意识形态学习计划

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意识形态学习计划范文第1篇

【关键词】 细胞株

Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism

Abstract

This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P

Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation

氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通过增强宿主免疫功能及诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能够诱导U937细胞的分化［1］，国内未见报道。我们以NB4细胞为研究对象，通过形态、功能和表面分化抗原等多层次实验研究，了解bestatin是否能诱导NB4细胞分化及（或）对ATRA的诱导分化作用的增强效应，并初步探讨其可能的机理。

材料和方法

主要试剂

Bestatin、ATRA均购于Sigma公司。bestatin以无菌去离子水溶解为1 mg/ml，分装之后-20℃保存；ATRA以无水乙醇溶解成10-5 mol/L的储存液，4℃避光保存，使用时用RPMI 1640细胞培养液将其稀释为相应工作浓度。NBT为BBI公司产品，以PBS配成0.1%溶液，过滤除菌后4℃避光保存，使用前1周内配制。RPMI 1640为Gibco公司产品。胎牛血清为JRH公司产品。CD11b-FITC标记单克隆抗体为Teotech公司产品。CD13-PE标记单克隆抗体为Becton Dickinson公司产品。TRIzoL试剂为Gibco公司产品，M-MLV逆转录酶和Taq DNA合成酶为Promega公司产品。鼠抗人c-Myc单克隆抗体（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗体（I-19）均为Santa Cruz公司产品，使用时以TBST液分别按1∶500和1∶1 000稀释。ECL显色液为Santa Cruz公司产品。

细胞培养及药物处理

人APL细胞株NB4细胞（浙江大学肿瘤研究所惠赠）及人髓细胞白血病细胞株HL-60细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，2-3天传代1次。实验时取对数生长期的细胞，调整细胞密度为7×104/ml，以不同浓度ATRA和bestatin单独或联合处理，于不同时间收集细胞进行实验。

细胞形态学观察

取空白对照组及药物处理各组细胞悬液，离心，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，用光学显微镜（Leica，40×10）观察细胞形态。

四氮唑蓝（nitroblue-tetrazolium，NBT）还原实验

按文献［3］报道的方法进行。空白对照组及药物处理各组细胞与NBT共孵育后，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下（100×10）观察，胞浆内含有蓝黑色颗粒者为阳性细胞，随机计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。

细胞表面分化抗原CD11b和CD13的检测

取对数生长期HL-60细胞和NB4细胞或药物处理后各组NB4细胞离心，用PBS（pH 7.4）洗涤，调整细胞数为2×105/50 μl，加CD13-PE标记单克隆抗体8 μl或CD11b-FITC标记单克隆抗体5 μl，避光孵育30分钟，用PBS洗涤，上流式细胞仪检测。以Cellquest 1.2软件进行分析。

细胞总RNA提取和RT-PCR反应

总RNA提取 用TRIzoL一步法抽提细胞总RNA，按试剂说明书操作。甲醛变性凝胶电泳证实为完整RNA，紫外分光光度仪定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之间。

逆转录反应

样品总RNA 4 μg及随机引物0.5 μg，70℃ 5分钟，立即冰浴，离心。依次加5×逆转录酶缓冲液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制剂0.6 μl，DEPC水补至反应体积为25 μl，于27℃10分钟，37℃ 60分钟，72℃ 10分钟灭活逆转录酶，冰浴1分钟，结束反应。

PCR反应

PCR引物为上海Sangon公司合成。引物序列、反应条件及产物大小见表1。反应体系包括逆转录产物2 μl、10×PCR缓冲液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc与c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用灭菌去离子水补至终体积为25 μl。预实验确定产物与循环之间呈线性关系范围。取5 μl反应产物在15 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，电场强度5 V/cm，紫外灯下观察电泳结果，用凝胶成像系统（BIO-RAD公司）扫描分析条带灰度，以目的基因与β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）

Western blot

收集药物处理各组细胞（细胞数为2×106/ml），预冷的PBS漂洗2次，重悬于100 μl Lammiulis上样缓冲液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超声波裂解，于4℃离心13 000×g）15分钟，收集上清，蛋白样品保存于-80℃。按蛋白定量试剂盒（Bio-Rad公司）操作说明书进行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，转移后的硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉封闭1小时，分别与抗人c-Myc和抗人β-actin抗体及辣根过氧化酶标记的二抗孵育。ECL显色，显影于胶片。图像分析处理系统（Image Station 2000R）扫描，测定条带的面积和灰度，以二者之乘积进行半定量比较分析。

统计学分析处理

各项实验重复3次以上，以X±D表示，多组间比较F检验后采用方差分析及Tukey检验。相关分析采用Pearson相关。应用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。

结果

NB4细胞表面有CD13的表达

NB4细胞CD13阳性表达率为94.79%（平均荧光强度为1739.59），对照组HL-60细胞CD13阳性表达率为95.49%（平均荧光强度为3107.49）。两者的CD13平均荧光强度有一定的差异，但阳性百分率差异不明显。

Bestatin与ATRA联合处理后NB4细胞形态改变明显

100 μg/ml bestatin单独作用72小时后，NB4细胞形态无明显改变。10 nmol/L ATRA单独作用72小时后，NB4细胞呈现部分分化的形态，细胞核/浆比例减小，核变小有凹陷。100 μg/ml bestatin与10 nmol/L ATRA联合处理72小时后，NB4细胞形态分化更加明显，细胞浆内空泡增多，核凹陷、扭曲更加明显，形态似晚幼粒及杆状核粒细胞的细胞增多（图1）。

Bestatin与ATRA联合应用后NB4细胞NBT还原能力明显增加

以一定浓度（50、75和100 μg/ml）bestatin单独处理72小时后，NB4细胞的NBT还原能力无明显改变（与空白对照组相比较，P>0.05）；不同浓度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小时后，NB4细胞的NBT还原能力呈浓度依赖性增加，与空白对照组相比，差异明显。100 μg/ml bestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时后，NB4细胞的NBT阳性率明显地提高，与单用相应浓度ATRA组相比，差异显著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)

100 μg/ml bestatin单独处理细胞不同时间（48小时-96小时），NB4细胞的NBT还原能力改变不明显（与相应时间点空白对照组相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA处理细胞至72小时，开始出现NB4细胞NBT还原能力的增强，并呈时间依赖性，与相应时间点对照组相比，有明显差异；而10 nmol/L ATRA与100 μg/ml bestatin联合处理48小时，就出现NB4细胞NBT还原能力的明显增强，且此作用随时间延长而明显增强，与相应时间点单用10 nmol/L ATRA组相比，差异显著（图2）。

Bestatin与ATRA联合处理后NB4细胞CD11b表达明显增强

100 μg/ml bestatin单独处理72小时后，NB4细胞CD11b阳性表达率（MFI为13.4±0.6）稍有增加，但与对照组（MFI为12.3±0.9）相比，差异不显著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA单独处理72小时之后，NB4细胞CD11b阳性表达率（MFI为19.2±4.2）明显提高，与对照组相比，差异显著（P

Bestatin和ATRA单独及联合处理后NB4细胞c-EBPε mRNA表达的变化

NB4细胞低表达c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA处理12小时之后，NB4细胞c-EBPε mRNA表达水平明显提高，与对照组相比较，差异显著(P

Bestatin和ATRA单独及联合处理后NB4细胞c-myc表达的变化

NB4细胞c-myc mRNA呈高水平表达。10 nmol/L ATRA单独处理4小时后，NB4细胞c-myc mRNA表达下降，与空白对照组相比较，差异明显（P

Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).

NB4细胞c-Myc蛋白呈高表达。10 nmol/L ATRA单独处理8小时后，NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显下降（P

讨 论

ATRA对APL的有效治疗是白血病诱导分化治疗的成功典范。但单用ATRA治疗易复发及产生耐药，与其他化疗药物联用时疗效有一定的提高，但毒副反应增加。因此，寻找能够增强ATRA诱导分化作用而毒副反应轻的药物，成为临床治疗中的关注问题之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根据NBT还原实验结果提出，bestatin可能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用，但未做进一步的研究。本研究通过对细胞形态、功能和表面分化抗原等多层次的检测及分析对比，表明一定浓度范围的bestatin本身不能诱导NB4细胞分化，但确能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用。

Hirano等［7］认为，bestatin增强ATRA诱导分化作用可能与其抑制细胞表面CD13活性有关。本研究结果显示，与HL-60细胞相似，NB4细胞表面CD13阳性表达率高达94.79%，该药是否通过抑制CD13表达从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用，尚待进一步研究证实。髓系祖细胞定向分化受转录因子活性的调节。ATRA调节与髓细胞定向分化有关转录因子的表达诱导APL细胞向中性粒细胞分化。氨基肽酶N/CD13为Ⅱ型跨膜蛋白，胞内端只有8-10个氨基酸，但最近研究报道，CD13分子能够直接参与细胞内信号转导的过程［9］。因此，本研究从药物对转录因子影响的角度对氨肽酶、抑制剂bestatin增强ATRA诱导分化作用的可能机制进行了初步探索。c-EBPε为C-EBP家族转录因子之一，ATRA诱导NB4细胞向中性粒细胞方向分化时，药物作用2小时，c-EBPε mRNA表达水平即开始增高，并持续增高至细胞终末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制剂STI571增强ATRA诱导NB4细胞向中性粒细胞分化时，c-EBPε基因及蛋白的表达水平均未进一步增高［8］。本研究结果显示，10 nmol/L ATRA处理12小时后，NB4细胞c-EBPε mRNA表达水平明显上升，而100 μg/ml bestatin与ATRA联合处理NB4细胞时，c-EBPε mRNA表达却未进一步增强。这提示bestatin可能与STI571相似，其增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用可能不是通过调节c-EBPε表达。

原癌基因c-myc表达异常与髓细胞性白血病的发生有关，抑制c-myc表达可以促使白血病细胞分化及诱导细胞终末分化后的凋亡。本研究结果显示，10 nmol/L ATRA单独作用能够使NB4细胞c-myc的表达下调，这与文献报道相似［11］。同时，bestatin与ATRA联合应用时c-myc表达水平的下调作用较单用ATRA时更加明显，且药物联合应用各组细胞的c-myc蛋白表达水平与药物诱导的NBT还原能力之间呈明显的负相关。这提示bestatin可能通过与ATRA协同下调c-myc表达，从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在诱导HL-60细胞分化时，激活蛋白激酶C，引起c-myc表达下调［12］。bestatin是否也通过激活蛋白激酶C增强ATRA下调c-myc的表达，这有待进一步研究证实。

【参考文献】

1Murata M，Kubota Y，Tanaka T，et al. Effect of ubenimex on the proliferation and differentiation of U937 human histiocytic lymphoma cells. Leukemia，1994; 8: 2188-2193

2林茂芳，何静松，蔡真等. 氨肽酶抑制剂Bestatin 通过激活半胱天冬酶3诱导HL-60细胞凋亡. 中华血液学杂志，2001; 22: 348-350

3韩锐. 抗癌药物研究与实验技术. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997： 329-330

4Zhuang WJ，Fong CC，Cao J，et al. Involvement of NF-kappaB and c-myc signaling pathways in the apoptosis of HL-60 cells induced by alkaloids of Tripterygium hypoglaucum (levl.) Hutch. Phytomedicine，2004; 11: 295-302

5谭映霞，章圣辉，尹丽慧等. 三氧化二砷和全反式维甲酸联合用药诱导NB4细胞C／EBPε mRNA和CD11b表达的初步研究. 临床血液学杂志，2004; 17: 108-110

6林茂芳，俞静，严力行. 可溶性抗CD47单抗对人树突细胞分化与功能的影响. 中华血液学杂志，2004; 25: 709-712

7Hirano T，Kizaki M，Kato K，et al. Enhancement of sensitivity by bestatin of acute promyelocytic leukemia NB4 cells to all-trans retinoic acid. Leuk Res，2002; 26:1097-1103

8Gianni M，Kalac Y，Ponzanelli I，et al. Tyrosine kinase inhibitor STI571 potentiates the pharmacologic activity of retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells: effects on the degradation of RAR alpha and PML-RAR alpha. Blood，2001; 97: 3234-3243

9Santos AN，Langner J，Herrmann M，et al. Aminopeptidase N/CD13 is directly linked to signal transduction pathways in monocytes. Cell Immunol，2000; 201: 22-32

10Morosetti R，Park DJ，Chumakov AM，et al. A novel，myeloid transcription factor，C/EBP epsilon，is upregulated during granulocytic，but not monocytic，differentiation. Blood，1997; 90: 2591-2600