细胞生物学研究

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细胞生物学研究范文第1篇

以前我国的学校进行细胞生物学实验的方法是：老师将实验步骤、实验操作、注意事项在实验之前全部告诉学生，学生在老师设置的要求里用心完成课堂实验，造成学生在做实验的时候，对老师的指导形成了严重的依赖性，缺乏创新意识，不利于学生未来实践能力的培养。鉴于这种情况，我国开始改变实验教学模式，在保证学生生命安全的条件下，尽可能的将实验变成开放性实验，增强学生在实验过程中的自主性，学生根据自己的设想，用一定的实验方法去验证自己设想的可行性，老师的任务是现场监督实验的安全性，对一些存在安全隐患的实验方法进行制止，并在实验快要结束的时候，将课本上的实验方法进行讲解，并鼓励学生无论设想是否正确都要积极去做，科学的路上本来就充满挫折，失败是很正常的，使学生更加愿意按照自己的设想去做实验，久而久之增强了学生的实验设计能力和创新能力，从长远来看必将推动我国甚至世界生物科学的发展。

2.及时的更换实验内容。

科学技术在不断的进步，生物科学也不例外。在生物学实践教学的路上必须不断丰富实验内容，及时的让学生学习到世界先进的研究成果或者优良的研究方法。学校可以根据本校学生的实际情况，适当增加实验的难度，在安排实验的时候尽量多一些创新性的实验减少验证性实验的比例，因为相对应于验证性实验，创新性的实验更加有利于培养学生的创新能力和生物研发能力，创新性实验提前不知道实验结果，学生带着问题和好奇去做实验，而验证性实验学生在做实验之前就已经知道了本实验的实验结果，只是通过一定的方法验证结论即可，此外创新性实验的实验结果不唯一，有利于培养学生的发散思维，根据自己对实验现象的不同理解，从不同的角度得出不同的实验结论。实验是一个实践性的教学，更改实验内容光从改变这些实验的理论是不够的，还必须要求实验硬件的配合，增加在实验方面的投资，购买一些先进的实验设备，聘请一些国内外知名的生物学教授来学校进行教师的培训或者办学生讲座，软件和硬件双管齐下才能达到更换实验内容目标，最终提高基于实践的细胞生物学教学效果。

3.老师根据学校现有的物质条件，合理的安排实验内容。

虽然我们在细胞生物学的教学过程中，大力支持和发扬实践教学，也就是将课堂做生物实验作为教学的主要形式，学生通过做实验，将理论与实践结合起来，并从中锻炼自己实际解决问题的能力，甚至创造出一些科技成果来，但是，我们也不能盲目的追求实验教学，因为大多数实验尤其是生物实验需要非常先进的设备，有的还需要珍贵的材料做实验标本，这会无形之中提高学校的教学成本，不利于学校的可持续发展，所以，必须将实践教学与学校的实际办学条件紧密结合起来，老师根据目前学校目前拥有的先进设备和实验标本合理的安排实验，保证将现有的资源合理利用，对于那些必须的先进生物设备和实验标本老师应该向上级部门提出申请，希望学校能尽力满足。

细胞生物学研究范文第2篇

关键词：TBL；教学模式；细胞生物学；实验

中图分类号：G642.4 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）11-0257-03

细胞生物学不仅是生命科学的重要基础学科之一，也是现代医药学、生物技术领域、畜牧业、水产养殖等行业的重要基石。同时，它还是一门实验性较强的学科，通过实验可以让学生将理论知识融会贯通。一直以来，细胞生物学实验“以教师为中心，以验证为中心”的旧教学方式大大地阻止了学生实验的积极性和创新性。要怎样改变细胞生物学的实验教学来培养学生主动学习知识、独立思考问题，以及运用实验手段来探索生命的本质和现象，目前是细胞生物学实验教学改革需要思考的问题。以团队为基础的学习（team-based learning，TBL）是上世纪70年代的美国Oklahoma大学Larry K Michaelssen教授创立的。与传统的以授课为基础的学习（lecture-based learning，LBL）教学模式有着很大的不同。TBL不再是以教师讲授为中心，而是以学生自主学习为中心，以学生团队式合作学习为主，注重培养学生人际交往能力，培养主动发现问题并解决问题的能力，是一种有效促进学习的新型教学模式。目前，TBL教学模式已在我国中山大学、三峡大学等高校广泛应用，特别是在临床、解剖等医学基础课程和信息素质教育课程的教学中已得到普遍认可。虽然在我国已有很多院校在不同程度上开展了TBL教学法的探索和研究并得到不同程度的好评，但没有得到推广和应用。针对细胞生物学实验课程的性质，将TBL教学法应用到细胞生物学实验课程中，拟为TBL教学模式在《细胞生物学实验》课程中的推广进行一些探讨，提供一些思路。

一、TBL教学模式设计与实践

细胞生物学实验课程教学以理论课程为基础。理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设此课程的宗旨是使学生掌握细胞生物学实验设备的操作方法。使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生动手和科研能力。

1.团队组建。将我院2011级生物科学本科班60名学生分为15组，其中每组为4人。分组时对组内成员进行调配，以达到组与组之间的均衡，再由成员分推选出一名组长，小组必须合理组织，合理管理，组员需要有责任意识。分组时要遵循的原则是既要使小组内的各种资源均衡，还要保持小组内成员稳定不变，减少影响小组内部凝聚力的因素。

2.教学准备。根据《细胞生物学实验》教学大纲要求，教师将需要了解与掌握的内容提纲预先告知学生，在TBL教学之前让学生对将要开展的实验进行预习。运用TBL教学法，学生根据老师拟定的教学提纲，实验室具备的实验器材，结合课程内容，进行实验前的自我研读和仪器、材料准备。充分体现以学生为主体，提高学生主动性的要求。

3.教学实施。（1）个人测试。在课堂开始的前十分钟，给每位学生发放一份复选题，题目覆盖此次实验课的实验目的、实验原理、操作步骤及其注意事项，要求学生运用之前所学到的知识来完成。之后参照分组，各组共同回答同样的复选题测验，并交出共识建立之后的答案，最后老师来分析、总结。个人测试有助于教师了解学生学习知识的情况，有利于教师调整和安排教学进程。（2）组间交流。接着进行组间交流发言，其中某一小组选举一名代表，上讲台把本组觉得重要内容、必须重视的注意事项向其他组的同学汇报，其他组的同学与该组交换意见，共同寻求保证实验成功的可行性方法。教师在一旁听证，记录各小组在讨论中存在的问题、小组的发言次数及发言的质量。在此过程中，教师应鼓励不爱发言的学生发言，参与到讨论中，必要时对不发言的学生进行有针对性的提问。（3）实验进行。实验进行过程中教师要注意培养学生的创新精神和能力。及时指导学生对实验进行阶段性总结。教师总体掌控任务的执行，注意随时为学生调整实验任务，让学生就实验内容进行深入的思考，发现实验探索生命本质成功的关键。实验结束后，要求学生及时记录实验结果，最后各组选派一名代表展示实验结果，对实验结果进行分析，优秀学生带动差生，综合提高班级水平。评估提高实验结束后收集实验结果，要求学生对实验结果进行分析、讨论，最后撰写实验报告。

二、TBL教学调查研究

研究采用问卷调查。课程结束后对全班学生进行调查。教师参考相关研究后设计调查问卷。调查问卷包括：实验前是否进行课前预习；是否有利于提高文献检索能力；是否有利于提高人际交往能力；是否有利于提高学习主动性；是否有利于提高实验动手能力；是否有利于增强团队协作意识；今后是否继续使用TBL教学模式等问题。

三、结果

60份调查问卷全部收回，收回率100%，其结果见表1。调查结果98.4%的学生认同TBL教学法能调动学生学习积极性，98.4%的学生认为能提高文献检索能力，95.1%的学生认为能提高人际交往能力，96.8%的学生认为能促进课前预习，96.7%的学生认为能提高动手能力，96.7%的学生认为能增强团队协作意识，96.7%的学生认为能使他们建立自主学习的观念，96.8%的学生认为TBL教学法能使课堂教学气氛活跃，95.1%的学生认为能更好地使他们理解课堂内容，91.7%的学生认为TBL教学法能及时解决学习问题，95.0%的学生认为能提高学生运用所学知识的能力，98.4%的学生认为今后应继续使用TBL教学模式。

四、讨论

细胞生物学实验传统的教学主要以教师讲解理论知识，学生验证为主。学生被动地学习知识技能，不能激发学生的积极主动性。而采用TBL教学模式在教学中的优点与不足具体讨论如下：

1.使实验课教学能在更高层次提高学生的动手能力。调查结果表明有96.7%的同学对提高学生的动手能力表示认同。与传统教学模式相比较，TBL教学模式更注重学生的主体性，教师精心设计一系列必要的知识内容，促使学生课前预习实验内容、操作步骤、注意事项，查阅相关文献资料解答疑惑，使其理论知识得到不断巩固与加强。学生用更多的时间去验证实验，可以发现自己在实验中的不足，激发学生去改正并且提高实验操作能力。

2.向后进生提供帮助与支持。TBL教学模式以团队为单位，小组成员无论是理论还是实验操作技能存在不足的，都会在个人测试，团队交流、讨论中显现出来，发现有知识点或是实验操作有不足之处的，老师或者其他懂的同学可以及时指导。所以，TBL教学模式能给后进生提供支持和帮助，能获得较大容量的学习知识。

3.培养学生的团队协作和人际交往能力。调查结果表明有96.7%同学对能提高团队协作认同，有95.1%的同学对能提高人际交往能力认同。在TBL教学中，教学任务的完成主要是通过团队协作来完成，这有利于提高学生团队合作的精神。在整个过程中，小组的每个成员都需要参与到问题的分析和解决中去，并通过相互的沟通来达成共识[5]。TBL教学模式中，小组内成员合作学习，取长补短，共同完成组内任务，这一过程培养了学生团队协作意识[7]。

4.树立并保持教师的工作热情。采用TBL教学法对细胞生物学实验课进行教学，教师不仅要把需要讲解的知识点全部熟悉，还要理解相关的其他学科知识，花更多的时间去准备测试题和相关资料。对教师来讲，教师是引导者和组织者，通过与学生共同参与讨论，教师也从中获益，实现教学相长式的终身学习，从而提高了教学效率[6]，树立并保持了教师的工作热情。

5.真正让学生主动学习。调查结果表明有98.4%的同学对TBL能调动学生学习的主动性认同。在TBL教学过程中，学生以讨论式学习和互教式的拓展性学习，真正做到以学生为中心。例如学生从实验课开始之前就需要自己根据教师给出的学习任务，自我研读掌握知识。实验过程中亲自动手实验，不明白的地方由学生向老师提问。老师在回答之前，先请其他学生来回答，这样可以增加互动。

6.节省课时，提高课堂效率。TBL教学采用课前给学生下达学习任务，学生以团队合作方式进行自我研读，这一环节大大缩短了教师课堂上的讲授时间，留有更多时间让学生测验、团队合作学习、团队讨论，提高了课堂效率。

7.TBL教学法在细胞生物学实验教学具体实施过程中的不足及展望。TBL教学对教学设备、教学场所、教师个人素质等提出了更高要求，首先，要求教师对本专业知识融会贯通，教师个人素养高，教学技能出色，并要具备良好的组织管理能力以及控制实验进行的能力。其次，教师对学生的学习兴趣、学习态度、能力和责任感等很难在短期内较为全面和准确的把握。当发现一些小组成员搭配得不恰当时。已经来不及重新分组，这就会造成组间成绩有一定差异[5]。另外，TBL教学法的特点是以小组讨论形式开展教学，1位教师组织TBL教学，心有余而力不足，不能有效地参与到每一个小组的讨论和实验指导中去，这样也会影响到TBL教学的效果。虽然TBL教学在《细胞生物学实验》中推广还存在一些问题，还有待今后不断地探索和完善。但TBL教学模式教学有利于提高学生的学习积极性、主动性以及动手能力和科学研究能力，能有效促进学生培养团队协作精神，同时更新了教师的教学理念，促进了师生之间交流，提高了细胞生物学实验的教学质量[5]。调查表明有98.4%的学生赞同在今后教学中继续使用TBL教学法。

参考文献：

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细胞生物学研究范文第3篇

    虽然近年来对大肠癌治疗的研究已经取得了很大进展，但始终不能改变其发病率和死亡率高的特点，对患者预后亦无明显改善。因此，本研究探讨δnp73基因的高表达对大肠癌细胞生物学行为的影响，为临床防治大肠癌提供较可靠的理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    lovo细胞株及真核表达质粒pcdna3δnp73均由第三军医大学大坪医院肿瘤科惠赠。rpmi1640培养基、小牛血清购自hycolone公司。胰蛋白酶购自sigma公司。millicell chamber购自millipore公司。四甲基偶氮唑蓝(mtt)、青霉素、链霉素均购自gibco试剂公司。vegf试剂盒购自r&d公司。

    1.2  lovoδnp73细胞株的建立

    以人类大肠癌细胞株lovo细胞为研究对象，将构建于真核表达质粒pcdna3δnp73基因用脂质体法转染lovo细胞，用g418沉筛选出过表达δnp73基因的细胞株，命名为lovoδnp73细胞株；同时以空载体pcdna3转染细胞，命名为lovopcdna3。

    1.3  台盼兰活细胞记数测定细胞的增殖能力与细胞活力

    胰酶消化收获细胞（含悬浮及贴壁细胞）制备单细胞悬液，以冷pbs悬浮，细胞浓度为1×105/ml。取9滴细胞悬液移入小试管内，加1滴0.4%台盼兰工作液，混匀，在3min内用血球记数板分别记数活细胞和死细胞。

    1.4  细胞增殖曲线mtt测定

    取对数生长期细胞悬液200μl/孔（含2×103个细胞）接种至96孔板，于37℃、5% co2、饱和湿度培养箱，每组每天取3个复孔，每孔加入20μlmtt（5g/l）培养4h后弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)200μl，振荡10min溶解结晶紫。酶联免疫检测仪测定490nm波长各孔光吸收值（a490值）。

    1.5  流式细胞仪检测细胞凋亡

    将lovo细胞制备成单细胞悬液，收集到5ml离心管中，离心，2 000g，5min，室温，冷pbs洗涤2次，离心，2 000g，5min，弃上清。再以冷pbs悬浮，细胞浓度为1×106ml。加5ml annexin vfitc溶液和2.5μl pi到100μl细胞悬液中，混匀后室温避光反应30min。加入反应缓冲液400μl，流式细胞术对凋亡细胞进行定量检测。

    1.6  boyden小室体外侵袭实验

    用改良的boyden小室法[1]：用人工基质覆盖millicell chamber滤膜上的微孔，向小室内加入1×105/ml的细胞悬液, 培养 12h 后取出滤膜, 将下室面的细胞刮下，将膜固定，结晶紫染色细胞，高倍镜下随机取5个视野,计数细胞,取平均值。

    1.7  westernblot检测vegf蛋白表达

    按照ripa蛋白提取步骤提取细胞总蛋白,采用bradford法测定总蛋白浓度。取总蛋白40μg行sdspage,电泳结束后电转印17h至pvdf膜,膜封闭液内封闭室温1h,4℃过夜,pbs洗膜5min×4,加入兔抗人vegf单克隆抗体(1∶350),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,再加入羊抗兔igg(1∶2 000),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,化学发光试剂与pvdf膜共同孵育1min,将pvdf膜与x光片共同放暗盒曝光4min,显影3min,定影10min。以gelproanalyzer凝胶定量分析软件分析westernblot检测结果,得出各条带的灰度值,以平均灰度值代表vegf蛋白表达水平。

    1.8  统计学方法

    数据结果以±s表示,采用t检验, spss10.0统计学软件进行分析。

    2  结果

    2.1  台盼兰拒染实验

    台盼兰拒染实验中活细胞不染色，而死细胞染蓝色。结果显示δnp73转染后lovo细胞的死细胞比例为（4.6+1.1）%,较lovopcdna3组（7.5+0.8）％明显减少，差异有统计学意义（p<0.01）。

    2.2  mtt法测定细胞生长曲线

    mtt结果显示，转染δnp73的lovo细胞较转染空载体pcdna3的lovo细胞组和空白对照组细胞生长明显增快，差异有统计学意义（p<0.01），见图1。

    图1  mtt法测定细胞生长曲线

    2.3  基因转染对大肠癌细胞凋亡率的影响

    fitcpi流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示转染空载体pcdna3的lovo细胞组凋亡率为（5.8＋1.2）％，而转染δnp73的lovo细胞组的凋亡率为（2.4＋0.8）％，与lovo/pcdna3组对比凋亡率明显降低（p<0.01），见图2。

    图2  δnp73转染对lovo细胞凋亡的影响

    2.4  boyden 小室体外侵袭实验

    lovo、lovopcdna3 和 lovoδnp73细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为（21.4±0.1）、（22.8±0.4） 和（39.5±0.6）, lovoδnp73 细胞与lovo 细胞和 lovopcdna3细胞比较, 穿膜数量明显增加, 两者间差异具有统计学意义(p<0.01) 。而lovo细胞和 lovopcdna3细胞穿膜数的差异无统计学意义(p>0.05) 。

    2.5  vegf蛋白表达westernblot检测结果

    vegf蛋白表达westernblot检测结果见图3。转染pcdna3后lovo细胞中vegf蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05),而转染δnp73能使vegf蛋白表达水平升高,灰度值上升，与未转染p73基因的细胞相比上升了44.2％，差异有统计学意义 (p<0.05)，见表2。表2  转染δnp73前后lovo细胞中vegf蛋白含量

    3  讨论

    研究表明δnp73因为n末端转录活化区缺失导致转录活化功能完全丧失,对p53和全长型p73的转录活化和促凋亡活性有明显的负调节作用[2,3], δnp73除与大肠癌的发生、发展关系密切外，对神经母细胞瘤也是一个预示较差预后的分子标志[4]。但在某些肿瘤中，如甲状腺肿瘤，δnp73却有着抑制增殖的作用[5,6]。由于δnp73基因在不同的肿瘤中对细胞凋亡和血管生成的影响不同，因此本实验以δnp73基因在对大肠癌细胞的生长、凋亡率、体外侵袭性以及对血管调节因子的表达调节作为主要切入点进行了研究。

    本实验采用台盼兰拒染、mtt测定对转染后细胞的体外生长情况进行了分析。台盼兰拒染、mtt测定均可反映细胞的增殖情况，但作用的机制与侧重点不同。台盼兰是一种有机染料，当细胞损伤或死亡时，可透过细胞膜与解体的dna结合，使其着色，而活细胞阻止其进入，借此可鉴别活细胞和死细胞。本实验用该方法测定细胞的总数与存活率。mtt是一种淡黄色的化合物，它参与活细胞线粒体的能量代谢。在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将mtt还原成难溶性的紫兰色结晶物formazan并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。在一定的细胞范围内，mtt结晶物形成的量与活细胞数成正比。dmso能溶解细胞中蓝紫色的结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可以间接反映活细胞数量。我们认为，台盼兰拒染实验操作简单，方便快捷，但结果受人为因素影响较多。mtt法较客观准确，是一种较好的判断细胞增殖的指标，而boyden 小室体外侵袭实验，则为检测大肠癌细胞转染δnp73基因后的侵袭力改变提供了直接证据。本实验将3种实验方法的结果相结合分析更具准确性和说服力。进一步流式细胞分析提示δnp73基因转染lovo后细胞凋亡比例明显减少。这一结果提示δnp73基因过表达可以促进大肠癌细胞的恶性增殖，其可能的机制是δnp73的过表达通过影响p73的反式激活而导致其启动子活性的减弱,抑制p73诱导的凋亡[2]。

    除了上述指标，目前，对大肠癌的细胞生物学行为的研究中还有一个研究热点就是肿瘤血管生成 [7]。vegf是迄今鉴定出来的最重要的促血管生成因子之一,vegf能特异地与血管内皮细胞上vegf受体结合,刺激内皮细胞增殖并促进血管形成。因此,vegf是反映大肠癌细胞生物学行为的良好指标。在本研究中, 采用westernblot法检测高表达δnp73的细胞中的vegf蛋白表达水平,发现过表达δnp73大肠癌细胞株中vegf蛋白的表达较对照组明显增高,表明δnp73的高表达打破了血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡,从而促进了血管生成。其可能的机制是当大肠癌发生时,抑制因子表达下调、刺激因子上调,并伴随着癌基因激活和抑癌基因失活从而促使病理性血管生成[8,9]。本实验结果提示δnp73的高表达能促进大肠癌血管生成，增强了其侵袭和转移的能力，这也给我们今后对大肠癌临床治疗研究提出了一个思路和课题：有效的抑制δnp73的过度表达，可以在基因水平上抑制大肠癌血管的生成，从而对癌肿的生长和侵袭起到有效的抑制作用。

    综上所述，δnp73以高表达的方式参与大肠癌的发生发展，抑制大肠癌细胞凋亡，上调血管生成因子vegf的表达，促进了大肠癌血管增生，增强了大肠癌细胞的侵袭性。鉴于δnp73基因对大肠癌细胞的这些影响,我们认为，对δnp73进行检测，有利于从基因水平了解大肠癌的发生机制和生物学行为，从而对大肠癌作前瞻性估计，为临床上对大肠癌的诊断、鉴别诊断、治疗及预后判断提供重要的参考指标，同时，还可将δnp73作为新的肿瘤治疗靶点进一步深入研究。

【参考文献】

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细胞生物学研究范文第4篇

[关键词] 牙囊细胞； 基因转染； 端粒酶； 成骨分化； 增殖

[中图分类号] Q 813 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.002 牙囊细胞（dental follicle cells，DFC）来源于形成牙周组织始基的牙囊[1]，系牙周组织工程研究中受到广泛关注的种子细胞之一[2]。数量丰富并且细胞表型

和生物学性质稳定的种子细胞是牙周组织工程研究的前提[3]，但是牙囊细胞体外培养的数量较少，容易

失去自我更新能力发生老化。通过转染外源性基因片段至目的细胞可以抑制细胞的衰亡，使有限的生命细胞转化成为具有长期传代能力和稳定表型的细胞。

猿肾病毒SV40大T抗原（simian virus 40 large tu-mor antigen，SV40Tag）是较常用和有效的外源性基

因之一[4]，目前国内外已成功将其用于牙骨质细胞

以及牙周膜成纤维细胞[5]的永生化构建。本研究将

SV40Tag基因片段转染至体外培养的SD大鼠牙囊细胞，对其传代增殖能力和抗衰老能力、成骨分化及细胞增殖等生物学特征进行观察和检测，为牙周组织工程研究的种子细胞来源提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1周龄SD大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，含SV40Ta段质粒pSSR69、pAmpho、293细胞均由重庆医科大学基础医学院罗进勇教授惠赠，胎牛血清、DMEM培养基（Hyclone公司，美国），胰酶、Ⅰ型胶原酶、脂质体2000、二甲基亚砜（dimethyl sul-foxide，DMSO）、聚凝胺（polybrene）、潮霉素（hygro-mycin）（Sigma公司，美国），端粒酶逆转录酶（telome-rase reverse transcriptase，TRT）抗体、山羊抗兔二抗、甘油醛三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Cell Signaling Technology公司，美国），焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）（Bio Basic公司，美国），Rever Tre Ace-a-逆转录试剂盒、SYBRGreen逆转录试剂盒（Toyobo公司，日本），琼脂糖（TaKaRa公司，日本）。

1.2 牙囊细胞体外培养及SV40Tag基因转染

将SD大鼠引颈法处死后取出下颌第一磨牙牙胚，分离出牙囊组织立即置入DMEM培养基并剪成l～2 mm大小的组织块。加入0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴消化1 h，0.25%胰蛋白酶消化5 min，离心弃上清液。加入DMEM培养基3 mL转入培养瓶。5%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养，2～3 d换液1次，细胞生长形成单层后常规消化传代并鉴定细胞来源。37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞融合至75%～80%时胰蛋白酶消化传代。

利用293细胞包装病毒构建含SV40Tag的逆转录病毒载体，制备重组逆转录病毒并转染至SD大鼠牙囊细胞。方法：将293细胞按30%～40%密度铺于T-25细胞培养瓶，待细胞贴壁（8～12 h）后，设置转染体系，将含有SV40Ta段的pSSR69质粒1～2 μg、pAmpho质粒0.5～1.0 μg、脂质体2000 15 μL、DMEM（无血

清、无双抗）250 μL混合均匀，室温放置15～20 min。将T-25细胞培养瓶中293细胞用3 mL无血清、无双抗的DMEM洗涤2遍，再加入无血清、无双抗的DMEM 2.5 mL。将设置好的转染体系加入细胞培养瓶，轻柔混合均匀。3～5 h后，将培养瓶中的培养基换成完全DMEM 4 mL，在继续培养36、60、84、108 h后，分别收集细胞上清液（含有转染体系），合计收集约16 mL，低速离心5 min去除细胞悬液，0.22～0.45 μm醋酸纤维膜滤器过滤，4 ℃保存备用。将牙囊细胞按20%～30%密度铺于T-25细胞培养瓶，等待细胞贴壁。在含有转染体系的293细胞培养上清液中加入80～100 μL聚凝胺，吸取SD大鼠牙囊细胞培养基，换成含有转染体系的细胞培养上清液4 mL，6～8 h后吸出上清液，再加入含有转染体系的细胞培养上清液

4 mL，过夜培养，第2天换成完全DMEM 4 mL，培养4 h。2 μg・mL-1潮霉素筛选。

1.3 细胞形态学观察

以转染SV40Tag后的DFC为实验组，正常DFC为对照组，连续传代至60代。在倒置相差显微镜下观察2组的细胞形态及生长状态。

1.4 转染SV40Tag基因前后DFC端粒酶表达的检测

细胞中端粒的长度会随着细胞分裂逐渐缩短，进而衰老死亡，因此维持端粒的长度成为阻止细胞衰老的方法之一[12]。本研究对转染SV40Tag前后的DFC细胞进行TRT检测，发现实验组TRT灰度值明显高于对照组，证明转染SV40Tag后DFC的端粒酶被激活，端粒长度增加，提示转染SV40Tag后的DFC具备抗衰老的特性。

转染SV40Tag后的DFC获得了极强的传代和抗衰老能力，但其成骨分化和细胞增殖特性与正常牙囊细胞有无差异尚需要进一步的研究。ALP是细胞向成骨细胞分化的早期标志[13]，OC是成骨活性细胞分化晚期的重要标志[14]，Runx2基因是成骨细胞分化的

特异性转录因子[15]，BMP2通过信号转导上调成骨

调控基因的转录直接及间接地促进成骨分化[16]。本

实验结果表明，实验组与对照组细胞内ALP、OC、BMP2、Runx2的表达均无统计学差异，说明SV40Tag转染大鼠DFC后成骨早期和晚期分化能力以及成骨特异性因子的转录与正常牙囊细胞均无明显差异，保持了相对一致性。IGF和bFGF[17]作为一种多肽生长因子，可促进细胞在同一生长周期内的增殖活性。本研究结果显示，大鼠DFC转染SV40Tag基因前后的IGF-1及bFGF表达水平均不具有统计学差异，表明转染SV40Tag后大鼠DFC在细胞周期内增殖活性与正常牙囊细胞无明显差异，保持了功能状态的稳定。

本研究通过转染SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊细胞，对其生物学特性观察检测，结果发现转染SV40Tag后的DFC获得了无限传代增殖和抗衰老的能力，染色体端粒长度得以维持。同时该细胞保持了与正常牙囊细胞相对一致的成骨分化特性和增殖活性，表明其生物学性质稳定，有望成为牙周组织工程研究中较理想的种子细胞来源。

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细胞生物学研究范文第5篇

[文献标识码]A

[文章编号]1006-1959(2009)07-0280-02

肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,长期危害着人类健康。近十年来,对肾细胞癌的分子生物学研究取得了长足的进展,使我们对肾细胞癌有了更深刻的认识。本文就肾细胞癌各种病理分型的分子生物学研究进展进行综述。

1肾细胞癌发生的分子生物机制

肾癌的发生发展是多阶段、多步骤的过程,包括癌基因激活和抑癌基因(tumorsuppressorgene,TSG)失活在内的一系列遗传学改变。抑癌基因的缺失或失活是肿瘤发生发展过程中重要的分子事件之一。肿瘤常在抑癌基因位点出现染色体基因缺失,表现为等位基因杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH),通过检测分析肿瘤LOH及其规律,可在染色体一定范围内发现肿瘤的抑癌基因及易感基因。为了能较全面的了解导致肾细胞癌发生发展的关键分子事件,不同学者对肾细胞癌全基因组进行了不同的研究,发现肾细胞癌发生高频率LOH主要见于以下几个染色体:3p、5q、8p、9p、10q、14q、17和18q染色体。

1.13号染色体:3号染色体短臂的部分缺失是肾癌基因改变中的高发事件。其中定位于3p25-26的VHL抑癌基因被认为是这些基因改变的首要目标。在以前的研究中,VHL在肾透明细胞癌(cc-RCC)中的失活机制主要为等位基因缺失和突变,DNA超甲基化很少见。刘宁等利用PCR限制性片段长度多态性法对3号染色体上的VHL基因的两个单核苷酸多态性位点进行检测来分析VHL基因的杂合性缺失失情况,发现,42%(8/19)发生VHL基因LOH,并未发现VHL基因失活与肿瘤的分期、分级存在联系。

有杂合性缺失研究显示,有可能在染色体3p上存在另外的RCC相关抑癌基因。定位于染色体3p14.2上包含最常见的FRA3B脆性位点的FHIT基因作为候选抑癌基因日益受到关注。Velickovic等通过选择性的检测FHIT区域的LOH发生情况认为这个基因在ccRCC的发展过程中起到很重要的作用。并且发现在cc-RCC中染色体3p的LOH发生率达76%。Farkas等对88例肾细胞癌病例进行LOH研究,选取了3p14.2-p25范围内16个位点采用PCR技术进行LOH分析,结果显示VHL基因和FHIT基因区域,透明细胞癌的LOH发生率高达96%,而状细胞癌和嫌色细胞癌仅为10%和18%,并且LOH的发生率与肿瘤大小、分期、分级无关。从而认为VHL和FHIT的等位基因缺失是肿瘤发生的早期事件。

1.25号染色体:1986年APC基因首次在一位患有息肉病及多种其它先天性畸形患者的5号染色体长臂片段先天性中间缺失中得到证实,确切的基因位点随后由定位克隆确定。Pecina-SlausN等利用相对外显子11和15的特殊寡核苷酸引物对36例肾细胞癌病例进行限制性片段长度多态性的检测,了解与APC基因相关的LOH情况,并同时检测APC蛋白的表达情况。研究发现36例样本中有33例为信息性病例,其中有17例出现LOH,并且LOH的发生与年龄以及肿瘤的TNM分期呈正相关。但并不是所有出现LOH的病例都有APC蛋白的表达。从而认为APC基因与肿瘤的进展有着密切关系,可能不是肿瘤发生的早期事件。

1.38号、9号染色体:Presti等学者对72例肾透明细胞癌进行LOH测定,并将LOH作为临床预后指标的评估,他们选取了3p,8p,9p,14q四个不同的染色体,在每个染色体上选取两对引物,结果显示8p、9p的LOH发生率与肿瘤复发率正相关。由此推测8p、9p的LOH可作为判断局部进展型肾癌预后的一个指标。

近年来许多学者在多种肿瘤,如肺癌、食管癌、黑色素、胃癌、成神经细胞瘤等研究中均发现,9号染色体常出现较高频率的LOH,所以推测9号染色体上存在不止一个与这些肿瘤的发生相关的抑癌基因。Fukunaqa等利用荧光多重PCR技术比较提取自肿瘤组织和对应的外周血液样本中的DNA,通过对9号染色体上的13个位点进行分析,发现109例肾细胞癌中27例至少有一个位点出现LOH,其中最高发生率出现在PTCH基因所在的9P22区域。而Sanz-casla等对40例单发肾细胞癌病例同时进行p16基因附近染色体9p21区域的LOH和p16基因启动子超甲基化的检测,出现LOH的为9例,超甲基化的为8例但是两者之间没有必然联系由此推测p16基因的失活和其他未知的抑癌基因共同参与肾细胞癌的发病机制。Grady则通过对60例肾细胞癌病例进行9号染色体上的16个微卫星位点的LOH分析,60例样本中至少一个位点出现LOH的为44例,主要缺失区域出现在位于9p21的DS171、D9S1749和DS270上。有46%的病例在9q32-9q33出现LOH,在这一区域的D9S170位点LOH发生率达22%,研究认为除了在9p21附近的p16候选抑癌基因外,在9p21以及9q32-9q33附近很有可能存在其它的抑癌基因。

1.410号染色体：Velickovic等对10号染色体上与PTEN/MMAC1抑癌基因相关的7个微卫星标记物LOH发生率进行分析，其中肾透明细胞癌的LOH发生率为37.5%，状细胞癌为29.7%，嫌色细胞癌为87.5%，且LOH发生率与肿瘤的分期、分级和生存率有关，并且认为双等位基因失活的发生多由非点突变畸变导致。

1.514号染色体：Kaku等对染色体14q24-31区域的7个微卫星位点进行研究，发现42例信息性病例中23例（54.8%)出现LOH，并发现LOH发生最普遍的区域位于D14S67附近的2-Mb范围，且LOH的发生率与肿瘤分期呈正相关。同样Alimov等利用2个RFLP位点对45例肾细胞癌患者进行研究，发现45例信息性病例中17例（38%）在染色体14q31-q32.2上出现LOH，并且LOH的发生率与肿瘤的分级和低生存率正相关。而Gallou等的实验则将14q上的普遍缺失区域定位于D14S281到D14S277之间。另外有学者对130例肾透明细胞癌病例采用D14S588、D14S617、GATA136B01三个位点进行LOH分析，数据显示LOH发生率与肿瘤大小、组织学分级、生长速度以及致死率呈正相关。

以上关于14q染色体的LOH研究均显示与肿瘤的分级和低生存率呈正相关关系，表明肿瘤的14qLOH很可能与肿瘤的侵袭发展有关。

1.617号染色体：p53基因位于17p13.1上，具有反式激活功能和广谱抑癌作用，与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关。因此研究染色体17p上TP53位点的LOH情况对于揭示P53在肿瘤发生过程中发挥的作用意义重大。在29例肾细胞癌中，W.M.L.报道了关于P53的杂合性缺失为48%(14/29)，并通过序列测定确认单链构象多态性而发现了有11例出现突变。Ogawa等利用p53基因附近的5个多态性探针对48例肾癌进行研究，发现染色体17p的等位基因缺失率为17%(6/36)，并且染色体17p的等位基因缺失与肿瘤分期无确切相关性。其他研究者发现在17号染色体上还存在着其它LOH发生区域。Khoo等对BHD基因区域的2个微卫星位点D17S740和D17S2196进行检测，28例肾细胞癌中10例（36%）出现LOH，其中6例嫌色细胞癌中2例（33%）出现LOH，6例状细胞癌中出现5例（83%），透明细胞癌12例出现3例（25%）。并推测BHD基因可能在肾脏肿瘤的发生发展中起重要作用。而Simon-kayser等对处于17q11到17q23之间的7个微卫星标记物进行检测，15例状肾细胞癌中14例为信息性病例7例出现LOH。发生频率最高的为与FBXO47候选抑癌基因相关的D17s250位点。

1.718号染色体：Hirata等对126例肾透明细胞癌病例进行研究，通过对染色体18q上的9个微卫星位点实验，发现24例(19%)发生LOH，LOH最高发生率出现在DCC基因所在的18q21.3区域，并发现LOH的发生率与性别、肿瘤分期、分级、等参数无关。认为DCC和SMAD4可能做为候选抑癌基因与肾透明细胞癌的发生有关。 2肾细胞癌的病理分型与分子生物学机制

1997年国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合委员会(AJCC)根据已知基因改变以及肿瘤细胞起源，并结合肿瘤细胞形态特点将肾癌分为透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma)、状肾细胞癌(papillaryrenalcellcarcinoma)、嫌色细胞癌(chromophoberenalcellcarcinoma)和集合管癌（carcinomaofthecollectingducts）4种基本形式。约有4％~5％肾癌细胞形态及遗传学改变不一，细胞成分混杂或有未识别的细胞成分，此类肿瘤归为未分类肾细胞癌（renalcellcarcinoma，unclassified），有待今后进一步研究。由于在各型肾癌组织中都可见到细胞质中含有嗜酸颗粒或梭形细胞成分，所以在新分类中取消了颗粒细胞癌和肉瘤样癌。

肾透明细胞癌或称为传统的肾细胞癌或非状肾癌，约占70％~80％，是最常见的病理类型，起源于肾近曲小管。已明确的遗传学改变是以3p缺失、VHL基因突变、甲基化或缺失为特征，此外尚有不十分明确的改变。综合国内外文献报道，常见的染色体缺失区域包括4q、6q、9p、13q、Xq、8p，常见的染色体扩增区域包括5q、9q、17p、17q。Jiang等利用分枝树模型及时间树模型对肾癌比较基因组杂交数据进行分析后认为透明细胞癌至少可能分为两个亚型，一型伴有-6、+17p、+17q，另一型伴有-9p、-13q、-18q。-4q是透明细胞癌发展过程中除-3p外的另一重要早期事件，-8q多出现在转移灶中，是原发性透明细胞癌的一个晚期事件，9p、13q上可能存在与肾癌进展相关的抑癌基因。

状肾细胞癌或称为嗜色肾细胞癌或肾小管状癌，约占10％一15％，是第二常见的肾恶性肿瘤，可能起源于肾近曲小管。遗传学上，以Y染色体丢失、7号染色体和17号染色体的三倍体或四倍体异常为特征，此外较典型的分子遗传学异常尚有C-MET基因活化、+12q、+16q、+20q、-1P、-4q、-6q、-9p、-13q、-xp、-xq、-Y等。Delahunt和Eble在1997年应用免疫组化方法分析91例状肾细胞癌，根据形态学改变分为2型，1型状肾细胞癌光学显微镜下呈管状结构，被覆小细胞，含有卵圆形小细胞核，核仁不显著，胞质少、灰白。2型状肾细胞癌为状结构，被覆丰富嗜酸性胞质的大细胞，含有大球形细胞核。分析结果显示：7号染色体和17号染色体倍体异常多见于状肾细胞癌1型，而-Xp常提示预后不良。与透明细胞癌相比，状肾细胞癌的多灶性或双肾癌更常见。

嫌色细胞肾细胞癌约占5％，起源于肾集合小管暗细胞。遗传学以多个染色体丢失和单倍体为特征，LOH常发生在1、2、6、10、13、17或21号染色体。

肾集合管癌少见，起源于肾髓质或肾的中央区集合管上皮，遗传学上的改变无统一形式，以染色体18、21和Y染色体单体丢失以及染色体7、12、17、20的多倍体异常较常见。