细胞研究

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细胞研究范文第1篇

此前，为了研究未经批准的干细胞系，研究人员不得不建立独立的、私人融资性质的实验室，然后还要经过一系列繁琐的会计程序，以确保联邦拨款的每一分钱都不会用在干细胞研究中。但这样的情况不会再继续下去了。取消禁令“将给这一领域和其他领域的研究人员大开方便之门。”旧金山加利福尼亚大学的干细胞研究人员阿诺德 克里格斯汀作如上表示。

乔治・Q・戴利博士在波士顿儿童医院研究儿童血液病，他说，他利用私人资金进行研究，已获得15条人类干细胞株，如今他首次可以向美国国立卫生研究院(NIH)申请拨款来研究这些干细胞。

奥巴马总统支持胚胎干细胞研究的时机正与世界干细胞研究取得重大进展的背景不谋而合，日本生物学家山中伸弥在2007年发现，成体细胞能够重新编程回到胚胎状态，其容易程度令人惊讶。这项技术“有可能最终使得胚胎干细胞用于治疗和诊断的技术变得相形见绌。”干细胞用于治疗的前景虽然还很遥远，但如果能用病人自己的身体细胞进行治疗，可避免免疫排斥问题。

美国一些国会议员和其他一些倡导与疾病作斗争人士一直看好人类胚胎干细胞研究，认为它是快速治愈一些顽固性疾病的可靠途径。

但在私下里，许多研究人员的胚胎干细胞研究目标定得还是比较实际，他们主要的兴趣在于从一些特定疾病的患者那里获得胚胎干细胞系，通过跟踪观察这些细胞在试管内的生长情况了解疾病如何发展的基本知识。

尽管美国杰龙生物医药公司利用人体胚胎干细胞医治脊髓损伤病人的试验已在今年1月获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，许多科学家还是认为，把干细胞衍生的组织移植到患者体内还有很长的路要走。胚胎干细胞有其自身缺陷，它们易产生肿瘤，从干细胞中分离出来的成体细胞有可能会受到患者自身免疫系统的排斥。此外，无论是什么样的疾病过程造成了病人组织细胞的死亡，也同样有可能杀死外来移植的细胞。所有这些问题也许都有可能得到解决，但至今为止还没有一个得到解决。

克林顿总统曾过允许NI H给研究员提供资金研究人体胚胎干细胞的设想，但一直没实行这项政策，直到2001年8月才开始有了这方面的研究，当时的美国总统布什寻求以一种不同的方式同避国会对干细胞研究的限制，规定研究人员可以使用在此之前获得的干细胞系进行研究。

奥巴马将克林顿当年提议的政策付诸实行，但美旧国会的限制依然存在。研究人员仍然禁止使用联邦资金来获得新的人类胚胎干细胞系。不过，他们将被允许对私人投资实验室里培养出来的新的干细胞系进行研究。

细胞研究范文第2篇

【摘要】肿瘤干细胞是在肿瘤中具有自我更新能力并能够产生特异性肿瘤细胞的细胞。近年来,越来越多的学者认为肿瘤干细胞的是恶性肿瘤复发和转移的根源。随着研究的深入,肿瘤干细胞的靶向治疗为恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。本文对近年来肿瘤干细胞的研究现状作以综述。

【关键词】肿瘤;肿瘤干细胞

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,虽然现在肿瘤的诊断和治疗水平已有了极大的提高,但肿瘤的复发和转移仍是导致肿瘤治疗失败及病人死亡的一个重要原因。因此,如何尽早地发现恶性肿瘤并预防其转移已经逐渐成为医学领域的一大热点。许多研究表明肿瘤细胞在增值和分化等方面与干细胞有着极为相似的地方,在几乎所有的肿瘤中都潜伏者极少量的肿瘤干细胞,而这些肿瘤干细胞很可能是导致肿瘤复发和转移的根源,因此研究肿瘤干细胞对未来肿瘤的诊断、治疗将产生深远的影响。

1 肿瘤干细胞由来

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是在肿瘤中具有自我更新能力并能够产生特异性肿瘤细胞的细胞。40年前,Hamburger等[1]对来自肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤的肿瘤细胞进行体外培养,发现仅有1/5 000~1/1 000的肿瘤细胞能形成克隆,这表明不是全部的肿瘤细胞可以形成肿瘤,而是仅有极少数肿瘤细胞才具有致瘤性。Dick等首次从人急性髓样白血病中分离出白血病肿瘤干细胞,从而证实了肿瘤干细胞的存在。随后研究者们相继在乳腺癌、脑肿瘤及其他系统的肿瘤中找到了相似的肿瘤干细胞,为肿瘤干细胞学说添加了充分的证据。

2 研究现状

2.1 造血系统肿瘤:

白血病是目前公认的由肿瘤干细胞引起的造血系统疾病,也是目前研究比较深入的一类疾病。park等人发现在白血病大鼠中提取的白血病细胞中仅有不到1%的细胞能在体外形成克隆,而且在体内形成克隆的也不过4%,这说明有少数白血病细胞能在体内外增生。Blair等人对急性髓性白血病的研究表明,不同的白血病细胞亚群移植到严重联合免疫缺陷病的裸鼠,其肿瘤细胞成瘤能力差异巨大,大部分的白血病细胞不能有效增殖,仅少数细胞有稳定持续的形成肿瘤克隆的能力。这些细胞的表面标志为[Thy-1-, CD34+, CD38-],约占白血病细胞总数的0.2%-1%,而造血干细胞为[Thy-1+, CD34+, CD38-],两者非常相似。所以,白血病干细胞可能来源于Thy-1-的祖细胞,或者是丧失了Thy-1+表达能力的干细胞[2]。

2.2 脑部肿瘤:

2003年Singh等[3]从多种脑肿瘤中分离出肿瘤源性细胞。这些细胞具有神经干细胞分子标志CD133和巢蛋白,在体外培养可分化形成细胞表型与原位肿瘤类型相同的肿瘤细胞。2004年Galli等[4]将这类细胞注射入小鼠颅内,在活体内产生了与原肿瘤类似的肿瘤,从体内研究进一步证实了脑肿瘤干细胞的存在。

2.3 乳腺肿瘤:

2003年,AI-Hajj等[5]从人的乳腺组织中分离出预期的乳腺癌起始细胞(Breast Cancer-Inition Cell, BrCa-IC)。他们从乳腺癌的组织或胸水转移癌细胞中,根据细胞表面特异性的标志分离纯化出乳腺癌干细胞。这种细胞以in-ESA+CD44+CD24-/low为特异性细胞表面标志,虽然只占小鼠移植乳腺癌的2%,但其致瘤能力比未分类细胞大50倍,即只需200个此种细胞便可在小鼠乳腺中形成肿瘤。AI-Hajj等在接下来的实验中用Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞免疫小鼠,发现新形成的肿瘤与原来肿瘤的表型异质性相似,而且也仅Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞具有致瘤源性;与之相对的是,即使移植数千个其他表型的癌细胞,也不能形成移植肿瘤灶,这便充分证明了在NOD/SCID小鼠所形成的肿瘤灶内既包括这群肿瘤源性细胞,又包括其他表型的肿瘤细胞。

2.4 胰腺癌:

胰腺癌细胞表面分子CD44、CD24和ESA的表达也存在异质性。Li等[6]研究发现,从患者原发性肿瘤中分离出的胰腺癌细胞通过三种表面标志分子CD44、CD24及ESA进行分选后,接种至NOD/SCID小鼠中观察其成瘤性。结果显示,未经过流式分选的细胞在102~104个细胞范围内,接种后连续观察16周均无明显的肿瘤形成。而经过CD44、CD24和ESA分选后的细胞致瘤性明显增强,其中CD44+CD24+ESA+的胰腺癌细胞虽然所占的比例很少(占0.2%~0.8%),但致瘤性最强,只需100个即可在NOD/SCID小鼠中形成肿瘤,并且在小鼠体内连续传代的肿瘤中,这群细胞的比例不发生改变。不仅如此,CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞作为胰腺癌干细胞的这一特征在组织学中也得到证实。CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞形成的移植瘤与患者的原发性肿瘤相比不仅病理表现十分类似,而且胰腺癌分子标志物的表达类型也非常相近。这些均说明CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞具有自我更新和多向分化等干细胞特征。

此外,在肺癌、肝癌及前列腺癌中也已进行了肿瘤干细胞的研究,更进一步证实肿瘤干细胞是肿瘤发生的根源。

3 展望

肿瘤干细胞的发现为肿瘤的生长和转移提供了一种新的理论解释,也为肿瘤治疗开辟了一条新的思路。虽然目前针对肿瘤干细胞的研究取得了一些进展,有若干的证据证明了肿瘤干细胞的存在及意义,但肿瘤干细胞领域中还有许多问题有待探索。例如正常细胞是如何转变为肿瘤干细胞的;各种组织的肿瘤干细胞是否来源于同一种源细胞等等。虽然肿瘤干细胞的研究刚刚起步,但是肿瘤干细胞理论确实为肿瘤疾病的攻克及预防提供了可能和希望,相信随着肿瘤干细胞研究的进一步深入,必将引发新一轮临床肿瘤治式及肿瘤靶向用药研发的变革,人类战胜肿瘤疾病的时刻在不远的将来定会实现。

参考文献

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细胞研究范文第3篇

【关键词】 干细胞；生物学特性；可塑性；分离培养；应用

Advances in study of stem cells

【Abstract】 Stem cells are non-specialized cells which have the ability of self-renewal and multiple differentiation potential. The application of stem cells has nearly involved in all the research field on life sciences and biomedicine in recent years. This article summarizes the biological characteristic of stem cells， and reviews the latest progress in the study on stem cell’s plasticity， isolation， culture in vitro， and its extensive application in basic research and clinical application. The prospects of stem cells are also discussed.

【Key words】 stem cells; biological characteristic; plasticity; isolation; culture in vitro; application

干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而医学界称之为“万用细胞”。1981年英国的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡首次成功地分离了小鼠胚胎干细胞，从而在全球掀起了有关干细胞的研究热潮。1997年2月英国苏格兰罗斯林研究所威尔穆特博士等成功克隆出“多利”绵羊，1998年11月，美国Thomson［1］和Gearhart［2］分别用不同的方法获得人胚胎干细胞及胚胎生殖细胞，此后，干细胞的研究便进入了一个全新的时代。1999年，有关干细胞的研究被Science评为1999年度十大科学进展之首。2000年12月干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。本文就近几年来干细胞的研究进展综述如下。

1 干细胞的生物学特性

根据干细胞的发育阶段，可将其分为胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES）和成体干细胞（Adult Stem Cell，AS）。胚胎干细胞即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞，包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞（Embryonic Germ Cell，EG）。成体干细胞即具有自我更新能力，但通常只能分化为相应组织器官组成的“专业”细胞，它是存在于成熟个体各种组织器官中的干细胞，包括神经干细胞（Neural Stem Ce11，NSC）、血液干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）、骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）、表皮干细胞（EPidexmis Stem Cell）、肝干细胞（Hepatic Stem Cell）等。

1.1 胚胎干细胞的生物学特性 　 胚胎干细胞最早是直接从小鼠早期胚胎分离建系的，它们具有其自身的生物学特性。与其他细胞系相比较， 胚胎干细胞的特点在于:（1）具有不断增殖分化的能力，所以，在体外培养条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态和发育潜能性。1999年Soiter等［3］利用这个特性将ES/EBs及其分化细胞作为有关药物的针对筛选系统，进行药物毒性检测实验。（2）具有高度的发育潜能和分化潜能。体内外可分化出外、中、内三个胚层的分化细胞，可以诱导分化为成体细胞内各种类型的组织细胞。胚胎干细胞含有正常二倍染色体，具有种系传递功能，能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育，并形成包括生殖系在内的合体后代生殖细胞。1995年Pacacio等［4］利用骨髓基质细胞或其培养液，将胚胎干细胞在体外诱导分化为造血干细胞。1997年Baker等［5］在缺乏新霉素(geneticin，g418)的条件下，将Rosaβ-geo基因转染胚胎干细胞后能在体外诱导分化为软骨细胞。同年Deni等报告将胚胎干细胞通过悬滴培养可分化出脂肪细胞。（3）能进行体外培养扩增，还可以对其进行遗传操作选择， 如导入异源基因、报告基因或标志基因，诱导某个基因突变等。扩增、遗传操作及冻存均不丧失其多能性。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性。

1.2 成体干细胞的生物学特征

干细胞在分化为特化细胞之前常产生一种或几种祖细胞，然后由祖细胞分化产生特化细胞。与胚胎干细胞相比较，成体干细胞有以下几个特点：(1)成体干细胞体积小，细胞器稀少，RNA含量较低，在增殖过程中处于相对静止状态，在组织结构中位置相对固定。(2)成体干细胞数量很少，其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。研究结果表明，即使在含量丰富的骨髓中，每10，000～15，000个骨髓细胞中只有一个造血干细胞［6］，人和动物皮肤中的干细胞含量仅为7%～8％［7］。Reynolds等［8］实验证明成体哺乳动物脑内的神经干细胞数量极少，仅占室下带区中相对静止细胞数的0.1%～1%。(3)成体干细胞常处于一个有干细胞细胞基质，对干细胞的增殖和分化起调控作用的各种信号分子的特定微环境或称生物位（nich）中，干细胞是自我复制还是分化为功能细胞取决于所在的微环境和自身的功能状态。(4)成体干细胞没有确定的来源。有科学家推测，成体干细胞是胚胎发育过程中保存下来的未分化的细胞［6］，这揭示成体干细胞与胚胎干细胞可能会有更多的相似性与同源性。

2 干细胞的可塑性

干细胞的可塑性主要是指成体干细胞的可塑性。人们把成体干细胞具有分化为其他类型组织细胞的能力的这种现象称为干细胞的可塑性（plasticity）［9］，横向分化（transdifferentiation）［10］或转决定（transdetermination）［11］。

1995年，Pereira等［12］证明，小鼠骨髓细胞在体外培养后具有向骨、软骨和肺基质转化的能力。1999年，Bjornson等［13］将胚胎和成年小鼠神经干细胞，以及在体外克隆的神经干细胞移植给亚致死剂量照射的小鼠，结果证明神经干细胞可转化为造血细胞。同年Jackson等［14］用 Hoechst333422-lowSP纯化的小鼠造血干细胞进一步证明它可迁移到肌肉损伤部位，在参与肌肉再生的同时也参与血管的再生。2002年Vescovi 等［15］报道神经干细胞除有向神经元、星形细胞与少突胶质细胞分化能力以外，还可分化为造血细胞谱系。

肝干细胞也是干细胞可塑性的主要可靠证据之一。2000年Alison等［16］和Lagasse等［17］分别报道HSC可在体内分化成肝细胞。2001年Shen等［18］在骨髓移植的试验中发现，肝脏干细胞能表达供体造血细胞的遗传标志。

这一系列的证据表明干细胞存在可塑性。然而，近几年来，部分研究学者对干细胞的可塑性提出了不同的看法:(1)细胞自发融合导致“可塑性”。英国科学家2002年，Ying等［19］的研究结果表明， 胚胎干细胞在体外与神经或HSC共同培养时，能自发地发生神经或HSC与胚胎干细胞之间的融合，诱导NSC或HSC“横向分化”为胚胎样干细胞，然后展现出胚胎干细胞的表型特征与相应功能。同年美国科学家Terada等［20］用充分的证据证明，骨髓细胞的多向分化是因为与胚胎干细胞融合所致，而不是骨髓细胞直接横向分化的结果。这两者的研究结果都表明，是由于发生了细胞融合，使所谓的成年组织干细胞具有了“可塑性”潜能。(2)成体干细胞的横向分化是成体组织中余存的胚胎原始干细胞所致。2002年Jiang等［21］的研究结果证实，在成体组织中余存着一种数量稀少的胚胎样原始干细胞，表达胚胎干细胞的标志如Oct-4、Rex-1及SSEA-1，体外培养条件也类似于胚胎干细胞，所谓的成体组织干细胞的“可塑性”很可能是这些细胞所为。(3)2002年，在Science和Nature上连续刊发的几篇文章指出，成体干细胞可塑性可能是实验设计不严谨，判断错误所致，认为所谓的成体干细胞可塑性缺乏科学依据。

3 干细胞的分离培养

由于干细胞的数目很少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖。干细胞的分离培养的理论基础是其生物学特征，包括形态和结构特征及其生物学表型。

干细胞的分离培养实验主要是建立在老鼠的实验上，早在二十世纪七八十年代就已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养成功。近年来，国内在这方面的研究也取得了一定的进展，主要是在神经干细胞等成体干细胞的研究上。2002年陈雷等［22］应用无血清培养技术从胎鼠脊髓分离到的神经系统的干细胞具有不断分裂增殖的能力， 可被神经干细胞特异性抗体所标记， 并在血清条件下分裂为神经系统多种细胞。2004年冯玉萍等［23］用胰酶消化加机械吹打分离大鼠大脑皮质及皮质下组织，之后用悬浮培养法、有限稀释法获得来源于同一细胞的亚细胞系克隆; 2005年肖美玲等［24］用同样的方法分离新生昆明种小鼠(出生24 h 内) 的大脑组织，利用无血清培养基悬浮培养细胞，获得具有自我增殖能力的细胞克隆，两者经用免疫细胞化学法鉴定为神经干细胞。

虽然老鼠的干细胞体外培养实验已经取得了可喜的进展，但人的干细胞的体外培养直到1995年，Thomson等从恒河猴的囊胚中分离，建立了第一个灵长类动物的胚胎干细胞株后，才获得成功并得到迅速的发展。1998年，Thomson［1］和Gearhart［2］分别用胚胎干细胞和胚胎生殖细胞建立了人的胚胎干细胞系，在体细胞与生殖细胞间架起了桥梁，为研究胚胎干细胞的发育，在体外培养人体细胞和组织，利用ES细胞治疗疾病提供了广阔的发展前景。在报道分离了人的胚胎干细胞这一重大成果后不久，美国Advance Cell Technology (ACT， Worcester， M)的研究者宣称，他们通过使人的皮肤细胞和牛的卵细胞杂交，培育出了人的胚胎干细胞。所用的方法与克隆实验中采用的方法相似，基本上是对人的细胞重新编程并使其回到它最初的原始状态。该发现可能导致许多新方法的产生，如通过移植和细胞治疗来医治疾病。2002年李巍等［25］采用无血清培养技术， 成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞，且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞。经传12代后仍具干细胞特性。2004年王共先等［26］以器官捐献者的正常前列腺为研究对象，利用免疫磁珠细胞成功从前列腺基底细胞中分离前列腺干细胞。同年汪泱等［27］和罗树伟等［28］均成功分离培养了人胚脑神经干细胞，并进行进一步的检测和研究。

4 干细胞的应用

胚胎干细胞是细胞的源头，具有多能或全能性，并能够无限分化，能够制造机体需要的全部细胞，因此在医学和生物学上具有巨大潜力，应用前景广阔。但它存在着移植免疫排斥的限制和伦理学方面的困扰， 而成体干细胞只能在体外有限扩增，多系分化效力低，通过体外的扩增培养虽能够提高转化效率， 然而体外转化是否会引起干细胞遗传特性的改变尚不清楚。 但这类干细胞存在于宿主体内，可直接从患者自身获得，故无移植免疫排斥的限制也无伦理学方面的困扰，因此胚胎干细胞和成体干细胞的研究对生命科学领域而言，都具有极重要的意义。

4.1 为发育生物学研究提供良好的体外模型系统哺乳动物胚胎体积较小，而且在子宫内进行发育，因此很难在动物体内连续动态地研究其早期胚胎发育、细胞组织分化及基因表达调控， 而来源于胚胎的胚胎干细胞具有发育全能性、可操作性及无限扩增的特性，因此胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究个体发育过程中极早期事件的良好材料和方法。随着分子生物学的发展，通过比较胚胎干细胞不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制、发现新基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。

4.2 在医学上的应用理论上讲，干细胞可以用于临床细胞移植治疗各种疾病和构建人工组织或器官，其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死、肿瘤，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点：低毒性或无毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；不存在传播疾病的风险：还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。

1999年Horwitz等［29］用骨髓间充质干细胞（BMSC）治疗遗传性骨缺陷病，并取得了一定效果。2004年9月，意大利一名5岁、患有地中海贫血症的男孩卢卡，科学家通过从其弟弟的胎盘血中提取干细胞移植到卢卡身上，使其战胜病魔，完全治愈。

4.3 生产克隆动物的高效材料胚胎干细胞是动物克隆的优良核供体。胚胎干细胞可以无限传代和增殖而不失去其基因型和表现型，以其作为核供体进行核移植后在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体。胚胎干细胞与胚胎嵌合生产克隆动物可解决哺乳动物远缘杂交的困难问题。另外，由于体细胞克隆动物存在成功率低、早衰、易缺陷易突变等问题，且多是致命的，使胚胎干细胞的克隆研究仍十分重要。1999年Wakayaama等［30］用长期传代的小鼠胚胎干细胞克隆出31只小鼠，14只存活，存活率比体细胞克隆高。

4.4 高效新型药物的发现、筛选及动物和人类疾病的模型胚胎干细胞提供了新药物的药理药效、毒理及药物代谢等研究的细胞水平的研究手段，利用胚胎干细胞体外分化的细胞组织检验筛选新药，可大大减少药物实验所需实验动物的数量及其人群数量，胚胎干细胞还可用来研究动物和人类疾病的发生机制和发展过程以便找到有效和持久的治疗方法。

4.5 生产转基因动物的高效载体

利用胚胎干细胞作载体使外源基因的整合筛选等工作能在细胞水平上进行，使操作简便可靠。

5 问题与展望

近年来，随着生物细胞实验技术及分子生物学的发展，干细胞研究领域取得了突破性进展，某些方面已有初步的临床应用。但是目前干细胞的研究尚处于初期阶段，许多理论问题亟待解决：

（1）干细胞的许多机制还没完全清楚，比如在干细胞可塑性机理的研究上还存在着分歧。如何使干细胞在体外大量扩增，并诱导其分化是干细胞在医学临床上应用的关键。

（2）干细胞如何到达不同的靶目标，并分化为正确的细胞类型及正确的细胞数量、比例以及在正确的位置与正确的靶组织建立正确的联系而无任何错误连接等。

（3）干细胞移植的安全性问题:胚胎干细胞移植时会发生不适宜的分化，产生免疫排斥作用，但成体干细胞则没有这个问题，其主要的机理还没完全明白，因此干细胞在临床应用前需要进行全面的评估。

相信随着细胞分子生物学技术的应用，不久的将来干细胞许多相关机制将被逐渐阐明， 人类将有可能人为地控制影响干细胞分化的各项因素， 但我们也应该清楚的认识到， 仍有许多悬而未决的问题，干细胞的临床应用还有很长的路要走。干细胞用于治疗许多疑难症状在动物实验已经取得了可喜的成就，如果经人体临床试验成功，其潜在的效益将溢现出来，造福人类。

目前，我国在干细胞研究上相对落后，国家已经重视干细胞的研究，将干细胞的研究列入973项目，并成立了干细胞研究所，加强干细胞的基础知识与临床应用方面的研究，这将使我国在此领域的理论和实践应用上得到更大的发展，在世界上占有一席之地。

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细胞研究范文第4篇

关键词 细胞因子 T细胞 牙龈卟啉菌 牙周疾病

材料和方法

选取7例成人牙周炎患者，指标：至少4个位点上牙周袋>5mm，骨吸收>6mm，年龄47±3.35岁；10例健康或牙周仅有轻度炎症者，炎症位点不超过4个，骨吸收

牙龈卟啉菌(Pg)［1］及Pg血清学检测；牙周探针深入牙周袋或龈沟内，取出后放入1mlPBS中，Elisa法进行Pg及Pg血清学检测。

Pg培养：Pg ATCC33277，常规培养，提取其外膜物质，显微镜下观察菌体。

T细胞系的制备：每例个体抽取5ml外周血，高密离心法获取单个核细胞，37℃孵化14天，加入Pg抗体1周后，PBS洗细胞，静置1周；加入IL-2，28天后Pg阳性T细胞系制备完成。

流式细胞仪检测：PBS加0.1%盐酸缓冲液冲洗T细胞以获取其外膜物质，加入鼠抗人CD4或CD8抗体，4℃孵化30分钟，分别加入IL-4，IFN-γ、IL-10抗体，选流式细胞仪检测。进行统计学分析。

结 果

成人牙周炎、健康组两组间CD4+、CD8+T细胞中IFN-γ与IL-4比值、IFN-γ与IL-10比值无显著差异。

两组间CD4+，CD8+T细胞IFN-7表达量高于IL-4、IL-10表达量。健康个体B的CD4+ T细胞中IL-4、IL-10表达高于IFN-γ；个体C的IL-10表达高于IFN-γ；CD8+T细胞中F、G个体IL-4或IL-10表达高于IFN-γ；成人牙周炎个体CD4+T细胞中，F、G个体IL-4表达高于IL-10，IL-10高于IFN-γ。其余个体均为IFN-γ表达量最高，成人牙周炎个体CD4+T细胞中，I、H、O、P、Q5例个体中IL-4和（或）IL-10表达高于或近似于IFN-γ；CD8+T细胞中，I、H、O、P、q、K6例个体中IL-4和（或）1L-10高于IFN-γ表达。

讨 论

健康牙龈组织中T细胞记忆细胞不表达IL-4，成人牙周炎牙龈位点用Pg抗体刺激后表达高IL-4。这些研究结果表明，牙周疾病中IL-4的高表达可能打破了其他细胞因子间的平衡。

实验证明，在牙周疾病中牙龈组织中IFN-γ表达显著，本实验中CD4+、CD8+T细胞系中IFN-γ表达量均高于IL-4、IL-10。根据以上数据推测，在牙周疾病过程中，牙龈牙周组织的破坏可能经由IFN-γ产生以及巨噬细胞等的潜在刺激引起［2］。Stein等已证实，成人牙周炎患者牙龈组织中IL-10表达量远高于非炎性牙龈组织。同时IL-l0抗原可诱导胶原纤维减少［3］。

本研究结果表明，研究健康者和成人牙周炎患者间，牙周组织中牙龈卟啉菌阳性个体T细胞系中白细胞介素-4、白细胞介素-10及γ-干扰素表达无显著差异，但部分个体γ-干扰素表达高于其他两种细胞因子的表达，证实牙龈卟啉菌阳性个体易患牙周疾病者，γ-干扰素表达增高。

参考文献

1 路宝风.牙龈卟啉茵的研究进展.临析医学专科学校学报，2002，24(1)：66-68.

细胞研究范文第5篇

【关键词】间充质干细胞;心肌细胞;细胞替代治疗

Research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets

JIANG Jing,LI De-hua.Department of Anatomy,Liao Ning Medical College,Jin Zhou Liao Ning 121001,China

【Abstract】 Ischemic heart disease such as myocardial infarction endanger human health and life,cardiac tissue engineering is one of the new radical therapy for myocardial infarction.In recent years,researchers have made great progress in cardiac tissue engineering,but the problems of seed cells and scaffold materials are far from resolved.This paper reviews research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets so that it may contribute to Cell therapy.

【Key words】

Mesenchymal Stem Cells;Cardiomyocyets;Cell therapy

在成人肌肉组织中,心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs)属于终末分化期永久性细胞,不具有再生能力[1],其对有丝分裂信号作出的反应是细胞肥大[2]而不是再生,致使损伤后心肌再生和修复严重受限,由于心肌损伤后无法通过自身的增殖、分化进行修复,坏死的心肌则由纤维疤痕组织取代[3,4]。研究发现心肌中也含有干细胞[5-7],在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后这些细胞会发生分裂增生,但数量极少,增殖能力太小,不能完整地修复心肌组织,更不能满足心肌组织再生的需求,致使具有收缩功能的CMs减少,最终发展成充血性心力衰竭、死亡,严重影响患者的生活质量。临床上缺乏对病变冠状动脉的再造和梗死心肌的再生、重建的根本治疗方法,而细胞替代治疗通过移植功能细胞,替代、修复或加强受损的组织或器官的细胞的生物学功能已成为治疗多种组织坏死性疾病的新策略。

1 心肌细胞和间充质干细胞的特点

心肌细胞在出生后就进入了有丝分裂的后期,基本丧失了增生和再生的能力,不再进入细胞周期,而目前尚无证据支持心肌中含有干细胞[1]。成人骨髓中含有造血细胞和非造血细胞,非造血细胞与细胞外基质一起形成了支持造血的骨髓微环境(Bone marrow microenvironment,BMME)[8]。骨髓微环境中的细胞成分包括网状内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、成纤维样细胞[9],这些细胞通过分泌各种细胞因子、生长因子、以及自身细胞表面受体的表达,对造血细胞的附着、分化、自我更新起到了重要作用[10]。目前,普遍认为,在骨髓中至少存在两种干细胞群即造血干细胞(Haematopoietic stem cells,HSCs)和MSCs,前者是所有造血细胞的祖细胞[11,12],后者则是中胚层发育的早期细胞,这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离,不仅能分化为造血实质和基质细胞等,还分化为多种造血以外的组织,特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞,如脂肪细胞、成骨细胞、CMs、神经细胞等[13-16],MSCs向多种细胞分化及其诱导条件见表1。由于骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为骨髓中存在的另一种非造血干细胞的干细胞群具有易获得、易分离、易操作的优点。能够通过骨髓穿刺反复收集、体外大量扩增,取材方便,扩增后自体回输,不必应用免疫抑制剂,成为近年来最具吸引力的心肌种子细胞,具有广泛的临床应用前景。采用生物学技术将骨髓间充质干细胞进行自体心肌内移植,修复损伤心肌组织是近年来心血管病研究领域的一大热点。

表1

MSCs向多种细胞分化的诱导条件

细胞类型诱导物质或细胞因子

成骨细胞地塞米松,β-磷酸甘油,1,25-(OH)2-D3,抗坏血酸,BMPs(骨形态蛋白)

骨髓基质血清,PDGF,Hydrocrtisone(皮质醇)

肌腱BMPs,GDFs

肌肉组织5-Aza(5-氮胞苷),PDGF(血小板衍生生长因子),bFGF(成纤维细胞生长因子)

软骨细胞高密度压片培养,无血清培养基,地塞米松,抗坏血酸,TGF-β,BMPs

脂肪细胞地塞米松,IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤),Indomethacin(消炎痛)

2 国外研究趋势

1999年Makino等[17]首次报道MSCs体外成功地向CMs诱导分化,这是一个具有里程碑意义的研究。他们用3μM的

作者单位:121001锦州,辽宁医学院解剖学教研室

5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)对从小鼠骨髓中分离出的MSCs进行体外诱导,发现经5-Aza处理1周后,大约30%的MSCs细胞形态发生改变,细胞体积变大,呈球状或向同一方向延展成棒状,2周后与周围细胞相连,3周后细胞间通过闰盘相连并形成肌管,出现CMs表型,部分细胞克隆可出现自发性收缩;透射电镜观察显示心肌终端样结构,形成的肌管结构中包括典型的肌小节、丰富的糖原颗粒;RT-PCR及Southern blot显示诱导的细胞表达心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)、α-MHC、β-MHC、MLC-2v、α-骨骼肌肌动蛋白及α-心肌肌动蛋白;免疫细胞化学染色Myosin、Actin及Desmin阳性;并且诱导的细胞有着几种不同的动作电位,最为典型的是窦房结样和心室肌样动作电位;整个的研究表明小鼠MSCs分化为完全成熟且具有兴奋性、能自发跳动的CMs,并且构建出诱导后的心肌细胞系(Cadiomyocyte cell lines)。这一研究所建立的心肌细胞系为BMSCs移植在缺血性心脏病的治疗提供了应用基础。2000年,Wang等的研究表明,如果BMSCs在体外不经过肌细胞分化诱导,移植到正常心肌组织中也能够产生“环境依赖性分化”,表达心脏的表型。然而,Tomita等在大鼠的冷冻心肌梗死模型上发现,只有预先体外化学诱导的BMSC细胞才能改善2个月后的心脏功能,因此,BMSCs是否必须经过体外的预诱导才能在体内转化为心肌细胞尚无定论[18]。2001年,Orlic等选用eGFP高表达的雄性转基因小鼠,从骨髓中筛选、培养扩增的造血干细胞谱系特异性抗原阴性(Lin-)而干细胞因子阳性(c-kit+)的原始干细胞,冠脉夹闭5 h后注射之急性梗死边缘的正常心肌组织内,9 d后在新修复的心肌块中,来源于血液干细胞的新的心肌细胞达到近70%。新修复的心肌组织中包括了心肌细胞和新生血管。在12只存活小鼠中发现,移植细胞(表达GFP,成绿色荧光)分化为形态较小的肌细胞,与胚胎和新生肌细胞相似,不仅Y染色体阳性,还可以表达一些肌特异性蛋白包括心脏肌凝蛋白,以及转录因子GATA4/MEF2和Csx/Nkx2.5。这些细胞同时也表达闰盘蛋白connexin43。BrdU掺入分裂细胞DNA及核内细胞周期相关蛋白K167的表达提示肌细胞存在增殖分裂。在新生心肌组织中也发现有新生血管的形成。在新生的毛细血管和小动脉中存在eGFP阳性的内皮细胞和平滑肌细胞,分别表达Ⅷ因子和α平滑肌肌动蛋白。而骨髓Lin-c-kit-细胞移植到损伤心肌中没有发生心肌再生。血流动力学参数提示Lin-c-kit+细胞移植后可改善左心功能。这些体内试验的研究结果表明,高度富集的成体骨髓Lin-c-kit+细胞移植能在梗死区分化、增殖,形成大量的心肌细胞群,小动静脉和毛细血管,并与受体心肌细胞、血管连接,与受体心脏融为一体,显著改善心脏功能[19]。2002年,Tomita和同事们继续观察了自体骨髓基质细胞移植对大动物的心肌再生作用。采用缩窄环建立猪的左冠状动脉前降支(left anterior descending artery,LAD)远端心肌梗死模型,抽取髂骨骨髓,分离基质细胞,体外培养,5-氮胞苷诱导分化,在冠脉闭塞后4周行SPECT检查,心肌梗死区注射1×108个骨髓基质细胞(BrdU标记),冠脉闭塞后8重复SPECT检查,并进行心肌形态学和组织学分析。发现在梗死区移植细胞呈岛状分布,具有横纹和Z带,表达心肌肌钙蛋白I(cTn I),在移植区由有更大的血管密度,SPECT发现治疗组的射血分数、局部灌注及室壁运动明显改善,压力-容积分析显示收缩弹性末期弹性和左室舒张末期压力均有改善,提示自体骨髓基质细胞移植可形成岛状心肌细胞,促进血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收缩功能[20]。2002年,Shake等采用犬LAD结扎60 min的心肌梗死模型,心肌梗死后2周将6×107个BMSCs注射到心肌梗死区,移植后4周心脏收缩功能改善,提示MSC具有心肌再生的作用。可望成为临床上治疗心肌梗死的有效方法[21]。2005年Yoon等把hBMSCs和新生鼠的心肌细胞共同培养。诱导hBMSCs向心肌细胞分化。表达心肌特异性结构蛋白基因如α肌球蛋白重链基因(α-MHC),以及心肌细胞特异性转录因子Nkx2.5,CATA4和心钠素(ANP)。这个发现证实了hMSCs有向心肌分化的潜能。[22]

3 国内研究趋势

韩永生,等人(2004)将大鼠基质细胞注入同源的大鼠的心脏中。发该细胞表达肌球蛋白重链和连接蛋白43,后者的表达提示了细胞间隙连接的形成。为了明确hBMSCs是否能够植入梗死组织区域。笔者用注射器直接将hBMSCs注入无胸腺大鼠的实验性心梗模型中。在此实验系统中笔者发现hBMSCs能移植入梗死组织区域并存活至少两个月。同时还表达横纹肌蛋白。为满足人类的治疗需求,还进行了另外一些研究即在猪的心梗模型的基础上发展hBMSCs移植的方法和技术。尽管许多工作有待进一步进行,但现有的结果显示植入的hBMSCs能分化出心肌细胞表型,并在心脏组织受损或缺血时能促进细胞性的心脏形成术[23]。贾绍斌等用大鼠BMSCs在诱导剂5-aza的作用下,可以向心肌样细胞方向转化。形态学上BMSCs在5-aza干预后,细胞由原来扁平多角形变成长梭形,部分细胞体积明显增粗,可见到有些细胞间有融样发生,可以有类似肌管样细胞出现。通过RT-PCR发现BMSC经过诱导后与诱导前完全不同,前着表达心肌特异的ANP和BNP基因,此现象揭示诱导后BMSC可向心肌细胞分化[24]。吕铁伟等多人诱导BMSCs分化成心肌细胞,可观察到BMSCs向心肌细胞样形态的改变明显[25,26,27],免疫组化显示cTnI表达阳性率高。说明5-aza能够诱导BMSCs向心肌细胞转化。荧光免疫组化方法鉴定心肌特征性蛋白肌球蛋白重链(MHC)和连接蛋白Connexin43的表达,应用半定量RT-PCR技术分析TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、TEF-1和RARα等相关调控基因在分化过程中的动态时序表达。考虑TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4和MEF-2C可能是调控BMSCs定向分化为心肌样细胞的重要调控基因。为进一步细胞移植治疗心肌梗死,改善心功能提供了理论基础,为临床应用提供理论依据和技术支持[28,29]。

汪蕾等(2004)观察心肌细胞(cardiomyocytes,CM)与BMSCs直接接触和非直接接触对诱导BMSCs成心肌样分化的影响。体外以新生大鼠CM与BMSCs直接接触和非直接接触的培养方式模拟心肌微环境,分析BMSCs形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果:直接接触共培养的BMSCs与CM同步搏动,且心肌特异性肌钙蛋白T染色阳性,阳性率为1.3%;而心肌细胞条件培养液无法单独诱导BMSCs的横向分化得出结论:与CM细胞间的直接接触是诱导BMSCs分化为心肌细胞的必须条件,条件培养液则非关键因素[30,31]。郭军等(2004)探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和干细胞因子(SCF)预处理对BMSCs向心肌细胞分化具有促分化作用[32]。

杨志健等体外诱导出能自发跳动的心肌细胞,使采用BMSC修复心肌损伤成为心血管疾病的研究热点。研究利用BMSC可诱导分化为心肌细胞的特点,以幼猪为研究对象,采用经冠脉转运的方法,将培养的自体BMSC移植至心肌梗死区,观察BMSC在心肌微环境下的转归及治疗作用[33-35]。

我国唯一2004年刘维新等人从转录启动到翻译后水平的证据均不支持体外5-aza处理可诱导BMSCs表达心肌特异性蛋白[36]。

4 问题与展望

大量的细胞体外培养诱导和动物体内实验,为细胞移植治疗心血管疾病提供了可能性和科学依据,充分说明MSCs作为心肌干细胞的来源,具有重要的临床意义和良好的应用远景。目前,干细胞在心血管疾病的研究中还处于临床前实验阶段,对于干细胞在心血管疾病中作用的认识也仅是初步的,还存在很多问题亟待解决,如移植的最佳部位和时机?对于不同程度的心肌损伤采用细胞移植的数量如何量化?啮齿类动物模型能否准确反应人类心脏的状态和移植后的反应?在心血管疾病状态中病理作用下对植入的干细胞的影响?源于植入细胞的新生CMs是否具有完整的功能以及它们的寿命?移植后其分化能力能保持多久?替代组织的功能能维持多久?是否能改善心室重构从而改善心血管疾病的远期预后?如何避免植入干细胞受损,增加干细胞的数量,纠正干细胞的异常?尽管如此,可以预见,随着干细胞研究的深入,应用最近发展的组织工程学技术和干细胞诱导技术,将间充质干细胞诱导分化为心肌细胞,在体外构建组织工程化心肌组织,为心脏外科手术治疗心脏病,提供了一种全新的思路和治疗策略。不久的将来,MSCs的移植将会给心血管疾病的治疗带来巨大变革。

参 考 文 献

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