细胞生物学特性

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细胞生物学特性范文第1篇

关键词：5-aza-dc；延边奶山羊；细胞活率；细胞形态；细胞凋亡

中图分类号：S827 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）12-2862-04

Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell

CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，FNAG Nan-zhu，LI Zhong-shu

（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.

Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis

体细胞核移植是哺乳动物胚胎工程的主要组成部分，也一直是研究的热点。然而核移植研究中仍然存在着许多问题，如核移植效率低、胚胎发育异常、流产、畸形等。大量研究表明，体细胞核移植所用的供体细胞（成纤维细胞、颗粒细胞等）都是高度分化的细胞，具有较高的甲基化水平，在与受体细胞融合时需要经过去甲基化才能维持胚胎正常发育，如果重构胚基因组DNA的甲基化模式存在异常，可引起特定基因转录模式发生改变，从而导致重构胚发育异常。因此，有必要寻找一种降低DNA甲基化水平，进而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脱氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一种DNA甲基转移酶抑制剂，为正常胞嘧啶核苷的类似物。在细胞内这种核苷类似物可以转化为脱氧核苷三磷酸，并在DNA复制的过程中替代正常的胞嘧啶核苷酸参与到延伸的DNA链中，一旦进入DNA双链后，它们所含有的修饰碱基——5-氮胞嘧啶可以与DNA甲基转移酶共价结合，使酶的活性降低，最终使处理细胞基因组DNA发生去甲基化；有研究表明DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理牛供体细胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金辉[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）处理水牛成纤维细胞，显著降低了供体细胞的甲基化水平并提高了随后核移植的效率。延边奶山羊耳成纤维细胞作为延边奶山羊体细胞克隆的核供体有重要的研究意义。因此，本研究旨在探讨5-aza-dc对延边奶山羊体细胞克隆供体细胞的影响，为提高延边奶山羊体细胞克隆效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

1.1.1 试剂 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO预融，超纯水配制成0.25 mg/mL的浓缩液备用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基础药类均购自SIGMA中国有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取试剂盒购自宝生物（大连）有限公司。

1.1.2 材料 延边奶山羊耳部组织块。剪取奶山羊（母）耳部血管较少处组织，大约1.5×2.0 cm2。用PBS冲洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS冲洗3次，最后将组织块剪碎。经过3～5次PBS及胰蛋白酶洗涤后，均匀接种于25 cm2培养瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培养液[4]。每3～5 d换液1次。当原代细胞汇合至80%时，消化传代，3代以后的成纤维细胞可用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1 5-aza-dc处理延边奶山羊耳成纤维细胞 取3代以上的延边奶山羊耳成纤维细胞，消化传代，调整细胞密度为105个/mL，接种于24孔或96孔培养板，待细胞处于对数生长期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培养液分别培养。5-aza-dc的浓度设定为0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。

1.2.2 5-aza-dc对细胞活率的影响 不同浓度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各处理成纤维细胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培养液，每孔添加150 μL DMSO，振荡10 min，酶联反应仪测492 nm处的OD值。

1.2.3 5-aza-dc对细胞形态的影响 不同浓度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，显微镜下观察细胞形态。

1.2.4 5-aza-dc对细胞染色体的影响 不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，换液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化悬浮细胞，1 000 r/min 离心10 min，37 ℃预温的0.075 mol/L KCl低渗处理30 min后，用新鲜固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定细胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液悬浮细胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油镜观察[5]。每组处理选取一定数量的清晰分裂相，记录变异的染色体数目。

1.2.5 5-aza-dc对细胞凋亡的影响

1）Hochest33342/PI双染法荧光显色法检测细胞凋亡。不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，消化悬浮细胞，调整细胞密度为106个/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342荧光染色，37 ℃避光孵育10 min，离心去上清，用培养液悬浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，荧光显微镜下观察[6]。

2）琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡。不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，消化收集细胞于1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心5 min，500 μL PBS悬浮细胞后，按DNA提取试剂盒步骤提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.3 数据分析

试验所得数据使用SPSS17.0进行分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）的方法处理数据。

2 结果与分析

2.1 5-aza-dc对细胞活率的影响

由表1可知，不同浓度的5-aza-dc分别培养延边奶山羊耳成纤维细胞24、48、72、96 h后的细胞活率，比较可知72 h组效果较好，且与48 h、96 h组差异不显著，因此后续试验中细胞均处理72 h。

2.2 5-aza-dc对细胞形态的影响

由图1可知，未经5-aza-dc处理的细胞生长状态良好，接触紧密，细胞大小均一，生长速度较快。而经过5-aza-dc处理后的细胞随着5-aza-dc浓度的升高，细胞变得细长，生长缓慢，细胞间隙增大，形态不规则，甚至有的地方细胞大片脱壁死亡。

2.3 5-aza-dc对细胞染色体的影响

采用常规核型分析方法，分析不同浓度的5-aza-dc处理的延边奶山羊耳成纤维细胞，每个处理组选取50个分散较好的清晰分裂相，统计畸变染色体概率。由图2可知，当浓度≤0.010 μmol/L时，染色体畸变率对照组与其他两组差异不显著；当浓度≥0.030 μmol/L时染色体畸变率显著增加，出现多倍体（图3）。当浓度达到0.1 μmol/L时，染色体畸变率达到12%。

2.4 5-aza-dc对细胞凋亡的影响

2.4.1 Hochest33342/PI双染法荧光显色法检测细胞凋亡 Hochest33342/PI双染色后，在荧光显微镜下可见凋亡细胞呈强蓝色、弱红色荧光，坏死细胞呈强红色，而正常的细胞则呈弱蓝色荧光。当浓度为0、0.005、0.010 μmol/L时，凋亡细胞较少；浓度≥0.030 μmol/L时出现较多凋亡细胞；浓度为0.100 μmol/L时，细胞凋亡增加，死细胞数目也增多。如图4所示。

2.4.2 琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡 由图5可知，当浓度≤0.010 μmol/L时，细胞无拖带现象，说明无凋亡细胞；浓度≥0.030 μmol/L时开始出现拖带现象，说明出现凋亡细胞；浓度为0.050、0.100 μmol/L时，细胞大量凋亡，拖带现象明显。

3 讨论

3.1 5-aza-dc对细胞活率、细胞形态的影响

5-aza-dc是一种典型的DNA甲基转移酶抑制剂，为胞嘧啶核苷的类似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc处理第五代猪胎儿成纤维细胞（PFF），发现不同浓度的5-aza-dc均抑制PFF的生长，较高浓度的5-aza-dc处理会导致细胞的形态和染色体的倍性发生改变。Enright等[8]对供体成纤维细胞进行5-aza-dc处理后发现高剂量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低细胞甲基化水平，其研究也发现5-aza-dc处理72 h为最佳处理时间。鉴于5-aza-dc对细胞的毒性作用，本试验采用较低浓度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）处理延边奶山羊耳成纤维细胞。结果表明，经5-aza-dc处理后的细胞生长速度、形态等与对照组相比无明显差异，说明延边奶山羊耳成纤维细胞对5-aza-dc具有较强的耐受性。但是随着处理时间的延长，细胞形态改变、死亡数增多，逐渐出现脱壁等现象，这可能是与5-aza-dc对细胞的毒性有关。这与Kumar等[7]的试验结果一致。

3.2 5-aza-dc对细胞染色体的影响

有研究证明，供体细胞的培养环境以及药物等处理会导致其染色体异常，进而引起随后NT胚胎染色体异常，说明在核移植前首先检查供体细胞的染色体还是必要的[9]。本试验使用常规染色体核型分析方法，即经低渗、固定、Giemsa染色等步骤后，滴片制备染色体标本。结果表明，高浓度的5-aza-dc对细胞染色体有致畸作用，浓度越高染色体出现异常的几率越大；而低浓度（≤0.010 μmol/L）对染色体影响不大。通过琼脂糖凝胶电泳实验进一步验证高浓度的5-aza-dc对染色体的影响，可见明显的拖带现象，分析原因可能是染色体结构发生改变，如断裂等。

3.3 5-aza-dc对细胞凋亡的影响

PI、Hochest33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hochest33342则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。本研究用5-aza-dc处理延边奶山羊耳成纤维细胞72 h后，观察不同的浓度对细胞凋亡的影响，采用Hochest33342和PI双染色法检测细胞凋亡，在荧光显微镜下可见凋亡细胞呈强蓝色、弱红色荧光，坏死细胞呈强红色，而正常的细胞则呈弱蓝色荧光。正常细胞和中早期凋亡细胞均可被Hochest33342着色，但是正常细胞核的Hochest33342着色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状。细胞凋亡最明显的生化特征是Ca2+、Mg2+依赖的内源性核酸酶的激活，细胞核染色体从核小体间断裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。针对这些片段应用琼脂糖凝胶电泳技术。凋亡细胞呈明显的梯状条带。本研究通过琼脂糖凝胶电泳结果可见，0～0.010 μmol/L几组都没有出现明显的拖带现象，而从0.030 μmol/L组就开始有拖带现象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L浓度组与对照组相比细胞发生凋亡的比例显著增加。此结果进一步证明高浓度的5-aza-dc可以导致细胞凋亡。

5-aza-dc处理延边奶山羊成纤维细胞适宜时间为72 h，随着5-aza-dc处理浓度的升高，细胞形态有所改变，接触不紧密。当浓度升高到0.100 μmol/L时大片细胞脱壁死亡；当浓度≥0.030 μmol/L时，染色体畸变率显著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L组对染色体核型的影响与对照组相比差异不显著；琼脂糖凝胶电泳法检测经5-aza-dc处理的细胞凋亡情况，结果表明高浓度的5-aza-dc可以导致细胞凋亡，低浓度的5-aza-dc对细胞凋亡的影响较小。以上说明高浓度的5-aza-dc对细胞有一定毒性作用，但是低浓度对细胞影响较小，可以应用低浓度的5-aza-dc作为DNA甲基转移酶抑制剂处理供体成纤维细胞，尝试建立一种既不影响成纤维细胞生物学特性，又可以降低供体细胞核的甲基化状态的方法，从而提供一种提高体细胞核移植效率的方法。

参考文献：

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[4] 于昊赢.不同冷冻程序和冷冻保护剂对延边奶山羊耳部成纤维细胞冷冻效果的影响 [D].吉林延吉：延边大学，2012.

[5] 孙晓冬.延边奶山羊耳成纤维细胞培养体系的建立 [D]. 吉林延吉：延边大学，2012.

[6] 李凤珍. 5-氮-2′-脱氧胞苷对牛成纤维细胞周期、染色体和凋亡的影响 [D].武汉：华中农业大学，2009.

[7] KUMAR B M，JIN H F，KIM H J，et al.DNA methylation leves in porcine fetal fibroblasts indueed by an inhibitor of methylation 5-aza-dc[J].Cell Tissue Res，2006，325（3）：445-454.

细胞生物学特性范文第2篇

[关键词] 骨髓; 间充质干细胞; 兔; 细胞培养

[中图分类号] R329.2+8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)05-29-03

Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro

LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1

1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China

[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.

[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture

骨髓基质中存在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多向分化潜能,是组织工程学技术的重要的种子细胞[1]。目前,国内外已分离培养出骨髓间充质干细胞(MSC),但尚无统一的分离培养方案。虽然有多种MSCs的分离方法,但密度梯度离心法和贴壁分离法是目前骨髓间充质干细胞最常用的分离培养方法。本实验应用密度梯度离心分离法与贴壁分离法对骨髓间充质干细胞进行分离培养,并比较分析这两种分离法对MSC生物学特性的影响,为选择对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单的MSCs分离方法提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM/F-12培养基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均为国产分析纯试剂。碘化丙啶、噻唑蓝和二甲基亚砜均为SIGMA产品,Percoll为Pharmacia公司产品。实验动物日本大耳白兔12只,体重2kg左右,雌雄随机,动物饲养条件为25℃,湿度60%~ 70%。

1.2 方法

1.2.1 骨髓细胞的制备 用3%戊巴比妥钠将兔全身麻醉,用脱毛剂脱去兔后下肢的毛发,用3%的碘酊和75%酒精彻底消毒兔后下肢后移入工作台,铺无菌巾,解剖出胫骨上、下端,用骨钻分别在胫骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7号针头刺入两侧骨端的骨孔内,用加有肝素的DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液备用。

1.2.2 离心分离法制备MSCs 将骨髓细胞悬浮液贴壁加入到预置等体积1.077g/L的Percoll淋巴细胞分离液的离心管中,2000r/min离心20min。吸取中间乳白色的界面层,与5倍体积的生理盐水混匀后1000r/min离心5min,除去残留的Percoll成分。用磷酸盐缓冲液洗涤1次,然后均采用F12-DMEM 培养液(含体积分数为0.1的进口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)重悬细胞,按1×105的密度接种于25mL培养瓶中,37℃、0.05%的CO2饱和湿度下培养,3d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后2~3d换液1次。

1.2.3 贴壁分离法制备MSCs 将骨髓冲洗液放入平皿,再抽出平皿中液体对髓腔进行二、三次冲洗。用吸管反复吹打呈单细胞悬液,每个胫骨的骨髓单细胞悬液经接种入一个25mL培养瓶中,于37℃ 、体积分数为0.05的CO2孵箱饱和湿度培养,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每三四天换液1次。

1.3 细胞计数、细胞形态学观察

在倒置显微镜下,每天观察贴壁分离培养、密度梯度离心培养条件下的原代及传代细胞的生长情况和活体形态特征。MSCs活力测定取1～3代传代细胞,制成单细胞悬液,以0.4% 台盼蓝作为染色剂,用细胞计数板计数活细胞和死细胞,共3次,取3次平均值,计算细胞活力:活细胞率(%)=活细胞数/(总细胞数-着色细胞数)×100。骨髓间充质干细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中。分别于接种后第2,3,4,5,6,7天收集4个复孔细胞(注:原代培养细胞于接种后4d换液时开始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞蓝拒染法计数活细胞。根据计数结果绘制生长曲线。取MSCs按2×104个细胞/孔接种于24孔培养板内,从接种后第2天起,每日随机收集4个复孔细胞用计数,取均数描记生长曲线。

1.4 MSCs传代培养

原代细胞长满单层后,即可进行传代,首先弃去培养液,用CMF-PBS液洗细胞两次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)约1mL,消化约5min,倒置显微镜下证实细胞已完全分离(此时镜下可见细胞呈圆球形),加入4mL含血清培养基,反复轻轻吹打成单细胞悬液,离心并用无血清培养基洗涤1次后重新加入含血清培养基计数,按所需密度传代培养或冷藏。

1.5 MSCs细胞的HE、Gimas染色及细胞骨架制备

Gimas及HE染色采用文献报道方法,细胞骨架制备按参考文献[2]方法。

1.6 MSCs流式细胞仪观察制样

按文献[2]的方法制备观察样本,用流式细胞光度计(FCM)检测,采用激发波长为488nm的氩离子激光,DNA被PI着色成红色荧光,蛋白质被FITC着色成绿色荧光,打印出各组细胞周期所占百分比,计算增殖指数(proliferation index,PIX)衡量细胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。两组检测数据用均数±标准差(χ±s)表示,各项指标差异显著性用t 检验。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

2.1.1 密度梯度离心法 细胞培养24h后,均可见大圆形细胞与少量小圆形细胞悬浮于培养液中,4d首次换液后可见少量细胞呈短梭形、多角形细胞及三角形,培养到12~14d细胞增殖铺满至80%左右,15~16d细胞增殖逐渐汇合成单层细胞。传代后至第3代时细胞形态较均匀,呈长梭形集落状分布。

2.1.2 贴壁分离法 细胞培养24h后,均可见数目较多的小圆形细胞、血细胞悬浮于培养液中。4d时首次换液后可见到梭形、多角形细胞及三角形的贴壁细胞;第7~ 8天可见这些细胞呈集落样分布;至第10~12天细胞增殖铺满至80%左右,14~15d时增殖逐渐汇合成单层细胞。Gimas 染色可见细胞核为紫红色,圆形或椭圆形,镜下可见分裂相细胞,两种分离方法未见不同。(图1)

2.2 细胞活性检测

密度梯度离心法:活细胞率为96.2%,贴壁分离法:活细胞率为98.7%,组间比较差异无显著性(P>0.05)。

2.3 细胞生长曲线

见图4,应用密度梯度离心法与贴壁分离法第1代细胞生长曲线测定结果是密度梯度离心法的MSCs生长期比贴壁分离法MSCs的生长曲线延迟1~2d。第2、3代细胞生长曲线测定结果,细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;第2天开始至第6天,细胞呈指数生长,细胞数迅速增长,7d进入平台期,此后细胞数目无显著改变,细胞增殖减慢(图2)。

2.4 培养MSCs细胞骨架观察

镜下可见细胞骨架主要结构形式为环形排列,贯以辐射状微管组成圆形蜘蛛网形,细胞间有角形的突起。随着细胞传代次数的增大,细胞骨架逐渐过渡到以梭形细胞骨架为主要形式(图3)。

2.5 培养MSCs的细胞周期

第3代MSCs培养72h后,经PI和FITC双染在流式细胞仪下观察分析可见细胞增殖活跃,细胞蛋白质含量较丰富。贴壁法MSC:G1期细胞为67.5%,G2期细胞为28.9%,S期细胞为3.6%,细胞增殖指数为(PIX)32.5%,离心法MSC:G1期细胞为68.2%,G2期细胞为28.1%,S期细胞为3.7%,细胞增殖指数为(PIX)31.8%,经统计学分析贴壁法和离心法MSC的PIX差别无意义(表1)。

3 讨论

骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞之一,在适当的条件下,可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞[3-7]。获得大量高纯度的MSCs是将MSCs用于研究或临床治疗的基础,目前用于分离MSCs的方法主要有贴壁分离法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。其中后两者由于所需仪器昂贵、对MSCs损伤较大加之骨髓间充质干细胞尚未发现其特有的表面标志,故较少应用[3]。目前常用方法仍为贴壁法和密度梯度离心法。

本实验采用贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,随着细胞传代,去除其它可贴壁的杂质细胞,传过三代后细胞形态趋向一致,获得较为纯化的梭形成纤维样细胞(MSCs)。应用密度梯度离心法在原代培养获得的细胞,仍需用贴壁法进一步纯化,并且其操作步骤复杂,离心过程中不可避免地造成细胞损失或损伤,同时发现其原代培养时细胞的活性和生长曲线都迟于贴壁法分离的MSCs,而且MSCs贴壁所需的时间较贴壁分离法长,这可能与离心过程中丢失了骨髓微环境中对骨髓间充质干细胞生长有利的细胞因子和促贴附物质有关。原代培养中可见离心法的MSCs纯度较贴壁法的MSCs大,但随着细胞的传代,两者之间的差别逐渐消失。本实验发现应用离心分离法与贴壁分离法经过传代都可获得活性好、形态均一的骨髓间充质干细胞,但在实验过程中要避免软组织的细胞污染冲洗出的骨髓细胞,对所用试剂尽量做到现用现配。同时应用离心分离法时应注意时间不能过长,离心力不能过大,尽量减少细胞的损伤。本研究揭示虽然密度梯度离心法理论上可在原代获得较纯化的细胞,但仍需用贴壁法进一步纯化,而且容易发生细胞污染和损伤等,因此其并不具有明显优势,相反贴壁分离法具有方法简单、细胞损伤小等优点。

总之,本实验应用的两种方法均可获得可靠的MSCs。对原代培养的MSCs,贴壁分离法具有对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单等优点,但其MSCs纯度较离心分离法稍低。经过多次传代后采用两种方法所获得的MSCs的生物学特性已无区别,均可获得具有良好的活性的MSCs。

[参考文献]

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细胞生物学特性范文第3篇

关键词: 成纤维细胞;细胞培养

摘 要:目的 探讨来自正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞的生物学特性. 方法 对三种组织均采用组织块法进行细胞的原代培养，采用胰蛋白酶消化传代，分别利用绘制细胞生长曲线，3 H-胸腺嘧啶掺入及3 H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖，DNA合成代谢及胶原合成等情况，并比较它们之间的差异. 结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞增殖、DNA合成代谢及胶原合成量等方面均明显高于正常皮肤及增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞，后两者之间有一定区别但无统计学意义. 结论 不同组织来源的成纤维细胞其生物学行为亦有所区别，因此在进行实验研究时应有一定的针对性.

Keywords:fibroblasts;cell culture

Abstract:AIM To investigate the biological characteristics of fibroblasts derived from normal human dermal，hyper-trophic scar and keloid tissues.METHODS Fibroblasts pri-mary culture was carried out by the assay of planting tiny tis-sue masses into culture bottles.The fibroblasts，after being isolated from different tissues，were cultivated and the cell growth curves were drawn.Meanwhile，3 H-TdR and3 H-pro-line incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively.RESULTS Keloid fibroblasts had a much more active bio-logical characteristic than that of the other two kinds of　fibroblasts.There was a slight difference between the normal dermal fibroblasts and hypertrophic scar ones.CONCLUSION Fibroblasts derived from different tissues have their own biological characteristics.This makes it necessary for us to do the research on different tissues with different fibrob-lasts.

0 引言

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩常见于烧伤或皮肤外伤愈后，是机体组织异常修复的结果.在临床上轻者可影响美观，重者可导致邻近器官的功能障碍甚至畸形，这些均直接影响患者的生活质量［1］ .研究证实，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成主要是由于组织在修复过程中成纤维细胞的活动异常增强，从而产生大量的Ⅰ型胶原、蛋白聚糖及纤维粘连蛋白等基质成分并使之沉积所致［2，3］ .对于这种疾病目前临床上尚缺乏有效的治疗手段，实验研究则由于缺乏理想的动物模型而受到很大的限制，因此我们通过该实验初步探讨不同组织来源的成纤维细胞的生物学区别.

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，3 H-TdR及3 H-脯氨酸购自中科院原子能物理研究所，MTT购自华美生物工程公司.

1.2 方法 正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织均来自外科手术后所切除标本，所培养出的成纤维细胞分别命名为正常皮肤成纤维细胞（normal skin fi-broblast，NsFb）、增生性瘢痕成纤维细胞（hyper-trophic scar fibroblast，HTsFb）及瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblast，KFb）.标本剪去表皮及皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块（0.5mm×0.5mm×0.5mm），接种于25mL培养瓶中，37.0℃，50mL L-1 CO2 孵箱中孵育4～6h后加入含100mL L-1 小牛血清的DMEM培养基，继续培养，2～3d换液1次，待细胞长出后即为原代成纤维细胞.当原代成纤维细胞达到80%～90%融合时，用2.5g L-1 胰蛋白酶消化收集细胞，用含10mL L-1 小牛血清的DMEM重悬细胞，按1 3传代，实验用第3～6代. 1.3 观测指标 ①细胞增殖.计数法:将三种细胞取相同代数并于其对数生长期时同时消化并制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106 L-1 ，将细胞按1mL/孔接种48孔培养板，每种细胞设1个复孔，共设12组.置孵箱培养24h后以2.5g L-1 胰蛋白酶消化第一组细胞并以胎盼蓝做活细胞染色，在镜下计数，此后每日于相同时间点连续测量12d，依所得数据绘制细胞数-时间的细胞生长曲线.四唑盐（MTT）比色法:同上法接种细胞并于24h后将第一组细胞每孔加入80μL MTT（20g L-1 ），继续孵育4h后弃去上清，再每孔加入0.5mL二甲基亚砜，振荡30min后选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定个孔的吸光度，此后每日于相同时间点连续测量12d并绘制吸光度值-时间的细胞生长曲线.②细胞DNA合成的测定.胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，为DNA合成所必需，因此用同位素3 H标记TdR即3 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入其合成代谢过程，通过检测细胞放射性强度可以反映出细胞DNA的代谢情况.接种细胞于48孔板，每种细胞设8个复孔，每孔细胞数为1×104 ，于接种后24h换液并每孔加入1μci3 H-TdR，继续培养12h后弃培养基，用37℃PBS缓冲液冲洗培养板10次，风干后每孔加入2mol L-1 NaOH200μL，室温放置30min，镜下观察细胞完全溶解后将各孔溶液分别收集于纤维滤纸上，于Beckman LS-6500型液闪计数仪上测定cpm值.③细胞胶原合成的测定.脯氨酸是成纤维细胞合成胶原所必需的氨基酸之一，因此3 H-脯氨酸作为胶原合成的前体能掺入其合成代谢过程.同上法接种细胞于48孔板，于接种后12h换液，继续孵育24h后进行3 H-脯氨酸掺入:配制β-氨基丙腈，L-维生素C，3 H-脯氨酸混合液，终浓度分别为100g L-1 ，50g L-1 ，10ci L-1 ，按每孔100μL进行掺入，孵育24h后收集并进行cpm值测定.统计学处理:数据以x ±s表示，应用Origin软件进行组间t检验.

2 结果

2.1 原代成纤维细胞的生长 结果表明，KFb游出组织块的速度明显快于NsFb及HTsFb（P

图1 －图3 略

2.2 细胞的增殖 细胞记数法与MTT比色法均显示，KFb的生长增殖明显较NsFb与HTsFb快，表现为进入对数生长期的时间短而持续时间长且没有明显的平台期;HTsFb的增殖较NsFb略慢，但基本趋势一致，无明显区别（Fig4）.

2.3 细胞的DNA代谢及胶原合成 结果表明，KFb的DNA合成量及胶原合成量均明显高于NsFb与HTsFb（P

3 讨论

烧伤及皮肤损伤是临床上较常见的病种，其损伤后的愈合过程是一系列修复细胞如表皮细胞、成纤维细胞及内皮细胞等与细胞外基质及多种细胞生长因子共同作用的结果，其中成纤维细胞的生物学活动构成了创面愈合与瘢痕形成的主要病理学基础，因此目 前国内外在研究增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的形成机制时主要将目光集中于成纤维细胞生物学行为及其相关因素的研究方面［4-6］ .

从皮肤组织中获取成纤维细胞的方法有消化法和组织块法两种，消化法又分为胰酶消化法及胶原酶消化法，由于消化法易受组织块的来源、大小、酶作用的时间和温度等多方面因素的影响［7］ ，因此在本实验中对三种组织我们均采用组织块法进行细胞的原代培养.人体成纤维细胞在体外培养情况下一般能存活一年左右，能继续培养50代，用于实验时国外学者多采用3～10代［8，9］ 处于对数生长期的细胞.

我们首先通过组织块培养法对正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的成纤维细胞进行了原代培养研究，发现它们在细胞游出及生长方面均存在着一定的差异，其中瘢痕疙瘩成纤维细胞表现最为活跃.其次在细胞的继代培养研究中，我们通过比较它们在生长增殖、DNA代谢及胶原合成等方面的区别，进一步证实瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学功能远较其他两种成纤维细胞活跃，这与临床上这三者的区别是一致的.来自增生性瘢痕的成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间虽有一定区别但差异不明显，这可能是临床上增生性瘢痕在晚期发生退化的原因之一.

综上所述，我们的研究在一定程度上揭示了不同组织来源的成纤维细胞在生物学特性上的差异，同时说明在进行相应研究时应有一定的针对性.

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细胞生物学特性范文第4篇

【关键词】 骨髓基质细胞;细胞培养;表面抗原

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.03.005

In vitro culture ofmarrow stroma cell and its biological characteristics WANG Xiang-yi， LI Ji-shen， LIU Fu-quan， et al. Department of Neurosurgery， The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Baotou 014010， China

【Abstract】 Objective To explore in vitro culture method of human bone mesenchymal stem cells （BMSCs） of cerebral hemorrhage sequelae patients and its amplified biological characteristics. Methods Ilium myeloid tissues were taken from patients with 3-month cerebral hemorrhage sequelae， and they were in adherence standing culture after removing the lymphocyte， and multiple liquid purification. Morphology and growth characteristics were examined by inverted phase contrast microscope. Cell surface markers CD29， CD34， CD45， and CD105 in the third and sixth generation were tested by flow cytometer. Results After 48 h of phase contrast microscopy inoculate， there were several spindle-shaped cells. After 6～8 d， cells were in colony. After passage， cellular morphology tended to be conform and swirling. Flow cytometer showed that CD34 and CD45 were positive， while CD29 and CD105 were negative. Conclusion In vitro density gradient centrifugation and adherence standing method can provide a large number of homogeneous BMSCs.

【Key words】 Marrow stroma cell; Cell culture; Surface antigen

细胞移植开辟了一条治疗脑损伤后遗症的途径， 目前发现BMSCs植入后会改变损伤区的局部环境， 通过自分泌和旁分泌神经营养因子来保证自身的存活和促发内源修复[1]。骨髓基质细胞是成体干细胞，与其他的干细胞相比有显著的优越性，是细胞移植治疗中枢神经系统疾病的种子细胞之一。由于骨髓中细胞成分比较混杂， BMSCs在骨髓中含量极少， 仅占骨髓中有核细胞的 0.001%～0.01%， 实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增[2]。本实验对人BMSCs进行体外分离培养， 并对培养细胞的表面抗原进行测定， 为临床应用提供足量有活性的骨髓基质细胞。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 主要试剂与设备 淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque （1.077 g/ml， 上海试剂二厂）， DMEM/F12培养基 （Gibco）， 胰蛋白酶（Gibco）， 胎牛血清（Hyclone）， 异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD105（Immunotech）， Caliber 流式细胞仪（BD公司）、倒置相差显微镜（Nikon）、CO2恒温培养箱（Heraeus）， 低速离心机（北京医用离心机厂）。

1. 2 方法

1. 2. 1 BMSCs获得和培养 骨髓来源：病例1， 54岁， 男， 高血压脑出血患者， 行髂骨嵴骨髓穿刺获得， 无菌抽取， 肝素抗凝的骨髓中加入等体积的无钙镁磷酸缓冲液， Ficoll分离， 取单个核细胞层， 用无钙镁磷酸缓冲液洗涤2次， DMEM/F12培养基洗涤1次， 以1×106/ml的细胞密度接种， 用含10% FBS DMEM/F12培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养， 第1次72 h后更换新鲜培养基， 去除未贴壁细胞并继续培养， 后每3～4天换液1次， 以去除未贴壁细胞。连续培养2周后， 当基质细胞贴壁约80%时， 按照1：2比例传代。通过传代， 对BMSCs进行纯化和扩增， 取第3、6代的细胞用于流式检测。体外培养的BMSCs采用倒置相差显微镜， 逐日观察细胞生长情况和形态特征。

1. 2. 2 BMSCs表面抗原检测 采用直接免疫荧光染色流式细胞术， 测定BMSCs表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105。

2 结果

2. 1 体外培养 BMSCs形态学观察 倒置相差显微镜下， 刚接种的骨髓悬液中含有大量悬浮细胞， 无细胞贴壁;48 h后， 发现少数细胞贴壁， 呈梭形。72 h后换液， 将未贴壁细胞弃去。贴壁细胞呈克隆性生长， 细胞增殖后形态多样， 呈异质性， 以长梭形细胞为主， 亦可见三角形、多角形及扁圆形细胞。6～8 d后细胞形成集落。传代后， 细胞形态趋于一致， 呈长梭形， 细胞排列紧密， 可成漩涡状。见图1。细胞传至第12代时， 胞浆内颗粒物增多， 细胞折光性变差， 提示细胞活力变弱， 增殖能力减弱。

2. 2 BMSCs细胞表面抗原检测结果 流式细胞仪分析 BMSCs表面抗原， 流式细胞仪检测显示CD34、CD45阴性为非造血细胞， 且表达率在3代时（2.52%、2.07%）%较6代时（0.32%、0.14%）高， 说明第6代几乎为纯基质细胞。而CD29、CD105阳性说明BMSCs较为幼稚， 且3代和6代数值无差异。

3 讨论

研究已明确BMSCs是成体干细胞的一种， 但细胞成分不单一， 有可能包含不同分化阶段的前体细胞的混合物[2， 3]。BMSCs也具有自我更新能力及多向分化潜能， 在体外经诱导可以分化为骨、软骨、脂肪组织、神经组织及肝组织等。由于骨髓来源丰富， 取材方便， 创伤小， 在组织再生和损伤修复中有很好的临床应用前景[1]。

BMSCs广泛存在于胎儿和成人的各种组织和脏器中， 骨髓组织中含量最为丰富， 为了获取种子细胞， 目前用于分离骨髓BMSCs的方法主要有：密度梯度离心法;流式细胞仪分选法;贴壁培养法;免疫磁珠分选法。作者用密度梯度分离联合贴壁培养法进行了BMSCs的分离和培养， 其操作简单， 经多次传代可获得足够量的细胞。流式细胞仪检测显示CD34、CD45均阴性， 传3代时表达率分别为2.52%和2.07%， 较6代时0.32%和0.14%高， 说明第6代几乎为纯基质细胞。

研究表明BMSCs的表面标志尚无特异性表面标志表达， 部分与间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志有关[4-6]。主要包括：①粘附分子， 如CD44等。②生长因子和细胞因子受体， 如IL受体3、4、6、7， 干扰素γ受体等。③整合素家族成员， 包括CD49a、CD49b、CD49c及CD29、CD104等。④如CD90、CD105等。实验选用的标记物也符合鉴定BMSCs通用标志物， 因此， 本实验培养细胞符合BMSCs的免疫表型。

BMSCs具有多向分化潜能， 在细胞移植和基因治疗方面有重要优势。本实验成功对BMSCs 进行分离、纯化及培养， 为深入研究 BMSCs 的组织再生和修复提供了实验基础。

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细胞生物学特性范文第5篇

原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNA复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织异性表达。目前的研究表明， Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。

1 Livin基因及蛋白结构功能的多样性

IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是N端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列结构域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一个环指结构域(RING finger domain，RING)。目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP，XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(MLIAP/KIAP)［2］。

Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列(BIR或RING)寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。Kasof等［3］在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。Lin等［4］从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP（kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP）。Vucic等［5］发现Livin基因在G361 和 SKMel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等［6］发现了该基因存在2个剪接变异体（isoforms），分别命名为Livin α和Livin β。 同时，Lin等［4］用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体20q13.3区域，全长4.6 kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约2.2，2.8和4.0 kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含4个α螺旋和一个三股抗平行 β片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RING环指结构［4，6］，氨基酸残基C124，C127，H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。

Livin蛋白有α和β两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5′端54 bp的基因序列编码。Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等［3］认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白 C末端的RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3′端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体RNA有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin 蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。

2 Livin基因在NSCLC中的表达

Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义［2，7］。Tanabe等［7］采用 RTPCR法对15例正常肺组织和38例NSCLC组织作对比研究，发现Livin mRNA在NSCLC组织阳性率为73.6%，正常肺组织阳性率为6.7%，显示Livin基因在NSCLC中呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC中的表达并不相关。CrnkovicMertens 等［1，8］同时采用NSCLC组织和NSCLC源 HeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livin α和Livin β的表达，结果显示Livin α和Livin β在NSCLC中呈高表达。采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livin β和Livin α基因的功能意义不完全相同， Livin β在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等［9］采用RTPCR法检测NSCLC组织中Livin α mRNA和Livin β mRNA的表达，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为71.1％，两种异构体基本同时表达，Livin β mRNA的表达量略高于Livin α mRNA。而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为5.7％和6.7％。而且Livin mRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。陈淼等［10］采用免疫组织化学(SABC)的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为45.5﹪和50.0﹪，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度NSCLC组织之间Livin蛋白的表达无显著性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为72.7﹪和11.1﹪，两组的显著性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等［11］ 的研究结果显示，48例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为22.9%，其表达与NSCLC组织学类型相关，腺癌中Livin mRNA表达阳性率达45.5%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin 蛋白表达与mRNA表达相一致。研究还发现放、化疗后NSCLC组织中的Livin表达的阳性率为43.5%，显著高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表达，这可能与临床上NSCLC对化疗药物和放疗耐受有关。

目前，Livin基因在NSCLC组织异性地高表达的现象已引起许多学者的关注［12］，但Livin mRNA的表达与NSCLC患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC的分子标志物，成为诊断和治疗NSCLC新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。

3 Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制

Kasof等［3，8］研究显示，Livin蛋白N端的羧基与Caspase3，7，9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由FADD（Fasassociated protein with death domain），Bax，RIP，RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。Vucic等［13］将Livin基因转染乳腺癌MCF7细胞，证实转染细胞对Fas，TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1），DR4（death receptor 4）及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）诱导的细胞凋亡。但是各家报道Livin α和Livin β蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。Yang等［14，15］观察在Jurkat T淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNFα及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl 2。Livin α对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livin β则无此作用。CrnkovicMertens 等［8］ 采用RNA干扰技术分别使内源性Livin α和Livin β基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livin β可显著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外线放射治疗（UV irradiation）等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livin α则不明显。更多的研究则认为Livin α和Livin β基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。

许多研究证实［12-16］，Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase 3和Caspase 7结合，抑制其活性。Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase 9结合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、细胞色素C及dATP诱导的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。Sanna 等［12］的研究显示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNFα和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。 TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。此外，Vucic 等［13］证实SMAC（ second mitochondrial activator of caspases， SMAC）及活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAC介导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。

4 Livin基因治疗NSCLC的临床应用前景

鉴于Livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达Livin α和Livin β的NSCLC A549细胞克隆。孙建国等［17］用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染Livin α和Livin β基因后的细胞尤其是表达Livin α的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10 Gy放射线照射下仅有0.2%细胞发生凋亡。可见 Livin基因参与NSCLC的发生发展，也可能是NSCLC细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。

CrnkovicMertens等［18］利用基因转染和特异性小干扰RNA(siRNA)技术，在肺癌SPCA1细胞株中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系，观察诱导SPCA1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性Livin α和Livin β基因沉默后，SPCA1细胞克隆形成能力较对照组显著下降，促使SPCA1细胞发生凋亡，表明Livin α和Livin β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。

由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。Hariu等［20］ 用Livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现HLAA24与Livin 7肽具有特殊亲和力，Livin蛋白表达阳性的NSCLC患者可检测到特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），而Livin蛋白表达阴性NSCLC患者则测不到CTLs。结果提示Livin蛋白可成为NSCLC免疫治疗的靶点，将Livin 7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。

综上所述，Livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在NSCLC组织中的特异性表达为NSCLC的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为NSCLC治疗的新靶点［21，22］。目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mRNA为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。因此，采用反义核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制剂（smallmolecule inhibitors）和免疫介入（immunemediated approaches）等基因治疗手段直接阻断Livin 蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为NSCLC的治疗开辟新的途径［23，24］。同时，对NSCLC患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的Livin蛋白（受体）及其mRNA表达的联合检测，有可能成为NSCLC早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。

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