前言:想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗?我们特意为您整理了5篇细胞生物学的任务范文,相信会为您的写作带来帮助,发现更多的写作思路和灵感。
1.1主要试剂及动物细胞培养液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重组表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF-2)均购于GIBCO公司。含绿色荧光蛋白GFP的慢病毒载体表达质粒(pGC-FU)购于GENECHEM公司,pORF-hIL-12G2质粒购于InvivoGen公司,胰酶、DEPC、Tris碱、EDTA均购于Sigma公司,抗人CD133/PE抗体及抗人CD44/APC抗体购于BDPharmingen公司,BCA蛋白定量试剂盒购于ThermoFisherScientific,实验用6-8W龄雌性裸鼠由第三军医大学实验动物中心提供,由该中心负责饲养和管理。
1.2培养、分离、鉴定结肠癌CSCs结肠癌SW480细胞株购于ATCC,在干细胞条件培养基中(不含胎牛血清的DMEM/F12培养基,含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF-2、1×B27和1%青链霉素)中筛选培养2周后,流式细胞仪分选出CD133+/CD44+SW480细胞作为结肠CSCs,分析其自我更新及分化。分选出的CSCs用干细胞培养基培养于37°C、5%CO2孵箱中,细胞增殖实验、克隆形成能力、成球能力及NOD/SCID体内成瘤能力鉴定其“干性”特征[8]。
1.3构建IL-12过表达慢病毒模型及转染CD133+/CD44+SW480细胞PCR扩增含IL-12p70基因片段的pORF-hIL-12G2质粒获得IL-12基因,通过酶切及连接构建重组IL-12/慢病毒质粒,取阳性克隆摇菌后行PCR鉴定,酶切鉴定及测序。鉴定正确的克隆摇菌扩大培养,用除内毒素大提试剂盒提取质粒DNA,293T细胞包装病毒,IL-12/慢病毒颗粒感染CD133+/CD44+SW480细胞,稳定转染的细胞称为“慢病毒/IL-12细胞”[8]。
1.4IL-12对结肠CSCs生物学特性的影响1.4.1IL-12对结肠CSCs分化的影响(SP免疫组化试剂盒检测CK20)为了观察IL-12对结肠CSCs的体外分化能力的影响,我们取转染IL-12过表达慢病毒质粒的细胞及未转染的CD133+/CD44+SW480在条件培养基中形成的克隆细胞球,移入含10%胎牛血清培养基中连续观察其生长情况,对两组细胞进行免疫组化染色,显微镜观察后照相。结果判断:被测细胞胞浆染色黄-棕色为阳性表达。
1.4.2IL-12对结肠CSCs克隆形成能力的影响将转染IL-12过表达慢病毒质粒及未转染的CD133+/CD44+SW480细胞计数后,调整细胞浓度。各取10000个两组细胞分别接种6孔板中,加入适量条件培养基,5%CO2,37°C培养。每隔1天半量换液1次。显微镜下观察细胞生长情况,7d后终止培养。
1.4.3IL-12对结肠CSCs侵袭性的影响实验分组:慢病毒/IL-12转染组;空载体转染组;未转染组(即空白对照)。使用前水化Matrigel基质胶,然后基质胶包被Transwell小室,置于37°C,5%CO2细胞培养箱中孵育。薯蓣皂甙元处理后24h接种细胞,1×104/ml细胞分别接种基质胶包被的小室,无血清培养基培养的细胞加入上层小室,含10%胎牛血清的完全培养基培养的细胞加入下层小室,将小室置于无菌24孔板中,加入250μl培养基。下室加入500μl培养基,5%CO2,37°C静置培养48h。取出小室,PBS轻轻淋洗,用棉头拭子小心移走膜上层的细胞,95%乙醇侵入到膜下层的细胞40min。PBS淋洗3次,苏木素染色。倒置显微镜(×200)下计数微孔膜下层的细胞,每孔随机选择5个视野,计数每个视野细胞数目,每个实验重复3次。14.4IL-12对结肠CSCs体内肿瘤形成能力的影响动物实验遵循第三军医大学临床学院伦理要求(批准号ID,SCXK(军队)2007015)。6-8周雌性NOD/SCID小鼠培养于无菌环境中,慢病毒感染后48h,NOD/SCID小鼠(n=15)皮下注射慢病毒/IL-12细胞5×103,或空载体转染的结肠CSCs5×103。接种后观察小鼠毛色、食欲、大小便等基本生命状况,30d后评估肿瘤形成。试验结束后切取肿瘤组织,称重并作相应检测,游标卡尺测肿瘤长短径,肿瘤体积=长×宽2。
1.5IL-12抑制CD133+CD44+SW480细胞生存机制研究
1.5.1Westernblot检测结肠CSCs转染前后STAT6、p-STAT6、survivin、IL-12和IL-4蛋白表达蛋白抽提试剂盒-II提取细胞上清液总蛋白,浓缩上清至原体积的1/30~1/10,蛋白样品按照1:4的比例加入5×上样缓冲溶液,100℃变性5min,分装。BCA法测蛋白浓度,酶标仪测定550nm处吸光度值。绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品浓度。SDS-PAGE垂直电泳,200mA恒定电流转膜80~90min。抗原-抗体反应及化学发光法显色,BIO-RAD凝胶成像分析系统扫描及图像分析,相对灰度值表示蛋白相对含量。
1.5.2IL-12对结肠CSCs凋亡的影响收集转染后各组细胞,PBS洗2次,1000r/min,离心5min,弃上清。用不含EDTA的消化液消化贴壁细胞。收集的各组细胞加入500μl结合缓冲液中重悬细胞,再加入适量AnnexinV-FITC和PI,同时设置阴性对照和补偿对照(分别单染),室温避光孵育20min。1000r/min,离心5min,弃上清,加入500μl结合缓冲液重悬细胞,流式细胞仪测定每个样本中凋亡细胞所占百分比,每个实验重复3次。肿瘤抑制率=对照组瘤重-治疗组瘤重/对照组瘤重×100%。1.6统计学方法计量资料数据以x±s表示,两组间比较采用t检验,使用SPSS13.0软件进行统计。
2结果
2.1慢病毒-IL-12质粒构建及在CD133+/CD44+SW480细胞中表达前期结果证实慢病毒-IL-12表达质粒构建成功,慢病毒/IL-12细胞上清液高表达IL-12mRNA和蛋白[7],为我们进一步探究IL-12体内作用及机制打下基础。
2.2结肠CSCs过表达IL-12对肿瘤球形成能力、侵袭性及分化的影响将CSCs悬浮于无血清的干细胞培养液中,肿瘤球形成后光学显微镜观察肿瘤球数量,结果显示IL-12降低了结肠CSCs肿瘤球形成能力,转染慢病毒-IL-12的CSCs不能形成明显的肿瘤球(图1A)。但使用IL-12抗体阻断后能恢复肿瘤球形成(图1B)。空载体转染的SW480CSCs形成的肿瘤球更大更紧密(图1C),但正常结肠细胞WM35不能形成肿瘤球(图1D)。另一方面,与对照组相比(图2B),IL-12增加CSCs分化标志CK20表达(图2A)。与SW480CSCs相比,慢病毒/IL-12转染CSCs的侵袭性降低40%(表1)。
2.3IL-12抑制NOD/SCID小鼠原发肿瘤生长研究发现慢病毒/IL-12减缓了CSCs肿瘤生长。慢病毒/IL-12转染的CSCs形成的肿瘤体积显著低于对照组[(189±21)vs(1785±32)mm3,P<0.05],质量显著轻于对照组(P<0.01)。
2.4IL-12减缓结肠CSCs增殖,促使其凋亡IL-12转染也影响细胞凋亡及增殖。流式细胞分析显示,慢病毒/IL-12形成的肿瘤细胞周期发生改变,G1期细胞增加[(68.8±3.6)%vs(52.4±2.8%)],而S期细胞降低[(22.6±2.8)%vs(38.6±4.1%)](图5A),与对照组相比,凋亡细胞数量明显增加[(45.2±5.6%vs(4.1±1.2%)](图6B)。
2.5结肠CSCs表达IL-4和STAT6,IL-12抑制IL-4/STAT6信号途径Westernblot结果显示,CSCs表达IL-4升高,表明CSCs内存在IL-4自分泌信号。值得注意的是,CSCs内STAT6被激活。慢病毒/IL-12降低IL-4/STAT6及survivin产生(图4)。
3讨论
结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,随着人们生活水平提高,饮食结构改变,其发病率有增加趋势,尤其在发达国家及发展中国家。直至目前,结肠癌主要的治疗手段仍是手术切除,且手术较其他治疗效果更佳,尤其是早期肿瘤,但肿瘤转移及复发仍是晚期患者治疗失败的主要原因。最近研究表明,CSCs能够始发免疫缺陷小鼠肿瘤生长[1-2],并与肿瘤转移及复发相关。从理论上讲,靶向CSCs治疗能够彻底消除肿瘤复发及转移,因此靶向CSCs的肿瘤治疗策略将比目前的传统治疗方法更有效的根治肿瘤,减少复发和转移的发生率,为肿瘤的靶向诊治提供了新靶标,为根治肿瘤带来了新希望[14]。免疫抑制仍是多数预期较好的肿瘤治疗手段的主要障碍,而细胞因子失衡是机体免疫功能紊乱的主要原因,并导致肿瘤进展及复发[15]。关于细胞因子的抗瘤免疫反应相关研究包括IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等,已有研究表明,IL-12能有效地增多种肿瘤的抗瘤免疫反应,但IL-12对CSCs生存及侵袭性的作用并不清楚。本研究报道IL-12低水平表达/不表达与结肠癌进展的相关性,证实IL-12对直接限制CSCs恶性表型的潜在益处。本研究中,我们成功构建含IL-12cDNA的重组慢病毒质粒,用包装病毒的工具细胞293T细胞包装纯化后,获得较高滴度的病毒颗粒,将其转染CD133+/CD44+SW480细胞,慢病毒/IL-12细胞高表达IL-12mRNA及蛋白,说明稳定转染IL-12的结肠CSCs系建立,同时也证明慢病毒作为基因研究的载体具有低毒、高效的优势。结果表明,IL-12损害干性维持部分是因为抑制CSCs增殖;而且,IL-12降低分化标志CK20表达,证实IL-12介导促进分化的信号通路;与SW480细胞相比,慢病毒/IL-12细胞的侵袭性降低了约40%,表明IL-12显著抑制CSCs侵袭性。
[关键词]RGD;人牙周膜细胞;黏附;增殖;碱性磷酸酶
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2013)01-0054-03
The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell
BI Ying-chun,HE Yu-hong,XI Lan-lan
(Department of Stomatology,General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese,Jinan 250031,Shandong,China)
Abstract: Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine (RGDS) peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells(PDL) so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion,extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25~100mg/L(P
Key words:arginlie-glycine-aspartic;human periodontal ligament (PDL) cells; adhesion; proliferation; alkaline phosphatase
精氨酸 -甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)三肽是多种细胞跨膜蛋白整合素的特异性配体,许多黏附蛋白所共有的细胞间及细胞-细胞外基质识别的最小序列,这一序列在介导细胞黏附、迁徙和生长方面起重要作用。牙周膜细胞在牙根面上的附着和增殖是牙周组织新附着的关键,本实验目的是观察离体细胞培养条件下,外源性RGDS对牙周膜细胞的影响,为进一步的临床研究工作提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料:RGDS(Sigma), 96孔培养板(Coster), DMEM培养液和胰蛋白酶(Gibco),胎牛血清(FCS杭州四季青生物工程研究所), 酶联免疫检测仪(DG3022A), 牛血清白蛋白(BSA,博士德公司),噻唑盐(MTT Sigma),ALP试剂盒,倒置显微镜(Olympus,Japan)。
1.2 人PDL的体外培养:取13~17岁因正畸需要拔除的新鲜前磨牙,随即在无菌条件下用PBS缓冲液(含青、链霉素各1000U/ml)浸泡5~10min,并冲洗2次,除去血液,刮取牙根中1/3的牙周膜组织,剪成1mm3碎块,均匀铺于培养瓶底,瓶底向上,加入适量含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液,在饱和湿度、50ml/LCO2、950ml/L空气、37℃标准环境下孵育2h,翻转,培养至长出牙周膜细胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法进行传代,用免疫组化SABC法进行角蛋白和波形丝蛋白染色,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证明为中胚层组织来源。取第4代细胞用于实验。
1.3 PDL细胞黏附性的测试--固相结合分析[1]:将RGDS溶于PBS液,分别制成100mg/L,50mg/L, 25mg/L,12.5mg/L4种浓度,每浓度为一实验组。将各浓度组按每孔50μl包被96孔板,每种浓度4孔,阴性对照为10g/L BSA。将96孔板置于4℃,过夜。用PBS液洗96孔板各孔2次,加10g/L BSA,37℃封闭1h,PBS再洗2次。取第4代人PDL细胞,2.5g/L胰酶消化,离心,收集细胞,用不含血清的DMEM培养液吹悬细胞,形成5×108/L的细胞悬液,以每孔100μl接种于96孔板,37℃,50ml/LCO2条件下培养120min。取出培养板,PBS洗2次以去除未贴壁的细胞,2.5g/L胰酶消化,离心,将细胞悬浮于200μl无血清DMEM,血球计数板进行细胞计数,计算细胞总量。
1.4 PDL细胞伸展性的测试:实验分组及96孔板的包被与实验方法1.3相同,用无血清DMEM调整细胞浓度至107/L,每孔接种100μl, 标准环境下孵育120min,倒置显微镜下观察各孔并照相。计数伸展细胞(即至少有一个胞浆突起的细胞)数和未伸展细胞数,每组至少计数100个细胞,计算伸展细胞的百分率。
1.5 RGDS对PDL细胞增殖的影响:实验分组及96孔板的包被与实验方法1.3相同,用无血清DMEM调整细胞浓度至107/L,每孔100μl接种于96孔板,10ml/LDMEM培养24h后,PBS 洗去未黏附细胞,重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl,将96孔板置37℃、50ml/LCO2条件下继续培养5天后,MTT法测不同浓度RDGS对PDL细胞的影响。
1.6 RGDS对PDL细胞碱性磷酸酶(ALP)的影响:将PDL细胞按1.5的方法培养5天后, PBS洗3次,每孔加1ml/L TritonX-100 50μl,4℃过夜。次日每孔加碱性磷酸酶抗体100μl,37℃、50ml/LCO2孵育30min,加0.2mol/LNaOH 50μl终止反应。酶联免疫检测仪410nm检测A值。
1.7 数据分析:运用统计学软件SPSS10.0进行组间t检验, P
2 结果
2.1 RGDS对PDL细胞黏附性和伸展性的影响:如表1所示,随着RGDS浓度增加,其促进PDL细胞的黏附率的作用逐渐增强,当浓度为12.5mg/L时,与对照组相比较,既有促进细胞黏附作用(P
细胞伸展性实验也说明,在RGDS浓度为12.5mg/L时,即有促进细胞伸展功能(P
2.2 RGDS对PDL细胞增殖和ALP的影响:RGDS在50~100mg/L可明显促进细胞增殖,浓度在25~100mg/L明显提高HPDL细胞的ALP的活性。见表2。
3 讨论
本实验运用固相结合分析技术,将RGDS固定于96孔板上,为排除血清中某些因素对实验结果的影响,在黏附和伸展实验中采用无血清的DMEM,在增殖和ALP活性检测时,因培养时间较长(5天),采用细胞能耐受的1%胎牛血清浓度。实验结果显示:在浓度为25mg/L可显著促进PDL细胞的黏附、伸展,而较高浓度的促进作用却不明显,可能在此浓度时细胞膜上受置已饱和,再增加RGDS并不能使黏附率明显上升。而细胞伸展性也显示,当RGDS浓度达到25mg/L时,细胞在2h的伸展率达到了50%以上,倒置显微镜下可见经RGDS处理过的细胞胞体呈梭行或多角性,既细胞有一个以上的突起,呈现良好的伸展状态。而未经RGDS处理的对照组细胞形态呈圆形,无突起或仅有少量突起,细胞伸展状态不佳。
精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)是细胞外基质中许多黏附蛋白所共同含有的一个三肽序列,它是黏附蛋白与细胞表面特异受体蛋白相互作用的识别位点。这些细胞表面膜蛋白被称为整合素(integrin)。整合素家族的分子都是由α、β两条链由非共价键连接组成的异源双体,为一跨膜结构,一端连接细胞内的骨架系统,另一端通过RGD识别位点与细胞外基质连接,形成配体-整合素-细胞骨架跨膜信息系统,从而将细胞外基质和细胞骨架连接起来,引起细胞内一系列生化改变:如:酪氨酸磷酸化、胞浆碱化、钙离子浓度提高、大量磷脂代谢产物产生等,进而影响多种组织细胞功能调控,包括胚胎发育、细胞的伸展、移动、生长、分化、血栓形成、创伤修复、肿瘤转移等一系列重要生理病理过程[2-3]。1984年,Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用实验证实RGDS是纤维连接蛋白与其受体的特异性结合位点,可促进鼠肾成纤维细胞在生物材料表面的黏附,从此对于RGD配体与受体相互作用机制的研究引起了人们的广泛关注。许多学者[5]研究了RGD与生物材料的不同结合对细胞在粘附、增殖、迁徙等方面的影响,显示RGD与材料表面的稳定的连接是促进细胞粘附、增殖的关键。
ALP是参与骨等硬组织形成﹑代谢﹑再生的重要调节物质,它通过水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸盐,能去除钙化抑制物,提供能量,促进钙化[6]。同时ALP也是细胞分化活跃和具有成骨能力的标志之一[7]。而牙周膜细胞具骨母样细胞特性,ALP也是牙周膜细胞分化和向成骨样细胞转化的先决条件。本实验中,RGDS在浓度25mg/L即可提高牙周膜细胞ALP水平,这可能是RGDS通过激活整合素受体蛋白,引起胞内细胞骨架改变,从而促进细胞贴壁、伸展,进而促进细胞增殖,使其分化提前,因此ALP水平的提高极可能是由于牙周膜细胞数量增加引起,但无论什么原因,RGDS这种促增殖与分化的作用在牙周组织修复过程中具有重要意义。
牙周组织再生的一个中心环节是牙槽骨和牙骨质的重建及功能性牙周膜的完全再生,即形成牙周新附着,而PDL细胞作为具有异质性的多能干细胞,其在根面上的黏附、生长、分化是形成新附着的关键。本实验结果证实RGDS可有效促进PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有学者将含有RGD的七肽固定于I型胶原材料,PDL粘附率明显提高[8]。因而如果将RGD应用于引导牙周组织再生的过程中,则有可能促进PDL细胞在根面上黏附、伸展,激活PDL细胞成骨功能,促进牙周组织再生,这对体内应用RGDS促进牙周新附着的形成有一定的指导意义。
[参考文献]
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[2]Hynes RO.Integrins:versatility,modulation,and signaling in cell adhesion[J].Cell,1992 Apr 3,69(1):11-25.
[3]Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. [J].J Science,1995,268:233-238.
[4]Pierschbacher M D,Ruolslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule[J].Nature,1984,309:30-33.
[5]Hersel U,Dahmen C,Kessler H.RGD modified polymers:biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond[J]. Biomaterials,2003,24(24):4385-4415.
[6]Quarles LD,Yohay DA,Lever LW,et al.Distinct proliferative and bydifferentiated stages of murine MC3T3-E1 cell in culture:an in vitro model of osteoblast development[J]. J Bone Miner Res,1992,7(6):683-687.
一、精选教材
教材是课程知识内容的载体,是进行教学活动的基本材料之一[2,3]。如何选择和使用教材对教学任务的实施、完成和对教学质量的影响至关重要。通过对相关院校的走访、大量资料的查阅以及结合本校水产养殖学科的专业特点、课程学时数以及授课对象,最终确定以翟中和等主编的《细胞生物学》为教学用教材,并及时跟进该书的新版本。在应用该教材的同时,特别注重其他教科书的参考和补充,如将王金发编著的《细胞生物学》、王堃仁等主编的《细胞生物学》、郑国锠等主编的《细胞生物学》、Alberts主编的《Molecular Biology of the Cell》等作为本课程的参考教科书。此外,教师在备课过程中还注重寻求教科书之外的教学资源,如国内外重要学术期刊、国内外知名大学《细胞生物学》课程网站,特别是国外互联网站上与细胞生物学知识相关的网络资源。教学中将教材、参考教科书以及教科书之外的教学资源相互补充和凝练,力求教学内容的系统性和前瞻性。
二、教学内容的遴选
《生物化学》、《遗传学》、《细胞生物学》和《生理学》等是水产学院重要的学科基础课。这些课程在内容上联系极为密切,相互交叉和渗透。在《细胞生物学》课程的教学中,既要避免本课程与其他课程内容的过度重复又要保证授课内容的完整性、体现细胞生物学的核心内容。根据水产学院的教学安排以及授课学生的实际情况,在《细胞生物学》理论课教学中对所用教材的内容进行遴选,合理取舍与合并,最终形成十章作为本校水产养殖学科《细胞生物学》理论课教学内容,即:“绪论”、“细胞的基本知识”、“细胞生物学的主要研究方法”、“细胞表面”、“细胞基质和内膜系统”、“线粒体”、“细胞骨架”、“细胞核与染色体”、“细胞周期和细胞的分裂与分化”和“细胞的衰老与凋亡”。《细胞生物学》理论课的教学内容遴选后,授课中以细胞的结构和功能为主线,从显微、亚显微和分子水平阐述细胞结构,特别是结构与功能的相关性,认识细胞重要生命活动的基本内容和本质,掌握细胞生物学的基本概念和基础理论,在《生物化学》、《遗传学》和《生理学》课程学习的基础之上,通过《细胞生物学》的教学,使学生的知识体系更加系统化、深入化。
三、调整与优化教学内容,因材施教,提高教学效果
由于课堂教学仍然是在校学生获取知识的主要形式[4],因此教学内容确定后,教师要梳理每一章的教学内容,清晰讲授的重点和应达到的具体教学目的。首先,教师要意识到第一次课的重要性,它对激发学生的学习兴趣有着重要的作用。与其他课程一样,课程的讲授内容通常以绪论开篇。但是,不仅许多学生不重视绪论的内容,教师也容易出现缺乏对绪论讲授的激情[5]。教学中我们将教材[1]中绪论的内容重排、调整与优化,收到了较好的教学效果。授课中将细胞生物学的发展简史作为最先讲授的内容,并结合一些与之相关的逸闻趣事,激发学生对该门课程学习的兴趣,使学生在轻松的氛围中了解学科的诞生、认识学科的发展与实验仪器和技术进步的关系;通过介绍“细胞学说”的建立,不仅使学生掌握了该学说的基本原理,还使学生意识到善于点滴积累以及归纳和总结对学习和工作的重要性,通过上述学习学生们也弄清了细胞生物学最基本的研究内容。之后再介绍当今细胞生物学的主要研究内容和研究热点,并将教材目录与绪论的内容相联系,这样不仅使细胞生物学的研究内容深记于学生的脑海中,也便于他们对本课程后续内容的学习和提高学习的信心。其次,授课内容的顺序编排要便于学生与已掌握的有关知识相衔接。根据授课对象的实际情况,教学中按着细胞的组织结构从外向内,即:细胞表面→细胞质→细胞核的顺序,并将结构或功能上联系极为密切的细胞结构的知识放在一起讲授。以本课程的“细胞表面”与“细胞基质和内膜系统”两章为例,对教材以及相关的教科书中的有关内容做了较大的调整,重新编排与优化。授课时“细胞表面”一章,首先介绍细胞表面的结构组成(质膜、细胞外基质和细胞外被、细胞表面的特化结构细胞连接),各结构的特点、功能以及这些结构的相互关系;通过这样的讲授使学生清楚地知道多细胞生物中虽然所有的细胞都具有“质膜”这样一个界膜,它是细胞表面核心结构,但多细胞生物不仅由细胞构成,细胞外还有细胞外基质,同时没有一个细胞是孤立的,细胞与细胞或与细胞外基质形成特定的组织连接结构,从而使多细胞生物成为一个和谐的统一体。之后再详尽地介绍细胞表面核心结构——质膜的物质的运输和信号转导功能,通过这部分的学习又使学生对膜的不对称性和流动性有了更好的理解。此外,由于核糖体与内质网在功能上的关系极为密切,因此将核糖体并入内膜系统中介绍,形成本课程的“细胞基质和内膜系统”一章。授课中首先讲解非膜性细胞器——核糖体在细胞中的分布、化学组成和结构以及功能,之后介绍内膜系统中的内质网、高尔基体和溶酶体的超微结构与功能,但内质网和高尔基体的蛋白质加工功能与蛋白质的分拣形成本章独立的一节,即“蛋白质的分拣与加工”,内容包含信号假说、蛋白质的修饰与加工、蛋白质的分拣和膜泡运输,此节为本章的教学重点之一。介绍信号假说时,由于有了核糖体的知识基础,再结合具体的研究成果,学生则很容易理解分泌性蛋白的合成在细胞基质中起始、肽链延伸暂停、向内质网膜转移等信号假说的具体内容;通过本节其他知识内容的学习,清晰了蛋白质的修饰加工可发生在肽链的合成以及运输过程中,因此构成了蛋白质合成、加工与运输的完整体系。此外,将溶酶体的发生也独立成节,放在“蛋白质的加工与分拣”一节之后,以溶酶体酶的M6P分拣途径为例,将信号假说、蛋白质的加工与分拣以及膜泡运输的部分内容串联起来。通过上述讲授内容的遴选、调整与优化,也使学生对结构、功能、发生上相互关联的内膜系统的理解更加透彻。再次,根据教学时数适当安排自学与课后讨论的教学内容,培养学生自主和探究学习的能力。如“细胞生物学的主要研究方法”一章,不可能在有限的学时内将该部分内容讲透彻,因此该部分内容以学生自学、课下参观相关的仪器设备及与教师交流讨论的形式实现学生对该部分知识的获取;此外根据授课专业特点,叶绿体的知识也以学生自学和课下与老师交流的方式进行。最后,注重讲授内容与其他课程内容上既不过度重复又要较好地衔接。如在讲授质膜的功能——钠钾泵的知识时注意与《生理学》膜电位的知识相联系、细胞骨架中微丝的功能时注重与《生理学》以及《组织胚胎学》肌肉收缩内容的衔接,线粒体功能的讲解则考虑与《生物化学》的内容不过度重复和较好的衔接,而细胞核与染色体的知识需要考虑学生在《遗传学》课程上已掌握的知识。由于本课程的开设在上述几门课程之后,这就要求我们与上述课程的任课教师以及授课学生良好的沟通,适当调整本课程的授课内容与重点,从而使学生通过《细胞生物学》课程的学习,使他们知识体系更加系统化、深入化。
由于细胞生物学的知识面广、信息量大、发展快,因此教学内容的改革是教学改革最重要的部分。结合我校水产养殖学科的专业特点和授课对象的实际情况,对《细胞生物学》理论课的教学内容进行遴选、调整重排与优化,并且应用于《细胞生物学》的教学中,提高了教学效果。此外,通过多年的教学实践我们深深地体会到,完成好教学内容,教师尤其要注重自身知识理论水平的提高,不断地丰富教学内容,才能不断提高教学效果与教学质量。
参考文献:
[1]张晶,华子春.细胞生物学课程体系优化的实践与思考[J].中国细胞生物学学报,2011,33(6):716-719.
细胞生物学是以细胞为研究对象,从整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次,以动态的观点,研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的生活史和各种生命活动规律的学科。它作为生命科学的四大前沿学科之一,与分子生物学、神经生物学和生态学并列[1],是学习分子生物学和遗传学的基础。随着该学科新技术和新方法的建立,细胞生物学已成为各大高校医学、农学和生物学等专业的一门必修课[2],反应出细胞生物学在未来生命科学领域的重要性。自从我校生命科学院成立以来,细胞生物学就是生物科学、生物技术专业的学科基础、必修课和主干课,是学生在我校的医学大背景下理解疾病形成中的遗传和分子生物学过程的基础, 是理解包括分子靶向、干细胞疗法等新颖的转化医学手段的基础,其学科地位不可替代。
二 细胞生物学教学中存在的问题
随着先进生命科学“大数据”时代的到来,无论是基础理论还是应用技术研究,细胞生物学都处于生命科学最活跃的领域,知识更新快、内容丰富且深奥难懂。我院生物技术专业的本科学生多为专业调剂,初高中生物学基础知识欠扎实,学科兴趣不足,学生自主学习的能力较弱。如果教学只按图索骥照本宣科,根本无法调动他们学习的积极性。另外,课本知识过于陈旧,无法适应新时代学科发展的需要。尽管近些年部分教师已开始引导学生通过查阅文献、综述总结的方法接触细胞生物学领域最前沿的知识,但大多止步于盲目填鸭式罗列国外文献数据,没有加以甄别和指导,学生很容易在复杂的信息和数据中丧失学习的信心。
因此,如何使细胞生物学教学紧跟学科发展的步伐,使学生在有限的学时中既能具备扎实的细胞生物学基础知识和基本技能,又使学生及时掌握最新的细胞生物学理论和应用技术,能为他们将来的考研深造学习阶段和日益剧烈的职场竞争中打下良好的基础,这成为生物技术专业本科生细胞生物学教学中待解决的问题。仅靠教师讲授为主的传统教学方法和教学模式已不适应目前学科的发展和人才培养的需求,难以提高教学质量。
三 以问题为导向的教学方法( PBL)的优势
1969年美国的神经病学教授Barrows在加拿大的麦克马斯特大学首创了一种以问题为导向的教学方法——PBL(Problem-Based learning)教学法[3],它倡导让学生通过自学、分析、讨论和合作解决问题,从而培养学生自主学习能力,发展学生综合思考能力。这种以问题为基础,以学生为主体,以教师为导向的启发式教育,以培养学生的能力为教学目标的教学方法与传统的教学方法相比有诸多优势。
1 突出学生的主体地位
PBL教学法强调以学生的主动学习为主,而不是传统教学中的以教师讲授为主;通过设计真实性任务,强调把学习融入到复杂的、有意义的问题情景中,通过学习者的自主探究和合作来解决问题,从而学习隐含在问题背后的科学知识,培养解决问题的技能和自主学习的能力[4,5]。
2 提高学生对细胞生物学的学习兴趣
细胞生物学基础知识内容较多且大部分深奥难懂,传统教学模式主要通过教师制作丰富的多媒体课件将知识灌输给学生,起初能够激起学生兴趣,但随着知识的不断深入,学生就会感觉枯燥无味,学习的积极性大大降低。而PBL教学可通过设计与日常生活息息相关的医学实践问题,使学生充分认识自己的主人翁意识,主动运用细胞生物学知识解决这些问题。这种“提出问题——解决问题——归纳总结”的教学方法不但使学生巩固了先前学过的知识,而且激发了他们主动学习新知识的动力。
3 拓宽了学生的知识面
PBL教学中,为了解决教师提出的问题,学生必须查阅相关文献和收集材料。在这个过程中,学生不仅可以掌握本课程重点内容,而且可以了解相关领域的热点以及前沿进展,拓宽了学生的知识面,有利于知识的理解和融会贯通。
4 培养了学生团队协作意识
PBL教学中需要小组成员分工查阅、收集和整理材料,一起合作讨论、总结、制作多媒体课件,最后安排一人进行陈述。通过此过程让学生意识到团队协作的重要性,增强团队意识。经过多轮合作还有利于各位成员挖掘自己的潜力、发挥各自特长、树立自信。
5 增强了教师自身素质
PBL教学过程中,教师虽然不再是主体,但导向作用不容忽视。首先在“提出问题”阶段,教师要根据本堂课应该教授的基本知识,结合该领域前沿热点,设计出合理的案例,使学生通过解决此案例,既掌握了课本知识又了解了很多相关领域的前沿进展;其次在学生“解决问题”阶段,还需要尽可能回答学生提出的问题引导学生向正确的方向查阅资料;最后在“归纳总结”部分,教师还需要运用丰富的知识对遗留问题进行解释,并对整个讨论结果进行总结。这就要求教师不仅熟练地掌握本学科及相关学科的知识,而且要深入广泛了解相关领域前沿进展,对知识具有融会贯通、灵活运用的能力。在此过程中使得教师拓宽知识面,增加知识储备,完善知识结构,促进教与学的互动,真正做到教学相长。
四 PBL在生物技术专业本科生细胞生物学教学中的具体实施方法
为了能够在我院生物技术专业本科生细胞生物学教学中顺利开展PBL教学,并取得良好效果,在开课前,授课教师参加了2012年上海复旦大学举办的PBL教学培训,掌握了相关教学技能。在充分调查了我院生物技术专业本科生知识结构及对细胞生物学知识的掌握情况后,我们制定了如下实施方案。
1 实施对象
浙江中医药大学生命科学学院2011级生物技术专业1个班的学生。
2 教学内容的选择
我院生物技术专业属于三本专业,学生又大多为专业调剂,初高中生物学基础较弱。因此,在教学过程中,细胞生物学基础知识部分如各种细胞器的结构和功能、细胞膜系统以及细胞骨架等可采用教师多媒体教授的传统教学方法;而本学科的难点以及前沿问题,如细胞的信号转导、细胞的增殖与周期、细胞分化、细胞凋亡与自噬、DNA的损伤与修复以及基因表达调控等则采用PBL教学,以问题为基础,通过收集资料、论证、实施以及总结归纳,使学生切实感受到细胞生物学与人类日常生活间的联系。进而通过自主学习,提高学生自信心,更有利于激发学生学习兴趣。 3 教师提出问题
PBL教学中问题的设计非常重要,我们遵循以下原则: 第一,根据教学大纲的要求及章节重点内容,结合目前细胞生物学领域的研究热点设计问题;第二,根据生物技术专业学生知识构架,设计难易适中的问题;第三,设计结合日常生活中大家关注的生命科学问题。例如,细胞的信号转导这一章围绕G蛋白偶联受体结构和功能这一知识点,设计了G蛋白偶联受体突变与哪些疾病息息相关?与肿瘤相关的信号转导途径有哪些,如何预防和治疗? 针对细胞分化这一章的干细胞这一重点知识,设计了干细胞的临床应用情况如何?干细胞与器官移植等问题。
4 学生分组查阅资料
问题提出以后,要分组解决问题。每组5人,分别设立组长负责本组问题的分工、督促查找资料和组织组内讨论等任务。提前一周将问题分发给学生,各小组经过充分的调研和讨论选取共同感兴趣的问题。根据分工,各小组成员开展工作。同时要求教师配合每个小组,随时与各小组进行沟通和答疑。
5 课堂讨论
各小组根据分工将材料做成PPT,由组长进行10分钟陈述,组员补充,其他组进行质疑和指正。若交流中出现学生解决不了的问题,教师适当进行启发和引导,如果问题仍解决不了,则由教师解答。
6 总结归纳以及教师评价
课堂讨论结束后,首先,学生对本组存在的问题进行归纳总结,自我评价学习过程和学习结果,思考知识、技能、小组成员协作和认知策略各方面的收获。其次,教师应对各小组信息是否完整与前沿、是否有创新与团队合作性、整理资料是否有逻辑性与条理性、是否按时完成、小组成员在小组讨论时的参与积极性以及各组的汇报是否精彩等方面进行评价。同时对于表现优异的小组给予适当奖励,进一步提高学生的参与积极性。
总之,为了提高教学质量,培养和提高我校生物技术专业学生的实践创新能力,促进学生综合素质的提高,我们积极进行教学改革。在结合细胞生物学课程特点和生物技术专业学生实际情况下,我们将PBL 教学模式引入课堂,并且获得了较好的教学效果。我们希望通过PBL教学模式的实施,能够充分激发学生的学习兴趣及积极性,培养出具有良好学习能力、实践能力及创新能力的高素质人才。
参考文献
[1]翟中和,等. 细胞生物学[M].北京:高等教育出版社, 2000.
[2]余晓丽等. 细胞生物学教学改革与实践[J]. 南阳师范学院学报, 2006,5(6).
[3]Barrows HS,Tamblyn RM.The portable patient problem
pack:a problem-based learning unit[J].J ofMed Edu,1977,52(12):1002- 1004.
[4]Mancy LJ,Ann MP,Ann L,et al.Developing a problem-
研究性学习 细胞生物学 实践教学
教学模式不是固定不变的公式。任何教师组织研究性学习都不能机械地套用它;同时,任何学生都没有一成不变的学习方式。细胞生物学作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域。面向21世纪,为了跻身世界先进行列,为了完成我国高等教育“培养具有创新精神和实践能力的专门人才”的光荣任务,深化高等教育改革势在必行。深化高等教育改革的关键在于探索以培养学生创新能力为重点的新型教学模式。为了能在有限的课时内,让学生在理论与实验技能方面有一个全面的提升,笔者将研究性学习模式引入细胞生物学实践教学。
一、中国高校实践教学的困境
过去很长一段时间,实践教学由于受到主、客观因素的束缚,从总体上说不很令人满意。主要表现在门类众多、内容单一、重复严重、学时不够、方式呆板、考核不力等诸多方面。
1.课时减少,内容滞后。实践教学课时减少,是近几年新教学计划的特点之一。课时的减少与加强实验课、扩充实验内容的普遍趋势形成尖锐的矛盾。由于学科的高速发展,使得实践教学满足不了与理论接轨,往往实验内容滞后于理论发展,存在着很多缺陷。而随着教学形势和任务的改变,这些弊端显得更加突出,影响了该学科教学质量的提高。
2.教学方法单一陈旧。不少教师观念保守,满足于完成既定教学任务,只教书,不育人。集中表现在因循知识的“注入”而不重视思维的启迪;固守教师在课堂上信息的单向传递,而不重视学生的主动参与;局限于基本教材的知识面而不重视引导学生涉猎更广泛的知识领域。“让学生成为学习的主体”、“让学生学会学习”还未能得到落实。因而,我国大学生的独立性、批判性、创造性、应用性等能力与国外大学生相比显得较差。
3.考核方法片面。一般是根据学生的实验报告来直接打分,但是这样做的弊端是教师的主观性较大,同时对学生实际的实验操作掌握水平很难有一个正确的评价,较难客观的反映实践教学的效果。
二、研究性学习模式引入细胞生物学实践教学
1.统筹课程安排,改进实验方案。不开设验证性的实验,只开综合性、系统性强的实验,将学术研究比较成熟的研究结果改造成符合实验教学要求和特点的综合性实验。系统教授完理论课程后,利用集中的几周时间进行实验教学,使理论课和实验课有一个有效的衔接,使学生能够系统掌握细胞生物学的基本实验技能。
2.自编实验教材,重新设置内容。在实验教学过程中,根据精选的教学内容,编写了《生物学实验教程》实验指导书;在教学过程中,以自编教材为主,并参考其他辅助教材。教师只讲解基本的操作方法和技术,既不是严格的实验顺序,也不是标准的操作程序,学生可根据自己的实验方案参考使用。
为学生创设实际情境,以便提出高质量问题,并以“课题研究”作为载体,激励学生寻找问题的答案。这些问题应该是:
(1)新的,即呈现的是不熟悉的情境;(2)在学生的能力范畴之内,即在先前学会的知识和技能的范围之内时。学生自主组队,根据提出的问题,选用合适的实验方法,解决问题。
3.全面开放实验室,以科研带动教学。实验室开放是实验教学方式、手段的革新,我们要树立教学与科研相结合的思想,“以科研促教学,以教学带科研”,在教学中研究,在研究中教学。实验室的开放包含两个方面:实验设备资源的开放和教学方式的开放。实验设备资源的开放,即学生可以合理选择、使用适合的实验仪器设备,完成实验项目。教学方式的开放,也就是教与学的开放。主要表现在学生对实验内容、实验方法等的选择,实验运行的环节,完成实验的形式,以及指导教师指导方法的开放,强调学生的主体地位。
4.利用网络,实时指导。由于现代教学手段的广泛应用,基于校园网的Black Board网络平台已经成为传统教室的延伸。教师和学生可以通过网络随时进行交流和答疑。充分利用计算机辅助教学实验软件和多媒体教学课件。网络的充分利用可以实现教师与学生之间的实时互动,大大提高实验教学的效率。这种教学方式不受时间和空间的限制,充分利用了师生的空闲时间。
5.建立合理的考核机制。实践教学的效果不应该由原有单一的考试或实验报告成绩老考核。我们的教学目标直接指向学生多方面的发展变化,因此评价的指标也应该以学生多方面的发展变化为依据。以现代的教学质量观来指导学生学习效果的评价,必须以是否有利于学生的进步与发展作为考核指标。如可由实验态度(10%)、基本理论(15%)、操作技能(50%)、实验结果(25%)综合评定产生。实验考核以学生实际操作技能和分析解决问题的能力为主。
三、结束语
总之,在当前高校课程实践教学中,改革的目的是改变传统教学中的一些不合理的教学方法和手段,提高教学质量,激发学生的创新思维,促进学生学习的自觉性和主动性,使培养的学生更能适应现代社会发展对生物类专业专门人才的需求。
细胞生物学实验是一门重要的实验课程,把握好理论课程和实验课程的有效衔接,才能真正提高实验教学的质量和效果。在本科生中开设细胞生物学实验这样的综合性实验课的改革是一个系统工程,除了在教学实践中不断改进教学方法外,我们教师自身也要为人师表,不断提高自己,以科研工作充分带动教学,应在教学过程中对应学生自身的特点,根据自己的学科特点和学生未来发展的不同要求对他们进行因材施教,培养更多高素质的人才。
参考文献:
[1]刘慧莲.细胞生物学实验教学改革探索[J].潍坊学院学报,2008,8(2):154-156.