细胞生物学的研究
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细胞生物学的研究范文第1篇
[中图分类号] G424.1 [文献标识码] A [文章编号] 1005-4634（2013）06-0065-03
0 引言
21世纪是生命科学的世纪，细胞生物学是生命科学的重要基础学科，具有较强的理论性和实验性[1]，同时也是近年来发展迅速的前沿学科。综观2012、2013年的诺贝尔生理学或医学奖不难看出，这些对生命科学有重大推动作用的杰出成就都是细胞生物学研究的领域。因此，深入探究细胞这个生命活动基本单位对于理解生命活动的基本规律、探究生命科学领域的基本问题、解决医学领域的重大问题有重要的意义。但在传统的教学中，往往采用“灌输”式教学，使学生处于非常被动的地位，这种接受型的教学方式忽视了学生自主学习、自主探究能力的培养，抑制了学生的研究兴趣与创造性，与21世纪日益加剧的国际竞争对创新人才的强烈需求形成尖锐矛盾。因此，发展新的教学模式迫在眉睫。研究性教学模式要求教学过程中要充分发挥学生的主体地位和教师的主导作用，学生在教师指导下，通过以“自主、合作、探究”为特征的学习方式较好达到课程教学目标。本文从研究性教学模式的角度对细胞生物学理论教学的教学内容、教学方法和实验教学的优化改革提出了几点思考。
1 在理论教学中培养学生的研究性思维
1.1 调整和优化教学内容
《细胞生物学》是高等院校生物学各专业开设的一门必修课，其内容迎合了不同层次学习者和研究者的需求。要在理论教学过程中培养学生的研究性思维，则不能拘泥于教材的内容及其编排，需要调整和优化教学内容，为学生形成研究性思维习惯做好铺垫。基于此，可以根据理论知识的难易程度、学生的知识储备和接受新知的能力、《细胞生物学》课程教学大纲、学科发展现状等对课程内容做适当的删减、增添和整合，调整和优化教学内容。
1）删减。删减学生已经耳熟能详的内容。学生在长期的知识储备和经验积累过程中已经习得的基础知识，应在课堂上避免赘述。例如，关于“细胞是生命活动的基本单位” 这一概念，其涵义学生从中学就已经有所了解，可引导学生从生命活动的不同方面举例来证明这一结论，并与最近的研究进展相联系，培养学生归纳总结知识的能力并激发学习兴趣。
删减某些学科交叉内容。由于细胞生物学是生命科学的基础学科，与生物化学、分子生物学、微生物学等学科有着深刻的相互渗透与结合，很多理论知识在不同学科中重复出现，因此应做适当的删减，化重复理论为知识迁移。例如，学生已经在生物化学中对线粒体的氧化磷酸化有了系统的认识，在本课程可以着重从氧化磷酸化的分子结构基础及其细胞生物学定位来理解其作用机制，从而在细胞这一层次上对这个过程有全面理解并形成结构决定功能的生物学思想。
删减识记类课程内容。研究性学习的目的不仅在于知道是什么，而且在于明白为什么和怎么做，以提高解决问题的能力。把识记类理论知识放至课前或课后，在课堂上注重方法习得不失为好的举措。例如，细胞是一个复杂的信号网络系统，细胞信号转导的途径和细胞对信号的整合与控制应是课堂上探讨的重点，而细胞通讯、信号分子、受体等基本概念应由学生自主习得。除此之外，关于细胞生物学研究方法的内容可以移接至实验教学中。
2）增添。注入研究方法，渗透研究性思维。在《细胞生物学》中，对生命现象探究的内容虽有不少涉及，但很少展示具体的研究思路，因此要求教师要拥有丰富的教学资源和素材，适时在课堂教学中渗透科学研究方法。
引入科研成果，把握学科前沿。教师需要时刻关注国内外的科学研究动态和成果，撷取精华介绍给学生[2]，拓宽学生视野；教师应提炼学术会议上各专家的新理念、新思路，以活跃学生的思维，便于研究性学习，推陈出新；学生也要利用书籍、期刊、网络、电视等多种途径丰富见闻，在合作和交流中兼收并蓄，思维碰撞。
适时插入科学家的故事。必要时，以科学家艰辛的探索事迹进行科学态度和科学精神教育，适时引入科学家的逸闻趣事，以激发学生的学习兴趣。
3）整合。细胞是生命活动的基本单位，“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”。为了系统而深刻地理解生命的本质，必须避免片段化教学，应对教学内容适当整合，以符合学生的认知规律。
知识点间的整合。例如，锚定连接需要细胞骨架系统的参与，因此可把锚定连接的相关内容安排在细胞骨架后，以便新旧知识的联接。
调整课程内容的顺序。细胞生物学的研究重点已不再限于细胞的结构与功能方面，而是明显转向细胞重大生命活动及其分子机制的探秘，因此建议将细胞的结构与功能等章节内容整合、将细胞重大生命活动及其分子机制等章节内容整合，掌握前者是揭示后者的基础。
1.2 改变教学方法，改进评价体系
在研究性教学中强调，学生是教学过程的主体，学生要在研究中学习和成长，发展学习主动性和养成独立思考的习惯；教师则在整个教学过程中起组织者、指导者、帮助者和促进者的作用[3]。在教学方法上，建议采用问题教学方式，在确定了研究课题的前提下，通过创设问题情境，引导学生质疑，并恰当引入科研成果。
1）建立激励机制，确定研究课题。采用研究性教学模式会增加学生的课前准备负担，对于每个学期要上近10门课程的学生来说，如何激励学生主动学习是非常重要的。学生的积极参与仅仅靠老师语言上的激励是不够的，必须建立相应的激励机制，比如可在教学质量的评价体系中加入“课堂发言”这一项，并在最终成绩考核中占一定的比例，如可设定课堂发言∶实验成绩∶理论成绩=3∶3∶4，课堂发言由教师当场打分，整个学期成绩累计，取其平均值。
研究性教学模式并不在于形式上以学生为主，而在于学生在实质上的主体地位。因此，在教学方式上，既可以采用老师提问、学生讨论的方式，也可以采用教师讲授、学生随时质疑的方式。在第一种方式中，老师需要精心组织并向学生提供研究课题，鼓励学生主动参与，由于学生准备的是否充分直接决定了其在课堂上的参与度和思维的拓展度，因此在确定研究课题后，要留给学生一定的时间准备相关材料。同时，为避免要探究的问题因庞杂而止于肤浅，可将研究课题分成若干子课题。在实践中，将学生分成小组（每组3～5人），问题到组，每小组负责阐述1～2个子课题。这样既保证了学生探究问题有一定的深度，又有效地激发了他们的参与热情。
在确定课题及课堂讨论中要注意掌握研究课题的广度与深度。为达到既使学生掌握理论知识又能训练其思维的目的，在确定研究课题时，应注意课题的广度，不能任意发散、偏离重点；同时，也要考虑到课题的深度，难度适中，有效激发学生的兴趣。例如，在《细胞信号转导》课题中，要求学生理解并掌握细胞信号转导的主要途径、细胞对信号的整合和控制，教学活动应围绕这两方面展开，在掌握基本的几条途径的基础上，再进行归纳，绘制网络图，找出其交叉点，从而理解其整合性。同时可通过查阅文献进行知识的扩展，了解近年来这些基本的信号转导途径的新进展。
2）创设问题情境，引导学生质疑。在研究性教学中，师生应是平等的探索者的关系，教学过程就是解决问题的过程，因此应以问题研究[4]为主线，教师要善于提出启发性、针对性的问题[2]，问题的设置要有层次感，遵循学生的认识规律。开场问题要设计巧妙，顺利促使学生进入学习情境；教学过程中，教师要做好学生活动的组织者、帮助者和促进者，指导和总结提升到位；对于抽象复杂的机制需要结合多媒体等手段，化繁为简；探讨完理论知识后，要引导学生思考和分析与生产生活紧密相关的问题，学以致用。学生可以采用独立思考、小组讨论等多种形式的学习方法多角度调动思维，也可以在解决问题的同时提出有研究价值的新问题，进行课堂外的延伸，拓展思维的深度。例如，在《细胞信号转导》课题中，教师可借此课题引导学生掌握相关前沿。如教师可提出：生物对光的响应是通过其受体来完成的，目前已经发现了几种光的受体，分别是什么？UV-B的受体是什么？受体如何传递这一信号？细胞对这一信号产生什么样的响应？当诸如小麦等植物接受UV-B后，会产生哪些响应？这样学生就会通过阅读文献掌握这一领域的最新发现，了解UVR8这一刚刚发现的紫外线的受体，通过了解其机理，联系实际，就可以自然而然地提出：可以通过人为增强紫外线辐射来刺激植物产生更多的类黄酮，从而提高某些植物尤其是药用植物的保健作用。这样，理论就和实践很好地结合到了一起。
3）恰当地引入科研成果。细胞生物学是一门迅猛发展的学科，尤其是分子生物学的概念与方法的引入，将其迅速推向分子细胞生物学水平。细胞生物学相关领域的研究现状和成果如何，教师可以在课堂上适时介绍给学生，尤其是重点阐述研究方法、实施步骤等内容，对学生进行科研方法与思路的指导。例如，在《细胞分化与基因表达调控》这一章节中，可以引入2012年诺贝尔医学奖获得者日本京都大学教授山中伸弥和英国的约翰戈登将细胞核重新编程的成果（即将成年体细胞重新诱导回早期干细胞状态，以用于形成各种类型的细胞，这一技术的实现免除了使用人体胚胎提取干细胞的伦理道德制约，将能避免异体移植产生的排异反应，为某些严重疾病的治疗提供了契机）。领域的杰出成果能够对现有课本知识进行补充，学生也可以通过专题文献查阅报告的形式交流科学界的新理念、新发现。
2 在实验教学中锻炼学生的科研技能
实验教学是培养学生技能的重要途径，也是学生研究性学习的具体体现。通过一系列实验技能的学习和实践操作，学生将对所学的基础理论知识有更深刻更直观的理解，同时还可了解有关细胞生物学和细胞工程领域常用的研究手段和方法，为进一步深造和独立开展科研工作奠定基础。
2.1 合理安排实验教学进程
实验课的进程应该与理论课的进程相辅相成，教学建立在科研基础上，科研促进教学的提高。
2.2 改建实验课
1）通过验证性实验培养学生基本的实验技能。通过细胞形态结构的观察，学生可以掌握相差显微镜、偏光显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜等各类显微镜的结构、原理及其操作；通过对细胞组分的分离及观察，学生可以学会分离、纯化、活体染色等技术。在实验前，学生应该通过实验指导、网络等了解相关仪器设备，并了解其原理及操作，指导教师对所出现的问题进行指导，规范操作。
2）通过设计性和综合性实验培养学生分析和解决问题的能力。设计性实验、综合性实验要求学生以本课程的相关理论知识为基础，在具备一定的实验操作技能的前提下，通过查阅资料等富有创造力地独立完成实验设计，创新实验方案，这对学生的素质要求较高，因此也是培养学生分析和解决问题能力的良好手段。设计性和综合性实验的题目可以结合教师的科研项目拟定，从而不仅将教学与科研融为一体，而且可以集结众多人的智慧，推进教师的科研进程。
2.3 撰写实验报告和科研论文
实验报告具有情报交流、保留资料的作用，学生在撰写验证性实验的报告时要如实地把实验的全过程和实验结果记录下来，对结果进行分析讨论时要加入自己的理解，拓展科研思维，也可以写出实验中遇到的问题、解决的方法、误差分析，并提出改进意见。
对于设计性和综合性的实验，撰写科研论文是学生展示科研能力、提高科研水平的重要手段，是需具备的基本功之一。
3 教学改革效果
目前所使用的理论课教材为翟中和院士等主编的《细胞生物学》（第三版），本着研究性教学的理念，首先对部分章节如“细胞的能量转换——线粒体和叶绿体”尝试采用了研究性教学模式，学生利用课外时间积极查阅资料，认真思考，充分准备；课堂上以小组为单位首先提出自己的问题，然后讲解，各小组讨论、提问，最后总结。通过这样的方式，不仅学生的学习热情高涨，对知识的理解更为透彻，更重要的是，学生能发现问题并知道如何解决问题。接下来，又把一些问题留给学生，如在细胞的信号转导中，G蛋白耦联受体介导的信号通路广泛参与生命活动的诸多方面，而且该领域是一个正在迅速发展的领域，不断有新的发现。所以鼓励学生充分利用高校的期刊数据库获取相关研究进展，课堂上小组交流讨论，通过这样的方式学生获取了大量的信息，对该领域的前沿动态也有了一定的了解，极大地激发了学生的科研热情。在实验教学方面，将细胞生物学实验进行了课堂外的延伸，与大学生创新实验相结合，鼓励学生利用细胞生物学的知识去解决或探究某一问题，目前已有部分成果被国内重要的核心期刊所接受。研究性教学的采用，使细胞生物学教学质量有了显著提高。学生不仅在课前养成了独立思考的习惯，提高了自主学习能力，而且能在课堂上广泛参与讨论，交流思想，合作学习；学生对细胞生物学的理论知识和实验技能掌握得较为扎实，对细胞生物学的科学前沿有较敏锐的把握，利用细胞生物学基础知识、基本技能开展相关领域研究的能力得到了提高。总之，研究性教学模式从根本上发展了学生学习的主体性，为培养学生的创新意识、发展学生的科研思维能力提供了条件。教师应积极开展研究性教学的尝试与探讨，培养创新型人才。
参考文献
[1]翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学（第4 版）[M].北京：高等教育出版社，2011.
[2]卢晓梅，杨艳燕，居超明.生物学研究性教学的探索与实践 [J]. 生物学杂志，2005，（3）：47-49.
细胞生物学的研究范文第2篇
[关键词] CIK细胞;扩增;杀伤活性
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2007）12（c）-019-03
The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells
WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru
(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)
[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P
[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外经过多种细胞因子作用后培养获得的一群异质细胞。它同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，被认为是增殖速度最快，杀瘤活性最强，杀瘤谱最广的效应细胞。过继性免疫治疗是治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法，用于过继性免疫治疗的免疫活性细胞必须具有较强的扩增力和杀伤性。本实验通过对CIK细胞的体外培养及其生物学特性的研究，以寻求用于过继免疫治疗的高效免疫活性细胞。
1 材料与方法
1.1实验材料
人外周血样品取自中心血站12例健康成人自愿者的静脉血50 ml。男6名，女6名，年龄20～50岁。人肺腺癌细胞株A-549购自南京凯基生物科技发展公司。
1.2主要试剂和仪器
RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；特级无支原体无热源胎牛血清(美国TBD公司)；人淋巴细胞分离液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技术发展中心，天津)；二巯基乙醇(美国TBD公司)；台盼蓝（美国Sigma公司）；二甲亚砜（美国Sigma公司）；青霉素，链霉素（华北制药有限公司）；胰蛋白酶（南京凯基生物科技发展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等购自北京化学试剂公司；MTT试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）；重组人白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美国Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（异硫氰酸荧光素）、CD4-PE（藻红阮荧光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG荧光抗体（美国eBioscienc公司）；流式细胞仪(美国BD公司)；550酶标仪（美国Biorad公司）。
1.3实验方法
1.3.1 PBMC的分离(密度梯度离心法)及LAK、CIK细胞的诱导将人外周抗凝血用淋巴细胞分离，吸取白膜层细胞即PBMC，PBS洗涤3遍，加入含10%无热源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巯基乙醇、0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素培养基），调整细胞浓度，接种于25 cm2培养瓶中，1.0×107个/（10 ml・瓶)，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内静置2 h，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。取非黏附细胞分成2组。LAK组:加入500 U/ml IL-2，每3天换液1次并补加500 U/ml IL-2。CIK组:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d换液1次，并补加IL-2及CD3mAb。
1.3.2LAK、CIK细胞表型的检测在培养1，4，7，10，13，16，19，22 d取培养的细胞，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，取100 μl悬液加入流式专用试管中，加入FITC、PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，对照为IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗涤3遍，洗去多余的抗体。并用同型无关阴性抗体做对照，在流式细胞仪（美国BD公司）上检测分析，至少分析1.0×105个细胞。
1.3.3 LAK、CIK细胞杀伤活性的检测取对数生长期的肺癌细胞A-549作为靶细胞，用RPMI1640培养基稀释成1.0×105个/（100 μl・孔），接种细胞于96孔培养板中，然后取出培养两组效应细胞，把效应细胞加入靶细胞孔中混合，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔，放置培养箱中培养24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)测仪于570 nm处测OD值，按下面公式计算各组LAK的杀伤活性。
1.4统计学处理
数据采用SPSS12.0统计软件包处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多个均数间使用单因素方差分析，两样本均数的比较用t检验，P
2 结果
2.1 CIK细胞的增殖情况
实验表明PBMC在细胞因子作用下均能增殖，镜下可见细胞饱满透亮、聚集成团，呈集落样生长。与LAK比较，在前期无明显差异，至19、22 d时扩增能力显著高于LAK细胞的扩增倍数(P
表1不同培养天数LAK、CIK细胞的增殖情况(x±s，倍)
2.2 CIK细胞的表型分析
用流式细胞仪分析细胞表型，结果显示CIK细胞培养后，其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P
与培养前比较，*P
2.3 CIK细胞的杀瘤活性
CIK细胞在培养至第13天即有较高的杀瘤活性，为61.17%，显著高于LAK细胞的41.02%(P
与单纯的LAK对照组比较，*P
3 讨论
近年来恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，随着细胞免疫学和分子生物学的发展，细胞免疫治疗成为除化疗、放疗之外的又一重要辅助治疗手段，副作用轻微，安全性较好[3]。过继免疫治疗(ALT)是恶性肿瘤生物治疗的一个重要手段，是通过直接向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫活性细胞，在体内发挥抗肿瘤作用，以此来达到治疗肿瘤的目的。淋巴因子诱导的杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的杀伤细胞，具有广谱杀伤肿瘤的细胞活性，其较早用于临床肿瘤免疫治疗并取得了一定疗效。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)是一种非MHC限制性的高效溶解肿瘤的细胞毒性T细胞，其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志CD3，也有NK细胞表面标志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。CIK 细胞是一类非主要组织相容性复合物(MHC)和非T细胞受体(TCR)限制性的免疫活性细胞，在培养过程中，一些非活性细胞在多种细胞因子的共同刺激下，激活为有细胞毒作用的CIK 细胞。这些活性细胞发挥抗肿瘤作用的机制很可能是通过黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互结合后，能够分泌大量的BLT 酯酶的细胞质颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解[6]；同时，CIK细胞自身还能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些细胞因子，提高细胞毒作用。是目前最新、杀伤肿瘤效果最佳的生物免疫治疗方法。Lanier于1986年首次发现这种异质细胞群(主要是CD3+CD56+细胞)，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%[7]。经过多年的实践，科学家们找到了体外大量扩增CIK细胞的方法，即应用细胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3单抗共同培养产生CIK。我们在实验中采取此方法，在分离外周血单个核细胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3单抗、IL-1β与IL-2，培养22 d，每3天换液和补加细胞因子，培养13 d时即有25%左右的细胞是CD3+CD56+细胞，具有典型的CIK细胞形态和生物学性状。CIK具增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、毒副作用小等优点，目前自体及异体外周血CIK细胞已被用于一些实体瘤和恶性血液病的治疗，并取得了较好的疗效。我们的实验结果表明，与LAK 细胞相比，CIK细胞具有更强的增殖能力，培养至22 d时体系中总的细胞数可增加100多倍。用流式细胞仪分析细胞表型， 结果显示CIK细胞培养后， 其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P
综上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3单抗、IL-1β和IL-2等多种细胞因子成功从健康人非贴壁PBMCs中诱导出大量的具有典型形态和免疫表型的CIK细胞，且具有较高的杀伤活性，为下一步临床治疗肿瘤奠定了基础。
[参考文献]
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细胞生物学的研究范文第3篇
关键词：糖基转移酶 探针 肿瘤 耐药
Annual Report-Effect and Mechanism of Sugar Chains on the Biological Behavior
of Tumor Cells
Zhang Jianing1 Zhang Yan2 Yan Qiu1 Jia Li1 Wang Shujing1
（1.Dalian Medical University；2.Shanghai Jiao Tong University）
Abstract：This study suggests that the new Y subfamily of ppGalNAc-Ts plays an important role in protein glycosylation； characterizing their functions will provide new insight into the role of ppGalNAc-Ts. Disulfide- and terminal alkyne-modified magnetic silica particles （DA-MSPs） were synthesized and used to covalently capture and reductively release azido glycopeptides via click chemistry and dithiothreitol treatment. Using DA-MSPs， an efficient and specific enrichment method for separating azido glycopeptides has been developed. The alterations of integrin glycosylation play a crucial role in tumor metastasis. Our previous studies indicated that caveolin-1 promoted the expression of the key a2，6-sialytransferase ST6Gal-I and fibronectin-mediated adhesion of mouse hepatocarcinoma cell. Herein， we investigated the role of a2，6-sialylated a5-integrin in the adhesion of mouse hepatocarcinoma H22 cell. We demonstrated that caveolin-1 up-regulated cell surface a2，6-linked sialic acid via stimulating ST6Gal-I transcription. Cell surface a2，6-sialylation was required for integrin a5b1-dependent cell adhesion to fibronectin， and an increase in a2，6-linked sialic acid on a5-subunit facilitated fibronectin-mediated focal adhesion kinase phosphorylations， suggesting that a2，6-sialylated a5-subunit promoted integrin a5b1-dependent cell adhesion. B4GALT family consists of seven members， which encode corresponding enzymes known as type II membrane-bound glycoproteins. These enzymes catalyze the biosynthesis of different glycoconjugates and saccharide structures， and have been recognized to be involved in various diseases. In this study， we sought to determine the expressional profiles of B4GALT family in four pairs of parental and chemoresistant human leukemia cell lines and in bone marrow mononuclear cells （BMMC） of leukemia patients with multidrug resistance （MDR）. The results revealed that B4GALT1 and B4GALT5 were highly expressed in four MDR cells and patients， altered levels of B4GALT1 and B4GALT5 were responsible for changed drug-resistant phenotype of HL60 and HL60/adriamycin-resistant cells. Thus， we propose that B4GALT1 and B4GALT5， two members of B4GALT gene family， are involved in the development of MDR of human leukemia cells， probably by regulating the activity of Hh signaling and the expression of P-gp and MRP1.
细胞生物学的研究范文第4篇
【摘要】 为进一步提高脐血造血细胞的扩增倍数并达到临床规模，本研究中利用自主开发的有溶氧和pH控制的搅拌式生物反应器进行了脐血造血细胞的换液培养。结果表明，培养中总细胞、CD34+细胞、各系集落形成细胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的扩增倍数均高于方瓶培养，而且由于控制了较低的溶氧，所培养细胞中干/祖细胞含量显著高于方瓶培养。该反应器中培养的脐血造血细胞达到了临床应用的规模。结论：反应器中培养环境更有利于干/祖细胞的维持和扩增，而且可达到成人造血干细胞移植所需细胞量。
【关键词】 脐血
Ex vivo Culture of Umbilical Cord Blood Hematopoietic Cells in Stirred Tank Bioreactor with feeding protocol
Abstract To increase the expansion multiple of cord blood (CB) hematopoietic cells and to reach a scale for clinical application，the mononuclear cells from CB were cultured in a autonomously developed stirred tank bioreactor with dissolved oxygen (DO) and pH controlling. The result showed that the expansion multiple of total cells，CD34+ cells，and progenitors cells (CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，and CFU-Mk) in bioreactor were greater than that in T-flasks. The rate of progenitors to total cells in bioreactor culture was also greater than that in T-flasks. The good results in bioreactor should be attributed to the controlled，optimized DO. Clinical-scale culture was realized from one sample of CB in this bioreactor. These results suggested that the culture environment in bioreactor with optimal DO and pH controlling is more favorable for stem/progenitor cell maintenance and expansion，and the expanded cells from one sample of CB is enough to transplant for an adult patient.
Key words cord blood；hematopoietic cell；bioreactor；stirred culture
脐血细胞中富含造血干细胞，从而成为除骨髓和外周血之外一个重要造血干细胞来源，在临床上有着广泛应用，但脐血中造血干细胞的绝对数量少，无法满足成人的移植要求，而通过体外培养和扩增有望克服这一矛盾。体外扩增骨髓细胞、外周血细胞、脐血细胞的临床实验都已有所报道［1，2］，证明了体外扩增后细胞用于临床的安全性和可行性。目前开发的体外扩增造血干细胞的培养系统主要有平板灌注腔反应器、固定床和流化床反应器、搅拌式反应器等［3］。其中搅拌式生物反应器能提供均一的培养环境，而且取样和数据采集简单，易于实现自动控制，因此，在造血细胞临床规模培养中有较好的应用前景［3，4］。本研究应用自主开发的搅拌式生物反应器系统，进行脐血造血细胞的换液培养研究。
材料和方法
脐血(CB)和单个核细胞(MNC)的分离
脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求是身体健康、发育良好的非高龄产妇。脐血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养液洗涤2次。
培养基和细胞因子
体外培养液用IMDM（Gibco公司），使用时添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50 ng/ml）、IL-3（5 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml）、G-CSF（2.0 ng/ml）和GM-CSF（2.0 ng/ml），其中SCF、IL-6购于北京宝赛生物技术公司，IL-3购于Pepro-Tech公司，G-CSF购于上海三维制药厂，GM-CSF购于上海海济生物技术有限公司。
造血细胞的反应器换液培养
将分离得到的脐血单个核细胞以2×106 cells/ml的密度在 T-175方瓶中培养4天后，再接种到反应器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中进行培养，进行的2次实验中接种密度均为0.8×106 cells/ml。反应器为自主开发产品，其中反应器中所用材料经过造血细胞的生物相容性检验，反应器工作体积为300-500 ml，搅拌系统为磁力搅拌，转速控制为30 r/min。反应器的温度控制为37℃，溶氧和pH通过调节空气、氮气、氧气和二氧化碳的流量来控制，通气方式为表面通气。pH控制在7.15，溶氧控制为饱和溶解空气的25％。细胞接种到反应器后，待细胞密度生长至2.0×106 cells/ml后进行换液，即取出50％的细胞液，并加入相同体积含有相同细胞因子的新鲜培养液。实验中以T-25方瓶作对照，每瓶装液7 ml，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度的培养箱中进行细胞培养，方瓶与反应器中换液比例和频率相同。
细胞计数及活性分析
台盼蓝染色后利用血球计数器进行活细胞和总细胞的计数，由于实验中很少能见到被染成蓝色的细胞（死细胞），因此，未进一步计算细胞活性。
造血细胞的集落检测
集落的检测体系为IMDM培养液，添加20％胎牛血清（FBS），4 mmol/ml谷氨酰胺（Sigma），含0.9％甲基纤维素(4 000cp，Sigma)，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、 EPO，其浓度分别为50、20、20、20、20 ng/ml和2 U/ml，并添加1％牛血清白蛋白（BSA）。取(1-3)×104培养或没培养的单个核细胞加入0.5 ml集落培养液中，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养12天后，进行CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix计数，其中CFU-Mix为至少含有粒细胞和红细胞的集落。
CFU-Mk的检测采用血浆块法，细胞以1×105 cells/ml的接种密度接种于24孔板中，每孔加50 μl脐血浆，50 μl 3.4 g/L的CaCl2溶液，另加入含有TPO （20 ng/ml）、IL-3（10 ng/ml）、IL-6（10 ng/ml）的α培养基（Gibco公司），混匀后静置凝固。培养10-12天后，用1∶3的甲醇/丙酮溶液原位脱水，并固定30分钟，然后按次序加入1% BSA、鼠抗人CD41抗体、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体、抗生物素蛋白-碱性磷酸酯酶复合物（加入后都要作用一定时间，然后用0.05 mol/L Mtris/NaCl缓冲液淋洗3遍，再加入其它试剂），染色后在40×目镜下观测呈红色的集落。
细胞表型分析
流式细胞仪分析中所用抗体为PharMingen公司产品。取1.0×106未扩增或扩增后的细胞加入1.5 ml离心管中，用PBS洗2遍，离心后倒掉上清液，加PE偶联的小鼠抗人CD34单克隆抗体和FITC偶联的小鼠抗人CD45单克隆抗体各10 μl，4℃孵育30分钟。PBS洗2遍，离心后，每管加1 ml FACS保存液；标记抗体后的细胞用流式细胞仪（Becton Dickinson公司）分析，结果用Lysis II软件处理。
结
果
总细胞的扩增
由图1可见，换液培养时，总细胞在18天的培养中一直维持扩增，在开始的14天中反应器和方瓶中总细胞扩增倍数相差不大，14天后开始有所差别，说明培养到后期方瓶中细胞增殖潜力不如反应器。扩增到18天时，两批实验反应器中总细胞分别扩增37.2倍和26.3倍，方瓶低于反应器中扩增倍数。
干/祖细胞的扩增
CFU-Mix由于具有多向分化潜能，代表了较原始的干/祖细胞，换液培养中CFU-Mix扩增情况如图2所示，两次实验反应器中CFU-Mix的扩增分别在第10天和第9天达到最大，扩增倍数分别为7.7和8.9，方瓶中第7-8天达到最大，而后逐渐下降，其扩增倍数明显低于反应器中。反应器中培养至14天仍可检测到CFU-Mix，而方瓶中10天后仅能检测到很少的CFU-Mix。
CFU-GM的扩增在14天左右达到最大，而后维持数天，或有所下降，而方瓶中扩增倍数在第10天达到最大，而后开始较快下降，而反应器中CFU-GM扩增倍数一直高于方瓶，最大扩增倍数分别为27.4和23.6，显著高于方瓶（图2）。
BFU-E达到最大扩增倍数的时间较早，在7天左右，由于本实验中没有添加EPO，所以BFU-E的扩增倍数不高，由图2可以看出，反应器中扩增倍数一直高于方瓶。
反应器中CFU-Mk的扩增倍数在10天时达到最大，而后逐渐下降，14天后基本检测不到CFU-Mk，而方瓶中第7-9天达到最大后就开始较快地下降。扩增最大时，两次实验反应器中分别扩增10.3倍和14.4倍（图2）。
培养中CD34+细胞的扩增如图3所示，反应器扩增倍数一直上升，至14天时达到最大，方瓶培养到第7天时与反应器相差不大，第10天开始有较大差异，第14天的扩增倍数比第10天时提高不大。由图看见最终反应器中CD34+细胞的扩增倍数高于方瓶培养。
反应器培养的规模
附表显示了2次实验中反应器培养的规模，由附表可见，如果不取出细胞而采用流加方式培养细胞，则培养到12天时，第1次实验中可得到2.44×109总细胞、4.88×106 CFU-Mix、11.9×106 CFU-GM和59.5×106 CD34+细胞，第2次实验可得到2.03×109总细胞、3.53×106 CFU-Mix、9.0×106 CFU-GM、和36.7×106 CD34+细胞。
造血干细胞移植中细胞需要达到的理想量是总细胞3.7×107 cells/kg，和CFU-GM 2.0×105 cells/kg，CD34+细胞2.5×106 cells/kg。按此计算，对于1个50公斤体重的病人总细胞、CFU-GM、CD34+细胞必须分别达到1.85×109、 10×106、和125×106 个。我们的检测中是作同一集落分析而分别计数CFU-GM 和CFU-Mix，而CFU-Mix是比CFU-GM更原始的细胞，因此，这两个数字应该相加再与文献中所述的CFU-GM量相比才是科学的，从总细胞和集落形成细胞数来说，反应器培养所得细胞可达到理想量的要求。CD34+细胞数虽然小于理想量，但也可满足最低量25×106细胞的要求。因此，如果利用该反应器一直补料培养，可以从一份脐血培养得到足够用于临床的细胞量。
讨 论
造血干/祖细胞移植目前在临床中主要用于造血干/祖细胞缺陷性血液病、先天性免疫病、各类自身免疫病、及实体瘤的治疗，是一种重要的细胞治疗手段。脐血造血干/祖细胞作为一种造血干/祖细胞来源，
由于数量较少，在临床上只能用于儿童患者，要应用于成人患者则必须通过体外扩增增加其数量，其中培养环境中的溶氧、pH、细胞因子、培养方式等对扩增效果有重要影响。因此，要实现造血干细胞体外扩增技术在临床上应用，需要开发出足够大规模、标准化的培养系统以及相应的扩增工艺。本研究采用搅拌式生物反应器在临床规模扩增了脐血单个核细胞，扩增得到的细胞中代表造血干/祖细胞的CD34+细胞、CFU-GM、CFU-Mk等细胞的含量均较常规的静态培养高，更适于临床应用。而且，其培养规模达到了临床应用中所需移植细胞量的要求。
溶氧是造血细胞发育的重要调控因子，很多报道都表明，低氧分压（1％-5％）比正常氧分压（20％）有利于造血干/祖细胞的维持和扩增［6］，因此，我们在生物反应器中控制的溶氧为饱和空气的25%，这与5％氧分压相当。实验表明，反应器培养中不但细胞扩增倍数高，所得细胞中CFU-GM、CFU-Mix、CFU-Mk，CD34+细胞的含量都高于方瓶培养的结果，而且维持时间比方瓶中长，这应该与反应器中所维持的低溶氧有关。
值得注意的是，在本系统中虽然在一定程度上可以减缓造血干/祖细胞的分化速度，但并不能从根本上解决培养过程中造血干/祖细胞的分化问题。另外，本实验中所检测的各类集落形成细胞及CD34+细胞都仅能代表造血祖细胞，因此其扩增情况只能代表祖细胞的扩增，如果要确定造血干细胞是否真正实现了扩增，则需要进行SCID小鼠体内造血重建实验才能够确定。
Collins等［3］也用400 ml的有pH和溶氧控制的反应器进行了脐血造血细胞的培养，其2次实验中总细胞分别扩增了约35倍和200倍，而CFU-GM分别扩增了约23倍和30倍，我们的结果与之相比相差不大。Kim等［7］在不控制pH和溶氧的转瓶中进行了骨髓造血细胞的培养，培养中只添加细胞因子组合IL-3、SCF、GM-CSF和EPO，结果总细胞和CFU-GM只扩增了8倍和5倍。在此基础上添加基质细胞条件培养基显著提高了总细胞的扩增，CFU-GM扩增也提高到了17倍，CFU-GM含量大大增加。我们的实验中所添加的细胞因子为IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF和G-CSF，其中促分化的IL-3、GM-CSF和G-CSF添加量都较小，分别为5 ng/ml、2 ng/ml、2 ng/ml，这对防止细胞过早分化有一定作用。如果在此基础上进一步优化培养基，如添加基质细胞条件培养基或FL和TPO等能促进干细胞增殖的细胞因子等，有望进一步提高造血干/祖细胞的增殖。
除造血干/祖细胞外，为缩短粒细胞和血小板的恢复期，以及为放疗和化疗提供辅助治疗，临床中对粒细胞、巨核细胞、红细胞等成熟细胞的需求也很大，因此，培养成熟细胞也是造血细胞体外扩增的重要内容之一。Neildez-Nguyen等［8］在体外培养红细胞前体细胞的实验中所培养的总细胞数达1010个，这些前体细胞在输入小鼠体内后可分化为成熟的红细胞，对于如此大规模的成熟细胞培养，应用搅拌式生物反应器将更有优势。
【参考文献】
1Jaroscak J，Goltry K，Smith A，et al. Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation with ex vivo-expanded UCB cells: results of a phase I trial using the AastromReplicell System. Blood，2003；101: 5061-5067
2McNience I，Briddell R. Ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells and mature cells. Exp Hematol，2001；29: 3-11
3Cabral J M S. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells in bioreactors (review). Biotechnology Letters，2001；23: 741-751
4Collins PC，Miller WM，Papoutsakis ET. Stirred culture of peripheral and cord blood heatopoietic cells offers advantages over traditional static systems for clinically relevant applications. Biotechnol Bioeng，1998；59: 534-543
5Collins PC，Nielsen LK，Patel SD et al. Characterization of hematopoietic cell expansion，oxygen uptake，and glycolysis in a controlled，stirred-tank bioreactor system. Biotechnol Prog，1998；14: 466-472
6Hevehan DL，Papoutsakis ET，Miller WM. Physiologically significant effects of pH and oxygen tension on granulopoiesis. Exp Hematol，2000；28: 267-275
细胞生物学的研究范文第5篇
1 细胞机械应力响应的生物学基础
1．1 细胞结构的张力完整性：张力完整性结构(stress integrality structure，SIS)由承受压力构件和一系列连续的张力构件相互连接组成。这种结构的稳定性取决于结构内部完整性的保持，因而被称为张力完整性。生物学研究表明，细胞的结构符合张力完整性原理，而且细胞骨架(cellularframework，CF)的张力完整性影响细胞的形状及功能。细胞骨架的张力完整性是细胞形变的主要决定因素。有关研究表明扁平细胞比圆形细胞DNA合成更为旺盛，说明细胞的变形是信息传递的重要环节。在机械应力的作用下细胞骨架的所有构件为了分散张力和压力而发生整体重排，从而导致细胞发生形变，细胞形状调节发出的调节信息以力的形式传递。因此，机械应力的变化可以通过细胞及其骨架内的力平衡而对细胞的生长和生化性质产生影响，即细胞受到来自体外的直接的力学刺激时，它的形态和功能都会发生改变。由于张力完整性结构中存在预应力，若对该结构中的某一构件施加应力，所有相互连接的构件包括距离很远的构件就会整体重排，从而导致线性硬化响应，即结构硬度的增加与施加应力的增加成正比。活细胞线性硬化以响应通过细胞表面受体传递的应力，力学信号再通过细胞骨架的几何形状或分子结构依赖于力的变化而转变为生化响应。研究发现，骨架重排可引起细胞形态的改变，细胞骨架作为细胞内的张力框架，通过与细胞膜上分子的直接联系，将力学受体上的分子扭曲力在细胞内传递分布，再经过效应分子的扭曲力将力学信号最终表现在效应点上。
1．2 整合素：细胞整合素是一类重要的细胞表面受体，其配体主要为细胞外基质蛋白(extracellularmatrix，ECM)，如胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白等。整合素通过识别这些胞外基质蛋白，介导细胞与细胞、细胞与ECM的粘附反应并接受传导级联信号，在多种基本的病理生理过程中发挥重要作用。其β亚单位的胞内区不仅能与肌动蛋白结合的蛋白质如vinculin、talin、paxillin及－actinin反应，而且还能与聚焦粘附激酶(focaladhesion kinase，FAK)的氨基端反应，FAK进一步与各种信号分子反应，如C－Src、Graf(与FAK有关的GTP酶调控因子)、IP－3激酶等，这些信号分子又可进一步激活各种下游蛋白的级联反应，包括促有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen－activitatedprotein kinase，MAPK)，蛋白激酶c(proteinkinase C，PKC)和PIP－5激酶等。
目前，越来越多的研究表明整合素具有机械应力转导的功能，并且主要集中于整合素聚焦粘附区域，起到变机械力学信号为化学信号的作用。采用裱衬了纤粘连蛋白或含RGD肽的微球对细胞进行剪切加载，发现力信号可以直接传入细胞骨架(表现为细胞硬度指数随应变增大而增高)，而若微球未裱衬或裱衬其他非整合素的配体，则力信号不能直接传入细胞骨架。利用磁扭转细胞计，将机械应力直接作用于细胞表面受体证实，β1整合素能将力信号传递至细胞骨架，诱导聚焦粘附的形成，支持应力依赖性细胞硬度反应，这说明整合素是外力传向细胞骨架的通道，细胞通过其表面的整合素受体及时响应，以张力整和的形式将响应的机械力信号有选择地转换到细胞和核内的不同结构部件上，如聚焦粘附络合物中的信号分子、细胞膜中的离子通道、核糖体、核膜孔、染色体、甚至可能是单个基因，实现力化学转化，从而调节细胞的生理机能，对维持细胞的生长和影响细胞的功能产生调控作用。
1．3 第二信使系统：细胞感受机械应力之后可生成一系列的第二信使分子，比如Ca2+，cAMP、PKC和IP3等。机械牵拉或剪应力作用可使成骨细胞和一些力敏感细胞(如血管内皮细胞)胞内Ca2+浓度迅速增高，Duncan等人的工作表明，应力诱导的成骨细胞胞内Ca2+浓度增高，至少部分通过应力敏感离子通道，且牵拉可使其电导增加并变得对机械刺激更为敏感。机械应变和剪应力亦均可诱导胞内IP3浓度增高，而IP3可以动员胞内钙库的释放，从而使胞内Ca2+十浓度增高。机械牵拉和剪应力均可使胞内cAMP浓度增高，而cAMP浓度的增高与力刺激诱导的细胞增殖和基质合成密切相关。机械刺激可在20s内增高IP3水平，并使IP3水平和PKC活性在2min内达到峰值。另外应力也可直接激活磷脂酶A－2参与力的转导过程。可见，Ca2+,cAMP．PKC和IP3等第二信使系统可在应力作用下发生变化。
1．4 应力反应元件：应力反应元件(stressresponsive element，SRE)是存在于细胞基因的启动子内并且能够被应力所诱导的启动基因转录的顺式调控元件，能够特异性地上调或下调相关基因的表达。目前已知的机械应力反应元件至少涉及4种转录因子结合位点及10余种受应力调控的相关基因。转录因子又称“第三信使”，是一类位于胞浆或胞膜上的蛋白质，被“第二信使”在转录后水平激活向核内转移，与特定的DNA序列结合，选择性地调节基因转录。目前在细胞上已发现至少有4种转录因子可被应力激活，它们分别是：①基因结合核因子(nuclear factor－gene binding，NF－xB)；②激活蛋白(activator protein－1，AP－1)；⑧早期生长反应蛋白(early growthresponse－1，Egr－1)；④刺激蛋白(stimulatoryprotein－1，SP1)。现已发现的10余种受机械应力调控的相关基因，根据它们的生物学特性，大致可以分为血管活性物质基因、生长因子基因、粘附分子基因、趋化因子基因、凝血因子基因和原癌基因等。
2 细胞机械应力响应可能机制
具有应力感受功能的细胞(内皮细胞、上皮细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞等)感受力学微环境的变化，可将力信号转化为细胞内一系列生物化学信号，最终导致基因表达变化。细胞外基质、整合素、局部粘附蛋白和细胞骨架网络
相互联系，彼此之间构成了一个完善的张力整合系统。在机械应力传入细胞的过程中，细胞外基质及细胞膜均可能参与了信息传递，细胞上存在的整合素等机械应力感受器可直接将信息传入细胞内，再通过细胞骨架的传递将信息传入细胞核。
业已证明，在细胞中有好几种转导途径，包括细胞膜离子通道(特别是牵拉激活的阳离子选择性通道，如SA－cat)、与G蛋白偶联的磷脂酶C通路、细胞内钙离子和细胞骨架等都参与了细胞的力学信号转导(mechanical stress－initiatedsignal transduction，MSIST)。胞外基质－整合素－细胞骨架复合体是主要的力学信号转导途径，可以传递作用在细胞表面上的应力到细胞内各区。此外已有一些证据，包括使用不同的细胞，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞及成骨细胞，表明在肌动蛋白肌丝与整合素的细胞质区部分之间起介导作用的a－辅肌动蛋白是一个关键分子结构，干扰肌动蛋白应力纤维的形成可阻止信号向细胞核的传递。G蛋白为常见的信号转导关键分子，大G蛋白通过对其亚基上氨基酸残基的脂化修饰作用而锚定在细胞膜上，从而为其接受细胞膜结构信号提供了结构基础，而小G蛋白则通过细胞外基质―整合素―细胞骨架接受细胞外机械信号。Gudi等证实G蛋白的活化是早期心肌成纤维细胞应力刺激的机械信号转导物质。细胞膜离子通道主要为力敏感阳离子通道，如Ca2+K+、Na+等，其激活无需第二信使分子的参与。细胞外钙离子的内流和细胞内钙离子的释放也可能在力学信号转导中起一定作用。钙离子的升高起始于细胞内钙离子的释放，随即伴有钙离子内流。细胞内钙离子释放的机制可能与细胞骨架和磷脂酶c通路有关，应变所导致的细胞变形可以使与细胞骨架相连的一种磷脂酶c抑制子脱离原位，抑制子的解除可以允许磷脂酶c的激活。磷脂酶C又可激活蛋白激酶c通路，后者又产生三磷酸肌醇和甘油二脂，三磷酸肌醇则促使钙离子从细胞内的贮存处释放。细胞外钙离子内流的途径则是通过SA－cat通道。
一旦机械应力被感知，PKC以及MAPKS即被活化，导致c－fos、c－jun基因表达。Sadoshima等证实机械应力可以活化磷脂酶c、磷脂酶A2、磷脂酶D、IP3以及DAG，同时细胞膜上磷脂被磷脂酶C分解，能产生肌糖磷酸化以及diacylglycerol，而导致PKC活化，IP3激酶在细胞骨架参予的应力作用过程中扮演着关键的角色。机械应力还可直接活化酪氨酸激酶途径并将机械信号传递给鸟嘌呤核苷接合蛋白(ras)，也可直接活化MAPK、MAPKK以及raf－1激酶。
尽管存在着多条不同的信号转导通路，但它们之间是密切联系的，这表明在感受应力刺激的过程中需要的是整个细胞的参与，而不可能只依赖于单一的信号转导通路。不同的力学信号可能通过这些内在联系而又相互调控的信号通路以不同的方式来影响细胞的反应。
