微生物多样性分析
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微生物多样性分析范文第1篇
【关键词】环境工程;DGGE技术;废水生物处理
1.新技术在环境工程生物处理研究中的应用
由于PCR-DGGE技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muvzer等开辟了DGGE在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究，在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。
1．1在废水生物处理研究中的应用
PCR-DGGE技术在废水生物处理研究中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。
Lapara等研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响，DGGE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。
应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同，使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下，产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加，其菌群结构相似程度也越来越高。
硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤。但由于氨氧化细菌的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分离培养分析法研究氨氧化细菌相当费时、繁琐。许玫英等采用PCR扩增16SrDNA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术，分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性，并在国内首次采用PCR-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DGGE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理效果。
应用PCR-DGGE技术对城市污水化学一生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究，对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富，但是种群结构相差很大。说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。
R0wan等采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水，运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。
采用PcR-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化一缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究，确定了微生物的优势菌种，并进行了多样性分析，结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。
1．2 在废气生物处理研究中的应用
生物过滤是一种能有效处理恶臭和挥发性有机废气的气体污染控制技术。生物滤池和生物滤塔作为生物处理恶臭气体的简单有效的方法，得到了快速的发展。
采用PCR-DGGE技术研究除臭生物滤池中试装置中分别一处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，结合应用DGGE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化，并回收主要的DN段，结合PCR测序及T载体克隆测序，明确优势菌群的系统发育地位。结果表明，除臭生物滤池在不同的口H条件下，微生物的多样性及其丰度存在较大差别，强酸性对微生物具有较高的选择作用，与中性条件相比 微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间分布多样性差异，序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位。为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据，同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。
生物滤塔中微生物的种群结构以及微生物多样性对于恶臭气体的处理效率以及反应器的稳定运行至关重要。殷峻等应用DGGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论：填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少；与污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物处理研究中的应用
在污泥处理过程中，污泥的稳定化是…个相当重要的过程。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。傅以钢等用DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DGGE指纹图谱和相似性系数Cs值分析，发现随着反应的持续进行，微生态结构的Cs值越来越高，说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选，调整内部细菌种群结构，从而达至 适应环境的目的，在发酵过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。
2.技术的原理
微生物多样性分析范文第2篇
关键词：土壤微生物；多样性；DNA；提取技术
中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5253-06
Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research
XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.
Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method
土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。
长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1%左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养[2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此，有关微生物多样性研究进展不大。
近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落总DNA的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3]。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组DNA。关于土壤微生物DNA提取方法的报道很多[4，5]，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组DNA的提取方法及其提取效果。另外，细胞裂解不完全、DNA分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、DNA分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物DNA提取的质量，因而提取土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[6]。本文主要对DNA提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。
1 基于DNA方法的土壤微生物多样性研究现状
传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性，并且如果某种微生物的PLFA是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别[7，8]。
1980年，Torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌DNA的方法，并于1990年将其成功应用于DNA杂交技术，研究发现1 g土壤中有4 000个以上不同的细菌种类，说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域，在不同的个体间16S rDNA基因序列也不会进行基因交换，因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识。此后，基于16S rDNA基因的指纹图谱分析的现代分子生物学技术得到迅速发展，包括限制性片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增DNA多态性分析（RAPD）、单链构象多态性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。其总的技术路线：分离微生物基因组DNA，用特异性引物扩增16S rRNA基因片段，再将该PCR扩增产物进行更深一步分析，从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化[10]。
2 土壤微生物总DNA的提取
从土壤样品中提取DNA的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总DNA。直接裂解法是不去除土壤等杂质，而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合，直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放DNA，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，都存在一定的缺陷，要想提取较完整的DNA需要具备以下几个条件： ①土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。②对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌DNA折断。③采集土壤样品后应尽快提取DNA，因为土壤在4 ℃储藏几周就会造成大分子DNA的降解。
2.1 间接提取土壤微生物总DNA
Torsvik等[11]最先报道了从土壤中提取微生物DNA的间接法，包括以下4个步骤：①分散土壤；②土壤微生物的提取（分离细胞与土壤）；③土壤微生物的纯化；④细胞裂解及DNA纯化。
2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内，因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散，或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0.2%焦磷酸钠，其他还有Winogradsky盐溶液、Tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等[26]。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现Chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同，采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放DNA很重要，处理不当会使DNA降解。常用分离提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。
2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1 μg/cm3）远小于土壤矿物质的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。Hopkins等[17]采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌。此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20 μm或30 μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化。
由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基础上提出了分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150 μm）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法，为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等[23]以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。分离提取土壤细菌和真菌的流程如图1所示。
2.1.3 土壤微生物的纯化 目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家Albertsson于20世纪50年代所建立，当时主要用于生物大分子的分离。近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法，该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛[24]。关于其分离机制目前尚不完全清楚，有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异，也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系统和PEG/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同[25]。Smith等[19]研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为4∶1的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层PEG相，土壤残存颗粒将进入下层Dextran相，经4次提取纯化，富集在上层PEG相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层PEG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran两相分离技术（A2PP）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0.1%胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4 ℃下振荡2 h，能较好地分散、纯化土壤细菌。研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌。
2.2 直接提取土壤微生物总DNA
现今的土壤细菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤：①原位细胞裂解；②DNA提取和纯化。
2.2.1 原位细胞裂解 直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合。机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂SDS和SarkosyI、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对DNA的提取效果较好。王啸波等[28]采用PBS缓冲液洗涤土壤样品，结合SDS裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物DNA和RNA，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验，从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等[29]采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，结果表明获得的DNA适合于酶解和PCR扩增要求。
值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的DNA具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法。研究表明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等[30]采用冻融+溶菌酶+SDS方法提取3种芽孢杆菌（G+）DNA，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了DNA，未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到DNA，且冻融处理未对DNA造成大的剪切，提取的DN段还大于23.1 kb。张颖慧等[31]使用优化的CTAB法提取真菌基因组DNA。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少，且得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA，可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等。
2.2.2 DNA提取和纯化 在已报道的DNA提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除DNA样品中的蛋白质和部分RNA，然后对DNA进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。
Lamontagne等[32]研究结果表明PVP能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸杂质、提高DNA纯度的作用。李靖宇等[33]采用氯化钙-SDS-酶法对湿地土壤微生物DNA进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高，能直接满足PCR扩增。李钧敏等[34]用含PVPP的缓冲液预洗DNA样品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于PCR分析的土壤微生物总DNA的提取方法。蔡刘体等[35]采用 SDS-CTAB法提取烟草病圃土壤微生物总DNA，该方法既可达到裂解效果，还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的质量。吴红萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物DNA进行纯化后，可用于PCR扩增，并以细菌16S rDNA基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物总DNA，然后用Sephadex G-200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的DNA。段学军等[38]采用稀释模板及巢式PCR法很好地解决了在DNA提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等[39]将BIO101 Systems公司研制的FastPrep多试管核酸提取系统与相应的Fast DNA SPINKit for Soil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总DNA。
没有哪种单一的纯化步骤可以除去所有污染物，故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。Smalla等[40]将粗提的DNA进行3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾沉淀；③Geneclean纯化。发现经前2步纯化的DNA通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化。
2.2.3 直接法和间接法的比较 研究表明，直接法获得的DNA较多，但不易去除抑制剂，间接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分离的DNA纯度较高，而且间接法得到的细菌量只占总菌群的25%～50%，直接法提得的DNA却可以超过细菌总DNA的60%。因此，要想获得大量DNA，选择直接法较好，当所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染时，可用间接提取法。
直接提取对某些特定样品用特定的操作方法能获得较高的提取效率，但是对有些生物量不高的样品则很难得到足够的环境总DNA用于后续操作，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下采用。间接提取在提取效率上远小于直接提取，但用间接提取法所得到的环境总DNA纯度较高，所有样品能直接用于PCR扩增，并且能更好地体现样品中微生物的多样性，适用于有大量样品的情况。
2.3 DNA的纯度和浓度测定
DNA在260 nm处有吸收峰，腐殖酸在230 nm处有吸收峰，计算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以确定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情况下OD230/OD260比值应在0.4～0.5之间为好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越严重。蛋白质在280 nm处有吸收峰，因此OD260/OD280比值经常被用来指示DNA中蛋白质的污染程度，当OD260/OD280比值为1.8～2.2时，DNA较纯，当受蛋白质或其他杂质污染时，OD260/OD280值则较低[41]。此外，还可采用PCR扩增检测DNA的纯化质量，所用扩增引物见文献[42]。
提取的DNA浓度也可根据测定的OD260值计算，根据公式[dsDNA]=50×OD260×稀释倍数，计算DNA的浓度（μg/mL），换算出每克干土提取DNA的量[43]；还可采用DyNA Quant 200荧光仪对纯化后DNA的浓度进行测定[28]。
3 影响土壤微生物总DNA提取的因子
土壤成分复杂，含有大量的有机及无机等多种生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可能影响土壤DNA的提取质量，抑制DNA聚合酶的活性从而影响土壤微生物多样性的分析。研究发现，腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除的污染物，由于它的分子大小和理化性质与DNA相似，过分注重腐殖酸的去除，势必会造成DNA的大量损失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的难点所在。
各种土壤类型、质地和成分的差异，都会影响土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法从8种土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量为5%～31%不等）中提取DNA，平均获得DNA的量为0.5～26.9 μg/g，并发现获得的DNA量与土壤的有机磷含量有明显的正相关关系。另外，研究也发现，土壤中细菌的裂解效率与其中黏粒的含量呈明显的负相关。土壤中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的顺序为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，细菌在粒径不同的土壤颗粒表面的最大与最小吸附量分别相差389.0和857.0倍，去有机质土壤颗粒对细菌吸附亲和力较含有机质土壤颗粒的大[45]。因此，不同的土壤适合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取过程中，应针对土壤类别选取合适的提取方法，以便进行后续研究。
4 小结
从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注[46]。因而越过分离培养的步骤，直接从土壤中获得总DNA以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总DNA。土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的DNA提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。
间接法提取的微生物DNA纯度较高，提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能地释放，能够代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的DNA质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分DNA的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析。最近，Milko等[47]发现一种Taq DNA聚合酶基因突变型可增加对腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要对基因组DNA进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。
绝大多数直接提取法提取的DN段长度不会超过23 kb，而DNA的某些用途如宏基因组文库构建，需要大片段的DNA，直接提取法对此几乎无能为力。
在DNA提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，DNA直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用[48]。但近年来有研究表明DNA提取的产率高不等同于微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相关研究[49]。这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果。
评价一种土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物DNA；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性。
5 展望
目前，国内外对土壤微生物总DNA提取方法的报道很多，但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取DNA还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。另外，将现代分子生物学技术与传统微生物研究方法结合起来，才能更全面地认识和理解土壤微生物群落多样性及其相应的生态功能。
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微生物多样性分析范文第3篇
1.定容重条件下生物炭对半干旱区土壤水分入渗特征的影响
2.1990-2010年中国土地利用变化对生物多样性保护重点区域的扰动
3.青藏高原高寒草甸植物群落生物量对氮、磷添加的响应
4.新疆连作棉田施用生物炭对土壤养分及微生物群落多样性的影响
5.荒漠草地4种灌木生物量分配特征
6.旱地土壤施用生物炭减少土壤氮损失及提高氮素利用率
7.生物肥部分替代化肥对花椰菜产量、品质、光合特性及肥料利用率的影响
8.不同秸秆生物炭对红壤性水稻土养分及微生物群落结构的影响
9.生物炭对土壤生境及植物生长影响的研究进展
10.沙质草地不同生活史植物的生物量分配对氮素和水分添加的响应
11.大兴安岭5种典型林型森林生物碳储量
12.水稻秸秆生物炭对耕地土壤有机碳及其CO_2释放的影响
13.土壤重金属钝化修复剂生物炭对镉的吸附特性研究
14.生物炭对不同土壤化学性质、小麦和糜子产量的影响
15.生物炭施用对矿区污染农田土壤上油菜生长和重金属富集的影响
16.准噶尔荒漠6种类短命植物生物量分配与异速生长关系
17.生物炭对土壤中微生物群落结构及其生物地球化学功能的影响
18.生物炭对水中五氯酚的吸附性能研究
19.生物炭和有机肥处理对平邑甜茶根系和土壤微生物群落功能多样性的影响
20.生物炭对旱作农田土壤理化性质及作物产量的影响
21.中国南方3种主要人工林生物量和生产力的动态变化
22.南海北部边缘盆地生物气/亚生物气资源与天然气水合物成矿成藏
23.基于多源遥感数据的草地生物量估算方法
24.生物炭对农田土壤微生物生态的影响研究进展
25.生物炭对土壤理化性质影响的研究进展
26.生物扰动对沉积物中污染物环境行为的影响研究进展
27.生物炭与秸秆添加对砂姜黑土团聚体组成和有机碳分布的影响
28.近十年中国生物入侵研究进展
29.荒漠灌木生物量多尺度估测——以梭梭为例
30.土壤有机污染物生物修复技术研究进展
31.生物医学大数据的现状与展望
32.黑河中游荒漠草地地上和地下生物量的分配格局
33.生物大灭绝研究三十年
34.不同热解温度生物炭对Cd(Ⅱ)的吸附特性
35.农用生物炭研究进展与前景
36.生物炭对水稻根系形态与生理特性及产量的影响
37.施用生物炭对旱作农田土壤有机碳、氮及其组分的影响
38.不同生物质来源和热解温度条件下制备的生物炭对菲的吸附行为
39.城市生物多样性分布格局研究进展
40.生物炭的土壤环境效应及其机制研究
41.辽河源不同龄组油松天然次生林生物量及空间分配特征
42.稻壳基生物炭对生菜Cd吸收及土壤养分的影响
43.小兴安岭7种典型林型林分生物量碳密度与固碳能力
44.东北林区4个天然针叶树种单木生物量模型误差结构及可加性模型
45.指数施肥对楸树无性系生物量分配和根系形态的影响
46.牛粪生物炭对水中氨氮的吸附特性
47.黄土丘陵区生物结皮对土壤物理属性的影响
48.半干旱沙地生境变化对植物地上生物量及其碳、氮储量的影响
49.青藏高原东缘野生暗紫贝母生物量分配格局对高山生态环境的适应
50.长江口及东海春季底栖硅藻、原生动物和小型底栖生物的生态特点
51.全球生物多样性评估方法及研究进展
52.中国生物多样性就地保护的研究与实践
53.温度与降水协同作用对短花针茅生物量及其分配的影响
54.环境质量评价中的生物指示与生物监测
55.土壤生物多样性研究:历史、现状与挑战
56.转录因子对木质素生物合成调控的研究进展
57.太赫兹科学技术在生物医学中的应用研究
58.玉米秸秆生物炭对Cd2+的吸附特性及影响因素
59.中国粮食作物秸秆焚烧排碳量及转化生物炭固碳量的估算
60.生物炭对我国南方红壤和黄棕壤理化性质的影响
61.黑龙江省大兴安岭森林生物量空间格局及其影响因素
62.不同生物质原料水热生物炭特性的研究
63.凤眼莲、稻草和污泥制备生物炭的特性表征与环境影响解析
64.东北地区两个主要树种地上生物量通用方程构建
65.不同来源生物炭对砷在土壤中吸附与解吸的影响
66.生物炭生产与农用的意义及国内外动态
67.秸秆生物反应堆与菌肥对温室番茄土壤微环境的影响
68.生物炭对土壤肥料的作用及未来研究
69.玉米秸秆生物炭对土壤无机氮素淋失风险的影响研究
70.黄土丘陵区生物结皮对土壤可蚀性的影响
71.内蒙古草甸草原与典型草原地下生物量与生产力季节动态及其碳库潜力
72.生物炭添加对黄土高原典型土壤田间持水量的影响
73.生物炭对黄土区土壤水分入渗、蒸发及硝态氮淋溶的影响
74.生物炭及其复合材料的制备与应用研究进展
75.生物炭及炭基硝酸铵肥料对土壤化学性质及作物产量的影响
76.臭冷杉生物量分配格局及异速生长模型
77.施用生物炭后塿土土壤微生物及酶活性变化特征
78.宁夏荒漠草原不同群落生物多样性与生物量关系及影响因子分析
79.中国生物多样性调查与保护研究进展
80.三种小球藻生物柴油品质指标评价
81.AM真菌对重金属污染土壤生物修复的应用与机理
82.含度量误差的黑龙江省主要树种生物量相容性模型
83.生物炭与农业环境研究回顾与展望
84.氮磷添加对巨桉幼苗生物量分配和C:N:P化学计量特征的影响
85.生物炭对土壤肥力与环境质量的影响机制与风险解析
86.东北林区天然白桦相容性生物量模型
87.氮肥与生物炭施用对稻麦轮作系统甲烷和氧化亚氮排放的影响
88.黄土高原丘陵区生物结皮土壤的斥水性
89.检测食品沙门氏菌的生物传感器持久性研究
90.生物炭对砂壤土节水保肥及番茄产量的影响研究
91.土壤碳收支对秸秆与秸秆生物炭还田的响应及其机制
92.抑制烟草青枯病型生物有机肥的田间防效研究
93.生物炭对塿土土壤含水量、有机碳及速效养分含量的影响
94.生物炭对宁夏引黄灌区水稻产量及氮素利用率的影响
95.茶叶生物化学研究进展
96.鄂尔多斯盆地西缘奥陶纪生物礁基本特征、分布规律及成礁模式
97.中国履行《生物多样性公约》二十年:行动、进展与展望
98.不同时期施用生物炭对稻田N_2O和CH_4排放的影响
99.生物炭对设施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物的调节
100.生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤可培养微生物区系的影响
101.柴达木盆地几种荒漠灌丛植被的生物量分配格局
102.牛粪生物炭对磷的吸附特性及其影响因素研究
103.红树林植物生物量研究进展
104.农业活动及转基因作物对农田生物多样性的影响
105.煤矸石场植被自然恢复初期草本植物生物量研究
106.铁改性生物炭对磷的吸附及磷形态的变化特征
107.青藏高原草地地下生物量与环境因子的关系
108.蔬菜种植农户施用生物农药意愿研究
109 生物炭对夏玉米生长和产量的影响
110.不同生物炭添加量下植烟土壤养分的淋失
111.生物DNA条形码:十年发展历程、研究尺度和功能
112.生物炭和生物炭基氮肥的理化特征及其作物肥效评价
113.木质素与生物燃料生产:降低含量或解除束缚?
114.生物炭添加对半干旱地区土壤温室气体排放的影响
115.磷回收对厌氧/好氧交替式生物滤池蓄磷/除磷的影响
116.天山林区六种灌木生物量的建模及其器官分配的适应性
117.非模式生物转录组研究
118.添加生物炭对灌淤土土壤养分含量和氮素淋失的影响
119.生物炭和腐植酸类对猪粪堆肥重金属的钝化效果
120.间伐对川西亚高山粗枝云杉人工林细根生物量及碳储量的影响
121.生物多样性信息学研究进展
122.长白落叶松林龄序列上的生物量及碳储量分配规律
123.不同烧制温度下玉米秸秆生物炭的性质及对萘的吸附性能
124.利用农业生物多样性持续控制有害生物
125.腾格里沙漠东南缘4种灌木的生物量预测模型
126.生物炭碳封存技术研究进展
127.猪粪制备的生物炭对西维因的吸附与催化水解作用
128.生物炭修复土壤重金属污染的研究进展
129.古尔班通古特沙漠4种荒漠草本植物不同生长期的生物量分配与叶片化学计量特征
130.生物炭覆盖对底泥污染物释放的影响
131.闽楠幼树光合特性及生物量分配对光环境的响应
微生物多样性分析范文第4篇
关键词 生物入侵；马缨丹；根际土壤；土壤理化性质
中图分类号 S451 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）20-0084-03
Effects of Lantana camara Invasion on Soil Physical-chemical Properties in Rhizosphere and Non-rhizosphere Zone
KANG Xiao-wu DAI Ting-ting
（Institute of Tropical and Subtropical Ecology，South China Agricultural University，Guangzhou Guangdong 510642）
Abstract The effects of L.camara invasion on rhizosphere and non-rhizosphere soil nutrients，soil enzyme activities，microbial biomass with microbial functional diversity were studied by quadrat experiment in the field.The experimental results showed that the invasion of L.camara significantly improved the content of soil organic matter，total nitrogen，total potassium，nitrogen，available phosphorus，potassium and microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus.At the same time，the invasion significantly improved the activity of soil urease，protease，sucrosemetabolic，cellulase，catalase and the metabolic activity，carbon source utilization and diversity index of soil microbial community.The promoting effect was higher on the rhizospheric soil than on the non-rhizospheric soil （bulk soil）.
Key words bioinvasion；Lantana camara；rhizosphere soil ；soil physical-chemical properties
马缨丹（Lantana camara）为马鞭草科（Verbenaceae）马缨丹属（Lantana）多年生常绿灌木，原产于热带美洲，现广泛分布于热带、亚热带和温带地区，是世界上危害最严重的100种有害外来入侵物种之一[1]。马缨丹作为一种外来入侵植物，植株繁殖能力强，蔓延迅速，能够在短时间内大面积侵占森林、果园、牧场和农耕地，破坏当地的生物多样性和自然生态系统，并因其植株有毒而严重威胁到人畜健康和农牧业生产[2-3]。1645 年马缨丹作为一种观赏花卉引入我国，现已在广东、广西、海南、云南等地大量蔓延扩散，对当地的生物多样性、农业生产和生态安全造成严重威胁[4-5]。
有研究表明，一年蓬（Erigeron annual Fleabane）、加拿大蓬（Erigeron canadensis）、加拿大一枝黄花（Solidago canad-ensis）等植物入侵后对根际土壤理化性质产生了不同程度的影响[5-6]；外来入侵植物紫茎泽兰（Eupatorium adenopho-rum）、黄顶菊（Flaveria bidentis）等可以不同程度地提高入侵地土壤的全磷养分和速效养分[7-8]。目前，国内外学者在马缨丹的生物学特性、分布危害、防治以及开发利用等方面开展了大量的工作，但对马缨丹植株的化感作用及其入侵对土壤微生态特性的影响研究较少[9-15]。笔者通过野外样方试验，研究了马缨丹入侵对根际、非根际的土壤养分、土壤酶活性、土壤微生物生物量与土壤微生物功能多样性的影响效应，旨在从化感作用、土壤反馈作用的角度探索马缨丹的入侵机制及入侵效应，从而为更好地管理、控制马缨丹的入侵危害提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
马缨丹单优群落的根际土壤与非根际土壤均采自于华南农业大学增城教学基地。
1.2 试验方法
在华南农业大学增城教学科研基地，选取马缨丹单优群落（马缨丹植株覆盖率80%～90%，群落高度150～250 cm，入侵年限大于6年）内的健壮植株，用锄头挖取植株地下根系（0～20 cm），抖去根系上的大块土壤，然后用细毛刷刷取根系表层黏贴的土壤，去除杂质后作为根际土壤，而拌落后的大块土壤作为非根际土壤；同时选取距离马缨丹群落50 m以外，且周围都没有马缨丹植株生长的荒坡草地的表层土壤（0～10 cm）作为对照（CK）。每个处理3次重复，每次重复之间相隔200 m以上。将采集的土壤装袋运回实验室，其中一部分土样置于室内自然风干，除去动植物残体，研磨过100目筛，用于土壤养分含量、土壤酶活性的测定分析；另一部分样品暂时冷藏于-18 ℃冰箱，用于测定土壤微生物生物量碳、氮、磷。
1.3 数据统计方法
所有试验数据均在Microsoft Excel上完成处理，通过SPSS 13.0进行方差分析（one way ANOVA），并采用Duncan新复极差法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 马缨丹入侵对根际、非根际土壤全量、速效养分的影响
2.1.1 土壤全量养分。土壤有机质、全氮（TN）和全钾（TK）含量在各处理中的变化规律一致，即根际土壤的含量最高，非根际土壤次之，CK的含量最小，各处理的差异显著（表1）。其中与 CK相比，根际土壤的有机质、TN和TK含量分别增加40.77%、38.13%、30.16%；而与非根际土壤相比，则分别增加23.24%、14.97%和13.11%。对于土壤TP含量，根际土壤分别比CK、非根际土壤增加65.22%、58.33%，差异显著；而非根际土壤的TP含量虽略高于CK，但差异不显著。说明马缨丹入侵能显著提高自身根际的土壤有机质、TN、TP和TK含量，同时也显著提高非根际的土壤有机质、TN和TK的含量，但相对而言，其对根际土壤养分的提升效果更加明显。
2.1.2 土壤速效养分。在3个处理中，马缨丹根际土壤的碱解氮含量最高，并且显著高于非根际土壤和CK，而非根际土壤的碱解氮含量虽然略高于CK，但两者的差异不显著（表2）。对于土壤的速效磷、速效钾含量，均表现为根际土壤的含量最高，非根际土壤的含量次之，CK的含量最低，各处理间的差异显著。其中与CK相比，根际、非根际土壤的碱解氮含量分别增加32.67%和0.75%，速效磷含量分别增加87.14%和48.87%，速效钾含量分别增加115.70%和62.72%，可见马缨丹入侵能显著提高土壤碱解氮、速效磷和速效钾含量，尤其是对根际土壤的养分提升作用更强。
2.2 马缨丹入侵对根际、非根际土壤酶活性的影响
与CK相比，马缨丹入侵显著提高了土壤脲酶、蛋白酶活性，其中根际土壤的脲酶、蛋白酶活性分别比CK提高104.06%和74.34%，非根际土壤的脲酶、蛋白酶活性也分别比CK增加45.53%和46.90%。可见，马缨丹入侵对根际土壤脲酶、蛋白酶活性的促进效果更强。土壤蔗糖酶、纤维素酶的活性变化也呈现类似的规律，即在3个处理中均表现为根际、非根际土壤的酶活性显著高于CK，且根际土壤的酶活性亦显著高于非根际土壤（表3）。其中根际、非根际土壤的蔗糖酶活性分别是CK的227.56%和157.11%，纤维素酶活性分别是CK的264.39%和161.73%。可见，马缨丹入侵能显著提高根际、非根际土壤中蔗糖酶和纤维素酶的活性，加强对土壤中有机碳的利用，并且这种增强效应在根际土壤的表现更为显著。另外，马缨丹入侵亦能显著提高自身根际、非根际土壤的过氧化氢酶活性，与CK相比，其增幅分别达到45.95%和27.03%
2.3 马缨丹入侵对根际、非根际土壤微生物生物量的影响
土壤微生物生物量碳、氮、磷含量在各个处理中的变化规律一致，均表现为根际、非根际土壤含量显著高于CK，同时根际土壤含量亦显著高于非根际土壤（表4）。其中与CK相比，根际土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量分别提高238.76%、53.55%、243.61%，非根际土壤微生物生物量碳、氮、磷含量也分别提高130.31%、14.34%、124.15%。可见，马缨丹入侵对根际土壤微生物生物量碳、氮、磷含量的提升效应更强。
2.4 马缨丹入侵对根际、非根际土壤微生物群落功能多样性的影响
2.4.1 土壤微生物群落代谢活性。平均孔颜色变化率（average well color development，AWCD）反映土壤微生物利用碳源的整体能力与代谢活性，也是评价利用单一碳源能力的重要指标，可作为微生物整体活性的有效指标。AWCD 值的变化（斜率）和最终能达到的值反映了土壤微生物利用某一碳源物质的能力。由图1可知，各处理中土壤微生物的AWCD值均随着培育时间的延长不断上升，变化趋势一致。在最初的24 h内AWCD变化较小，24～72 h急剧上升，然后持续缓慢升高。培养期间CK土壤微生物群落的AWCD值均处于较低水平，根际土壤微生物群落的AWCD值则处于最高水平，各处理的AWCD在整个培育周期内均表现为根际土壤>非根际土壤>CK，其中根际土壤在培养24 h后一直到培养结束，其微生物群落的AWCD值均显著高于CK，亦显著高于非根际土壤；而非根际土壤在0～72 h内的AWCD值与CK差异不显著，72 h后与CK差异显著。这说明马缨
丹入侵后明显提高了土壤微生物群落的代谢活性，并且对根际土壤的影响效应更明显。
2.4.2 土壤微生物群落碳源利用率。在6类碳源中，马缨丹非根际土壤微生物群落对氨基类、酚类碳源的利用率与CK的差异不显著，但对其他碳源的利用率则显著高于CK（表5）。而根际土壤微生物群落对6类碳源的利用率均显著高于CK，亦显著高于非根际土壤，其中根际土壤微生物群落对碳水化合物类、羧酸类、聚合物类、氨基酸类、酚类和胺类碳源的利用率分别比CK增加96.91%、83.70%、82.43%、41.13%、55.74%和110.45%。可见，马缨丹入侵显著提高了土壤微生物群落对6种碳源的利用率，尤其对根际土壤的改善作用更强。
2.4.3 土壤微生物群落碳源利用的多样性。与CK相比，马缨丹入侵显著提高了根际土壤微生物群落的Shannon-Wiener指数H′、Mc Intosh指数U、丰富度指数S和Simpson优势度指数Ds，而非根际土壤微生物群落的Mc Intosh指数U、丰富度指数S也显著上升。对于Pielou均匀度指数E，各处理的差异均不明显。说明马缨丹入侵能够促进土壤微生物群落功能多样性的提高，尤其对根际土壤的影响更强。
3 结论与讨论
植物对土壤养分的吸收利用与土壤对植物生长发育过程中的反馈作用是物种竞争取胜的重要驱动机制之一[16]。大多数研究指出，外来植物入侵能够加快土壤营养循环过程，提高土壤肥力，有利于促进自身的进一步入侵扩散。外来植物皱果苋入侵后，土壤中碳、氮、磷的浓度显著上升，其中入侵区的全磷、可溶性磷几乎分别提高3倍和2倍[17]。土壤酶主要来源于土壤微生物的代谢过程和土壤中植物、动物的活体分泌或残体分解，能够参与土壤生态系统许多重要的生物化学过程和物质循环，通过催化土壤中的生化反应发挥重要作用，能够客观地反映土壤肥力状况与系统功能[18-21]。土壤微生物生物量是土壤中最活跃的肥力因子之一，参与土壤有机质分解、腐殖质形成和土壤养分的循环转化过程，能够反映土壤同化与矿化能力的高低，是土壤生态系统肥力的重要生物学指标[22]。在外来植物与本地植物的关系中，土壤微生物群落可能起到了桥梁作用，外来植物通过改变土壤微生物群落的结构组成、区系数量与生理功能，破坏土著植物与土壤微生物在长期演化过程所形成的平衡共生关系，影响土著种的资源获取、生长繁殖与种群更新，从而使自身在竞争中获得更大优势，成功入侵[23-25]。
本研究结果表明，马缨丹入侵后，根际、非根际土壤的有机质、全氮、全磷和全钾均显著上升，并且马缨丹入侵对根际土壤养分的提升效果更为显著，根际土壤的有机质、全氮、全钾含量均显著高于非根际土壤。同时，马缨丹入侵亦能显著提高土壤的速效养分，马缨丹根际、非根际土壤中的碱解氮、速效磷和速效钾均显著高于对照；并且马缨丹根际土壤的速效养分亦显著高于非根际土壤。可见，马缨丹入侵显著提高了土壤不同肥力特征，且对根际土壤肥力的提高作用更强，而根际土壤的养分更有利于根系的吸收利用，这可能是马缨丹能够入侵成功和快速扩张蔓延的生态机制之一。马缨丹的入侵显著提高了土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、纤维素酶和过氧化氢酶的活性，且根际土壤酶的活性均显著高于非根际土壤。这说明马缨丹的入侵有利于土壤营养物质的循环转化过程。入侵区土壤酶活性较高，这将有利于活化土壤养分，提高其有效性，进而促进自身的入侵蔓延。马缨丹入侵能够显著提高土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量，且根际土壤的微生物生物量碳、氮、磷含量显著高于非根际土壤。马缨丹入侵后能显著提高土壤微生物群落的代谢活性、碳源利用率和多样性指数，并且其对根际土壤的影响效应显著高于非根际土壤。说明马缨丹入侵后能通过提高自身生境土壤的微生物群落代谢活性从而促进土壤养分循环与转化，这也许是马缨丹成功入侵扩散的原因之一。本文仅研究探讨了马缨丹入侵对土壤养分、土壤微生物生物量、土壤微生物功能多样性的影响效应，而关于土壤微生物群落结构的变化及其反馈作用，可进一步阐明马缨丹成功入侵以及对本地植物生长影响的土壤生态学机理，今后可加强该方面的研究。
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微生物多样性分析范文第5篇
1氧化亚铁硫杆菌的生理特性
氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans):是生物湿法冶金过程主要的浸矿菌种。这种菌系短杆菌,很小,0.3～0.5×1.0-2.0um,圆钝末端,以单个、双个或几个成短链状存在。是一种化能自养菌,专性好氧,嗜酸性,广泛生活在金属硫化矿和煤矿的酸性矿坑水中。最适生长温度25℃～30℃。生长在pH1.4～6.0之间,最适pH2.0～2.5。T.f以氧化亚铁、元素硫以及还原态的硫化合物等来获得生命过程所需的能量,以空气中的二氧化碳为碳源,以氨或铵盐为氮源。有鞭毛,能快速游动,革兰氏染色阴性。在9K固体培养基上呈红棕色菌落,近杆形[5]。
2氧化亚铁硫杆菌的氧化机理
自20世纪60年代以来,因为它们具有特殊的生物学功能,吸引了许多学者对T.f和T.t的生理特性进行了研究。许多研究表明,T.t利用单质硫的能力比T.f强,但T.t不能利用硫酸亚铁。Wong和Henry对氧化硫酸亚铁的机理进行了详细的研究,指出能将亚铁氧化成三价铁,三价铁会与硫酸根离子发生反应产生铁矾沉淀,同时产生硫酸而引起pH的下降:
4FeSO4+02+2H2SO42Fe2(SO4)3+2H2O
(1)
6Fe3++4SO42-+12H2O2HFe3(SO4)2(OH)6 +10H+(2)
Templellvl和Leathen等人研究发现氧化亚铁硫杆菌能将矿物中的硫化矿物氧化为硫酸和硫酸盐。Bryne等对T.f氧化硫化矿物的机制进行了详细的研究。并提出了一些常见矿物的主要反应机理,如黄铁矿和黄铜矿:
2FeS2+702+2H202FeSO4+2H2SO4
(3)
4FeSO4+02+2H2SO42Fe2(SO4)3+2H20
(4)
CuFeS2+402CuS04+FeSO4 (5)
2Cu2S+02+2H2 SO42CuS+2CuSO4+2H20
(6)
CuS+202CuS04(7)
3微生物分子生态学研究的一般方法和原理
微生物分子生态学是分子生态学的重要组成部分,是分子生物学、微生物生态学、微生物生理学与遗传学相互结合而产生的一门边缘学科。从目前的发展状况来看,当前的主要研究领域有:采用分子生物学技术研究不同自然环境中微生物的种类组成和群落结构以及它们的数量动态；环境因子对微生物基因表达的影响:自然条件下微生物之间遗传物质的转移:微生物与高等生物相互作用的分子机制,包括共生关系的建立、病原微生物的致病机制等。因此,微生物分子生态学是利用现代分子生物学的基础理论与技术,在分子水平上,研究微生物与其生态环境间相互关系的一门新兴学科。
3.1 一般研究方法
(1)平板涂布分离。
(2)显微镜观察:普通光镜、相差显微镜、透射电镜、扫描电镜。
(3)MPN法,即最大或然值计数法,是平板涂布分离法的一种,但由于广泛应用,被单独作为微生物研究的一种技术。
(4)活菌计数法,常见的用哑咙橙染色,活菌死菌颜色不一样。
3.2 分子研究方法
(1)纯种分离,G+C测定、16SrDNA, ISR测序、比对。
(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE),通用引物PCR扩增同样长度的基因,常为16S的一段(300bp～400bp),割胶纯化、克隆测序,比对变性梯度凝胶电泳((DGGE)技术以土壤微生物群体的基因组DNA为研究对象,通过比较不同土壤中各种微生物的16SrRNA基因信息来了解微生物的多样性。
(3)FISH荧光原位杂交,设计不同荧光染料标记的特异探针,检测不同分类界元水平的细菌,可在细胞水平或者核酸水平与目标菌种杂交,在表面荧光显微镜或者CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)下监测。
(4)TRFLP,末端限制性长度多态性。
(5)ARDREA.RISA。
(6)流式细胞仪计数。
(7)Real-time实时荧光定量PCR监测技术。
(8)克隆转化法:通用引物扩增从水样、土样中提取得总DNA,获得全长的16S rDNA序列,随机克隆入载体,转化到大肠杆菌,挑取阳性菌落,用不同的限制酶酶切检测不同的克隆,测序、比对。
(9)DNA芯片技术,主要用来研究微生物的功能基因组学。
4本论文的立论依据
AMD的pH通常很低,严重的地方可达pH2.0,富含SO42-离子和Fe3+离子,易浸出废矿石中的有毒元素,如铅、砷、铬、铜等以及氰化物,对矿业生产、生态环境造成严重危害,所以就AMD的研究越来越重要。我国自1959年以来,对微生物处理污水的技术的研究已取得了一定的成果,但重点放在污水菌种的保藏的研究方面,而且就整体情况而言与国外相比要差的远,在污水处理微生物生物学方面的研究相对于前者明显滞后。不仅设备、工艺落后,更主要的是对微生物本身没有作进一步的研究,缺乏对菌种生物学性状较为全面的认识,譬如菌种的生理、生化性状以及分类地位的了解,缺乏对菌种分子水平上的认识及其在污水处理过程中菌种所参与的机理等的研究,因而也就不能很好的指导生产实践。从目前发表的一些较为零碎的文献及几本专著看出,在酸性污水中细菌的研究方面,生物领域的科技工作非常薄弱,主要是一些污水治理方面的专业人员在从事相关研究。
目前,我国对浸矿细菌的资源开发工作做的远远不够,根据国内外文献报道,用于处理酸性污水的细菌有氧化硫硫杆菌(A.Thiooxidans)和氧化亚铁硫杆菌((Acidithiobacillus ferrooxidans);钩端螺菌(Leptospirillum)、中等嗜高温菌,如文献报道的硫化杆菌属(Sulfobacillus),如热氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosuidooxidan)以及一些未确定分类位置的细菌、嗜酸嗜高温古细菌等。就细菌遗传多样性、系统学研究工作来说,目前国内发表的文献主要集中在放线菌、根瘤菌、嗜盐碱的古菌方面,对硫杆菌其他浸矿细菌的多样性及系统发育工作而言,国内尚见较为系统的报道。因此,对硫杆菌及其它浸矿细菌的多样性研究就很有必要。
(1)硫杆菌(Thiobacillus)及其它嗜酸菌分子系统学研究目标及意义。
在地球表面广泛分布有元素硫及其金属化合物而形成的许多特殊环境,如硫铁矿、地表及海底的含硫热泉等。近年来,由于各国微生物学家对极端环境条件中的微生物资源的研究开发成为一个热点,使得硫铁矿、含硫热泉等酸性条件中的微生物多样性的研究取得了较快的进展,发现了许多生理生化性状特殊的细菌,其中有些归属于硫杆菌,有些目前还未确定其系统位置。分子生物学技术在含硫的酸性环境微生物系统学、生态学研究中的广泛应用,不仅发现了许多常规技术不能发现的新细菌,也对这些细菌的分类及系统学地位的确定提供了有力的手段,同时对一些已知细菌的分类及系统位置进行了修订,使得传统意义上的硫杆菌分类更趋合理,尽量可以建立一个亚利士多德所谓的接近于自然的分类体系。对氧化亚铁硫杆菌系统学地位的确定不仅具有重要的理论意义,对指导细菌浸矿等生产实践中优良菌株的选择也具有直接的应用价值。我国地域广阔,各种含硫的矿产资源及自然生态环境非常多样化,蕴含着非常丰富的代谢硫的细菌资源,而倍受国外微生物学家的关注,因此加大这些细菌资源的开发和研究力度,将为这些细菌的生产应用实践奠定理论基础。本课题研究的目标之一就是大量开发我国不同酸矿环境中的微生物资源,尤其是一些硫氧化细菌及其这些细菌的分子系统学的研究。
(2)不同环境中嗜酸菌的遗传多样性研究及其意义。
由于Acidithiobacillusferrooxidans,A.thiooxidans,A.caldus, Leptospirillumferroo xidans这几种细菌能够氧化亚铁、还原性的金属硫化矿,目前被广泛应用于微生物湿法冶金、煤和天然气脱硫、酸性矿区的生态恢复治理、污水处理等技术,使得这些细菌成为微生物学家研究的热点之一。但是由于硫矿的化学组成不同与含硫酸性环境在地球上的生态分布与多样性极其复杂,使得这类细菌同一种不同菌株的生理生化性状表现出显著的不同,形成了表型差异明显不同的菌株,同时造成这些细菌不同菌株的遗传组成差异显著,即所谓的遗传多样性,利用分子生物学技术研究这些细菌的遗传差异,不仅有助于筛选、鉴定出性状明显不同、在浸矿实践中针对不同化学组成的矿体表现高效的菌株,反过来也可以从物种进化上阐明不同环境造成的选择压对细菌进化的作用以及细菌对环境的适应性,进一步对表型差异悬殊、介于相似种之间的菌株的系统学地位重新进行研究修订,并且有助于阐明自然界广泛分布的许多代谢硫、铁有关的细菌的起源及进化关系。目前,虽然微生物冶金基础研究被列为国家973重点基础发展计划,但我国在浸矿细菌的生物学基础研究方面所作的工作几为空白,对这些细菌的多样性有待进一步研究挖掘。从世界各地大量采集分离纯化菌株,进一步阐明这些细菌的分子系统学及进化关系,从遗传多样性的角度选择优良菌株,为应用于生产实践提供理论基础。
由于我国生态环境多样性非常丰富,存在各种各样的富含金属及硫化合物的生态环境,因此有可能分离到生理及遗传差异明显的不同菌种,存在非常丰富的种以上水平和种下水平的多样性。但到目前为止,国内对嗜酸细菌物种多样性和遗传多样性的研究几乎为空白,基于此这两个细菌多样性的研究是本课题的主要目标之一。
5前景展望
在研究的基础上,进行微生物优势群落的生理生化分析和限制多态性分析,可继续进行矿区酸性污水微生物类群多样性的研究,进而研究矿区酸性污水微生物类群的结构和分布的特异性,进而确定这些菌株分类学和系统发育学地位。由于条件有限,本研究许多方法、步骤还有待改进和完善(比如在提取污泥中细菌的方法上我们有待改进),在未分离和测序的种群中,还蕴藏着丰富的微生物资源,需要进行进一步的研究。随着工业污水微生物资源研究理论的发展和研究技术的完善,人们必定从工业污水微生物中获得瞩目成果,更好地为人们的生产生活服务。
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