min,再进行分离。(2)组织分离法分离真菌。病原真菌的分离一般都是用组织分离法[3],是林学、森保专业学生必须掌握的技术。要求学生从上述采集的标本中,选择新近发病的植株、器官或组织作为分离的材料,可以减少腐生菌的污染。腐生菌容易在生病很久而已经枯死或败坏的部分滋生,所以一般斑点病害应该从邻近健全的组织的部分分离。在超净工作台上,从病斑切取每边约5mm的小块病组织,用70的酒精浸几秒钟,再在0.1的酸性升汞水溶液中浸3~5min;而后用灭菌水换洗3次,将其移置在上述马铃薯葡萄糖琼胶培养基平板上培养。用蜡笔在培养皿上注明分离材料日期后送入25℃温箱反转培养皿培养;3~5d,在培养基上选择纯的菌落,移植到新的平面上或斜面上培养并纯化,并计算各分离真菌百分率。以优势菌群作为回接实验菌种。(3)平板划线分离法分离细菌。平板划线法[3]是分离细菌的常见方法,取小块病组织,经过表面消毒和灭菌水洗过2次以后,放在灭菌载玻片上的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎。静置一定时间,用灭菌的移植环蘸取以上组织液在肉汁冻培养基琼胶平板上划线培养;先在平板的一侧顺序划3~5条线,再将培养皿转60°,将移植环灭菌后,从第2条线末端,顺序划出3~5条线。也有其他划线的形式,如4分划线和放射划线等,目的都是使细菌分开形成分散的菌落,并计算各分离细菌百分率,以优势菌群作为回接实验菌种。

    4病原回接与再分离病害的种类很多,其传染方式也各不相同,因此要用相应的接种方法。种子、土壤、气流和昆虫等传染的病害,接种方法是不同的。因此,指导老师要求学生在进行试验前,对一种病害在自然条件下的传染方式和侵染途径有所了解。一般气流和雨水传播病害较普遍,可采用喷雾法进行。将上述真菌孢子(或菌丝)悬浮液喷洒在寄主表面,并用湿纱布保湿3d,病菌可以从气孔、伤口或表皮直接侵入。影响接种试验的因子包括病原物的致病性和致病力、接种植物的抗病性和感病性和发病的环境条件。在接种时,应尽量模仿接种菌在自然条件下,侵染寄主时的环境条件,特别要注意温度和湿度对接种发病的影响。学生在回接后,每隔2~3d观察病害发生情况并与自然状态比较,等出现显着症状后按上述方法能再次分离到用来回接的病原,否则实验失败。

    5病原鉴定与病因分析(1)病原真菌:以形态学特征[4]为主,结合分子生物学[5]鉴定种群。(2)病原细菌:形态、生理生化结合分子生物学[6]鉴定种群。实验要求学生根据优势菌群、回接试验情况与采样地环境状态分析发病因素,写出实验报告,并进行课程讨论。

    6创新实验设计小结本创新实验流程简单总结为:在采样及前处理基础上,完成“分离、接种、再分离”的技术规程。(1)分离:从病组织上分离病原物并进行纯培养;(2)接种:用纯培养物接种到相同的健康植物上,给予适宜发病条件,观察是否引起原来相同的病害;(3)再分离:从接种后发病的植物上,能分离到与用来接种的病原物。

土壤灭菌的方法范文第5篇

关键词 小叶女贞；幼苗移栽；繁育技术

中图分类号 S687.2 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2015）14-0159-02

小叶女贞（Ligustrum quihoui carr）为木犀科女贞属，常绿或半常绿灌木树种，别名小叶冬青、小叶水蜡等，该树种枝叶紧密，萌发力强，是机关、学校、医院、街道、公园及庭院作为绿蓠和各种造型的首选树种，也是制作盆景的理想树种。

根据多年的育苗实践，笔者探索总结出小叶女贞幼苗移栽繁育技术，与传统的苗圃直接播种育苗相比，具有省工、省时、省种子、易管理、密度合理、苗木生长均匀、病虫害少的优点，具体表现在以下几个方面：一是可以减少播种及幼苗期浇水、除草的管理次数，根据概算可节省浇水工时30～45个/hm2、除草工时60～90个/hm2，节约成本费用1.5万元/hm2左右；二是可节约种子600 kg/hm2左右，具有密度合理、苗木生产均匀、木质化早、苗木粗壮的效果，并可方便浇水与中耕除草；三是通风条件好，可以有效预防病虫害的发生。现将主要技术总结如下。

1 种子的采集、贮藏与处理

10月下旬至11月中旬，当果实呈紫黑色时即可采摘。贮藏的方法主要有以下几种：一是将采摘的果实去皮、洗净，晾干后装入袋中，放在通风阴凉的地方贮藏。二是果实去皮洗净后，将种子放入0.5%高锰酸钾溶液中灭菌消毒10～15 min，用清水冲洗干净后，将种子与细沙按1∶3的比例拌匀，直接进行沙藏，并经常保持细沙湿度在75%～85%之间，不可过湿或过干，次年3月中旬，40%的种子裂口露白后即可播种。三是将鲜果直接放入冷鲜库贮藏。为了提高种子出苗率和苗木出土时间及种子出苗整齐均匀，贮藏的种子在播种前要及时进行催芽处理，具体方法：3月初将干藏种子放入35～40 ℃温水中浸泡24 h后，捞去瘪种及杂质，把种子放入0.5%高锰酸钾溶液中灭菌消毒5～10 min，用清水冲净溶液后，放入袋中或萝筐中，萝筐上面用湿麻袋或布遮盖，每天用25 ℃左右温水冲洗2次，并随时翻动种子，有30%裂口露白后即可播种。贮藏在冷库的鲜果，在3月上旬去皮晾至半干去杂后，按照干藏种子的催芽方法进行催芽[1-2]。

2 幼苗畦的制作

选择地势平坦、不积水的地方制作成宽1.2～1.5 m、深30～35 cm的苗畦，在畦内铺细油沙20 cm，并施入复合肥750 g/hm2。在播种前5～7 d，用硫酸亚铁450 kg/hm2与水溶解成0.100%～0.125%溶液喷洒均匀，进行灭菌消毒，也可用0.125%多菌灵液，喷洒时要让药液渗透沙层，以达到充分灭菌消毒的效果[3]。

3 播种与管理

先将苗畦用水浇透，把催芽处理过的种子均匀撒播在苗畦内，播种量为80～90 g/m2，上面用细沙或细土覆盖0.5～1.0 cm，用塑料膜扣棚，并经常保持棚内苗畦土壤湿润。当苗木出齐至半木质化前，每隔7～10 d喷打1次0.1%多菌灵或甲基托布津溶液，连喷2～3次，预防苗木猝倒病发生。苗木长至5 cm以上，每隔15 d用0.2%磷酸二氢钾进行叶面施肥1次，连施2次，4月下旬至5月上旬可在阴天揭去拱棚，经常保持苗床土壤湿润，可出幼苗600株/m2左右。6月中旬即可将幼苗移植到大田苗圃地中进行培育，1 m2幼苗可移植大田面积约4.05 m2。

4 幼苗移栽

4.1 苗圃地选择

苗圃地要选择地势平坦、排灌方便、不积水、呈酸性至中性的砂壤土或黄壤土地块，深耕细耙，拣去石块、草根，施入磷肥1 125～1 500 kg/hm2，复合肥或尿素750 kg/hm2，并耙细耙平，做成宽120～150 cm的苗畦，畦间埂高10～15 cm，宽20 cm。

4.2 移栽

幼苗移栽要选择在阴天、下雨前太阳光不强时进行。起苗前1 d将苗床浇透水1次。幼苗起出后在用0.01%生根粉溶液与细土和成的稀泥浆中蘸根，或在0.01%生根粉溶液中浸根5～10 min，放入保鲜箱或竹筐及木箱内，上面用湿布遮盖，以免幼苗失水。为确保成活率，一次不要起苗太多，尽量做到随起随栽。

栽苗前，用竹片或薄木板做成宽3 cm、长25 cm匕首形状的栽苗工具，栽苗时插入土壤10 cm左右，以稍深于苗木根部为宜，稍用力来回扳动一下，取出后成为栽植穴，然后将苗木植入穴内，栽植深度稍深于原苗木根颈部即可。苗木植入后，再在苗木下方离苗木根部3～5 cm处插入土壤10 cm左右，用力往前将土壤与苗木挤紧，栽后立即浇水，每穴3株，行距20～25 cm，穴间距10 cm左右，可栽植苗木127.5万～150.0万株/hm2。栽后立即浇透水，有条件的可进行遮阴。

5 移栽后管理

苗木栽植后10 d内要经常保持苗圃土壤湿润，以利苗木生根成活，成活率可达95%以上。栽植20 d后，每15 d对叶面喷施1次0.25%磷酸二氢钾或尿素溶液，连喷2次。在进行叶面施肥时可交替喷施2次0.100%～0.125%多菌灵或甲基托布津溶液，预防苗木叶斑病等病虫害发生，并可根据时节与苗木长势情况，结合浇水、中耕除草或下雨，撒施磷酸二氢钾或尿素75.00～112.5 kg/hm2，撒施肥料后要及时用树棍或扫帚拨动苗木，使散落在苗木上的肥料落地，以免烧伤苗木。多雨季节苗圃地有积水时要及时排水。8月当苗木70 cm左右时，喷打1次多效唑，抑制苗木生长，促进苗木粗壮。9月后停止对苗木施肥，促进苗木木质化，提高苗木防冻能力。

6 参考文献

[1] 朱莉，李延成.小叶女贞在城市园林绿化中的应用[J].山东林业科技，2004（5）：59-60.

[2] 刘晓霞，舒健虹，吴佳海.小叶女贞扦插育苗技术研究[J].种子，2011（11）：87-88.