纳米粒的制备技术
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纳米粒的制备技术范文第1篇
[中图分类号] R460.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）05（b）-0033-04
[Abstract] Nanoparticles is a new technology in the area of pharmaceutics. Its good target and delayed release effect come from it special physico-chemical property， which makes it become the focus in the study area of pharmaceutics. This article reviewed carrier material， the preparation methods and the research progress of nanoparticles， the particles and solid lipid nanoparticles and magnetic lipid nanoparticles. At last the article lookes forward the front review of drug-loading nanoparticles.
[Key words] Nanoparticles； Carrier material； Preparation methods
纳米粒是药物溶解、包裹于高分子材料中形成的粒径在10～100 nm范围内的固体胶体颗粒[1]，根据药物在载体材料中存在的形式，可以分为纳米球和纳米囊。药物溶解于骨架材料中，成型后以细小微粒或结晶分散于骨架材料，形成纳米球，而药物与材料不相混溶时，药物被载体材料包裹，形成纳米囊。
纳米粒10～100 nm范围内的粒径，可以隐藏药物的理化特性，药物在体内的过程依赖于载体的理化特性。普通纳米粒在静注之后，大都会被单核吞噬细胞系统（MPS）摄取，故能被动靶向治疗MPS相关疾病，但对其他系统疾病具有一定的局限性。将普通纳米粒修饰成长循环纳米粒，能够有效减小或避免纳米粒在体内对吞噬细胞的趋向性，或者将普通纳米粒连接上糖基、抗体、配体等，制备成主动靶向的纳米粒，是近年来的研究趋势[2]。本文就载药纳米粒的载体材料、制备方法的研究进展进行综述。
1 载体材料
1.1 生物不可降解型聚合物
此类载体在体内不能降解成可代谢产物，主要有聚丙烯酰胺类和聚甲基丙烯酸烷酯类。以聚丙烯酰胺类生物不可降解材料制备的纳米粒或纳米球，更多的应用于污水处理、造纸及石油钻采等领域[3]。王文喜[4]用聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核苷酸载体，能改变反义寡核苷酸在细胞内的分布，避免反义寡核苷酸被溶酶体内核酸酶的降解，增加其稳定性。但因此类聚合物在体内无法降解成可代谢产物，故较少采用此类载体材料作为体内制剂使用。
1.2 生物降解型聚合物
生物降解型聚合物包括聚氰基丙烯酸烷酯和聚酯类等化合物。前者主要为聚氰基丙烯酸的甲酯、乙酯、丁酯等，其代谢产物为甲醛，对机体有一定的毒性。聚酯类化合物有聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸- 羟基乙酸共聚物（PLGA）等，聚酯类的载体，中间代谢产物为乳酸，在体内代谢最终以CO2、H2O的形式排泄，生物相容性更好，在研究和实际应用中更为常用。PLA、PLGA已获美国FDA 批准用于注射用药。用于治疗前列腺癌的曲普瑞林注射剂（Decapepty）即采用PLGA做骨架，制备而成的微球注射剂，每次注射可以在体内缓释30 d。
1.3 天然高分子材料
亲水性聚合物包括明胶、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、蛋白等。天然高分子材料较为常用，性质稳定，生物相容性好。明胶可生物降解，抗原性小，较为常用，如蔡梦军等[5]以明胶为载体材料，制备阿霉素明胶纳米粒，得到粒径为100 nm左右，粒径分布均匀且具有缓释效果的纳米粒。
壳聚糖具有较好的生物黏附性、促吸收效应和酶抑制载体作用等特性，使其在生物黏附给药系统、透膜给药系统、靶向给药系统及缓控释制剂的开发中倍受青睐[6]。壳聚糖的结构中含有游离的氨基，呈弱碱性，能与芳香醛或脂肪醛反应生成西佛碱（Schiff's base），可利用此特点进行交联。壳聚糖的生物相容性和生物降解性能都非常优秀，在研究中，较多应用。制成纳米粒后，其生物学性质有所改变，在体内能完全降解且具有一定的缓释效果[7]。
蛋白类常用的有牛或人的血清白蛋白、玉米蛋白、鸡蛋白等，由于蛋白类交联较为容易，故研究中也常用其作为载体材料。白蛋白为内源性物质，研究发现，将其作为载体，可减少巨噬细胞对其吞噬，起到长循环的效果。由美国生命科学（American Bioscience）公司开发的白蛋白结合紫杉醇纳米粒注射混悬液（paclitaxel，ABRAXANE）2005年已经上市[8]，用于治疗转移性乳腺癌联合化疗失败后或辅助化疗6个月内复发的乳腺癌。
1.4 脂质材料
以生物相容性高的高熔点脂质载体材料制备的纳米球称为固体脂质纳米球（solid lipid nanospheres，SLN）。脂质材料包括饱和脂肪酸的甘油酯、硬脂酸、棕榈酸、甾体等。SLN的乳化可用磷脂等来乳化，乳化后，SLN其亲水部分朝向周围的分散介质，疏水部分插入颗粒核心。但SLN对疏水性药物包封效果较好，对水溶性的药物包封效果欠佳[9]。
1.5 磁性材料
目前较为常用的磁性材料是Fe3O4磁粉或磁流体。采用磁性材料制备的纳米粒在外加磁场的作用下发生定向移动，具有较强的靶向性[10]。磁性纳米粒的表面因Fe3O4的存在极易与商品化的硅烷试剂发生反应，使二氧化硅包覆在其表面而成复合纳米粒[11-12]。包覆在表面的二氧化硅层上的硅烷醇基团极易与硅烷试剂发生耦合反应，得到的纳米粒表面含有氨基、醛基等基团可以与多种生物分子发生键合反应。这使得磁性微球可以进一步进行修饰，达到主动靶向的目的。
2 制备方法
2.1 天然高分子载体纳米粒
2.1.1 白蛋白载体
2.1.1.1 超声乳化法 蛋白类载体材料，先将其乳化成大小均匀的乳滴，然后再通过化学或其他方法交联，较易制得微米级的制剂，但纳米级的制剂易受分子大小及纯度的影响，在制备中，1996年Müller等[13]采用超声乳化技术可以得到粒径小于200 nm的白蛋白纳米粒。王恺等[14]采用超声乳化-化学交联法制备丝裂霉素的白蛋白纳米粒，粒径在60～100 nm。此方法主要在于超声的过程可以让乳滴粒径更小，从而交联得到粒径更小的纳米粒。
2.1.1.2 溶剂-非溶剂化法 向白蛋白溶液中加入脱水剂如丙酮、乙醇等，白蛋白分子表面水化膜在脱水剂的作用下作用下被除去变性析出（去溶剂化），再采用化学交联剂或加热变性的方法固化纳米粒。加热的方法较易控制交联的程度，且毒性物质残留较少。如果采用化学交联剂如戊二醛或其他有机溶剂，则需除去残留戊二醛及有机溶剂以保证纯度。Langer等[15]用乙醇作脱水剂，加入到白蛋白溶液中，在NaCl存在条件下调整pH，得到的纳米粒粒径小于300 nm。此法通过pH和盐浓度的调整，白蛋白在远离其等电点时利用带电粒子之间的斥力，可制备粒径较小的纳米粒，相比较用戊二醛交联，毒性更小
2.1.1.3 pH-凝聚法 通过改变体系的pH值，可以使蛋白发生沉淀生成纳米粒。但仅通过改变体系的pH值制备纳米粒，不方便控制纳米粒的粒径。更多的是与盐浓度的调整结合或者加入其他溶剂来控制粒径，得到粒径均匀及外形圆整的纳米粒。Sanhti等[16]通过改变体系的pH、盐浓度，加入化学交联剂体积制备得到粒径为497.6 nm的纳米粒，外形圆整。
以上为较为常见的白蛋白纳米粒的制备方法，简单易行，溶剂残留少，制备效果佳。此外，还有报道采用快速膨胀超临界溶液法、机械研磨法等方法制备白蛋白纳米粒。
快速膨胀超临界溶液法为近10年来发展起来的一项制备超细粒子的新技术，此方法工艺流程简单，所需有机溶剂少，制备的粒子粒径均匀可调整，但产量小，且所需设备及生产调节要求高，故在药物制剂的实际生产和实验中较少报道，而主要见于化工类产品的生产和研究[17]。
机械研磨法是制备水溶性纳米粒的一种方法，将亲水性的大分子（如蛋白质、抗体、抗原、淀粉、环糊精、亲和素、链酶亲和素、聚乙二醇、聚乙烯醇、环芳烃等）与非极性或弱极性有机溶剂中具有特殊荧光性能或磁性的纳米颗粒直接混合，通过机械研磨的方法使亲水性大分子吸附在纳米粒上，待有机试剂完全挥发后，加入水或缓冲溶液溶解，再经过两次离心分离，便可制成纯的水溶性的纳米颗粒[18]。该方法已获得相关专利。
2.1.2 明胶载体
明胶具有良好的乳化性能，而且可以溶于热水，冷却后形成凝胶，利用此特性，可制备纳米球。采用先乳化，然后冷却胶凝的方法，即可制得纳米球。此方法可适用于热敏感药物。赵阳等[19]用乳化凝聚法制得低分子肝素明胶纳米粒，分散性好、粒径在40～100 nm圆形或椭圆形，包封率达80%以上。此方法简单易行，载体价廉易得，所需实验条件容易操作，所得产品质量较好，故见诸较多报道。
2.1.3 壳聚糖载体
2.1.3.1 化学交联法 壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，结构中含有游离的氨基，能与芳香醛或脂肪醛反应生成Schiff's碱，利用此特点可与交联剂如戊二醛等反应来制备纳米粒。在此方法中被结合的氨基失去了靶向修饰的能力。郭英等[20]于采用化学交联法制备阿司匹林壳聚糖微球，制得的微球最小粒径可达到20 nm。制得的载药微球在16 h内对药物有良好的缓释作用，在25 h之内仍存在缓药效。
2.1.3.2 离子胶凝法 此方法通过壳聚糖带正电氨基与阴离子静电作用而发生物理交联反应形成纳米粒，在此过程中，起到阴离子作用的电解质的量直接影响到粒子的交联度，从而影响到粒径的大小、药物的释放[21]。同样，不同脱乙酰度及不同分子量的壳聚糖对纳米粒的药物释放也有影响。何文等[22]通过离子胶凝法制备了的壳聚糖纳米粒，结果表明，随着壳聚糖脱乙酰度的降低，纳米粒Zeta电位降低，粒径增大，药物包封率下降，且体外释药速度加快。
以上两种方法为最为常用的壳聚糖纳米粒制备方法。此外，去溶剂化法、乳化聚合法、液中干燥法也见诸报道，均能制得质量较好的壳聚糖纳米粒。
去溶剂化法又称沉淀析出法。其基本原理是：在高分子材料的水溶液中加入凝聚剂（为强亲水性物质如电解质硫酸钠、硫酸铵、氯化钠等），因水分子与凝聚剂结合，高分子物质的溶解度随之降低，形成分子间氢键，后从溶液中析出形成纳米粒[23]。
乳化聚合法是目前制备纳米粒的最主要方法之一。即利用表面活性剂作用将两种不相溶的溶剂制备成微乳，在微乳滴中经成核聚结团聚热处理后得到纳米粒。乳化聚合的成核机理主要是齐聚物成核与乳胶粒成核，是一种非连续成核的过程，即在乳胶粒生长阶段， 胶粒数目不变， 粒径不断增大。该法适用于在酸性介质中溶解度较大的药物[24]。
液中干燥法即将药物和高分子材料溶于有机溶剂作为油相，加乳化剂与水相制成O/W型乳状液。加热挥发有机溶剂即制得纳米粒。此法适合制备亲脂性药物纳米粒[25]。
2.2 固体脂质纳米粒的制备
2.2.1 纳米乳法
微乳法制备SLN。将熔融的脂质材料中加入乳化剂、药物及附加剂，通过搅拌，制成O/W型微乳，将微乳分散于冷水（2～3℃）中，便可形成SLN分散体系[26]。
2.2.2 高压乳匀法
也称之为熔融-匀化法，即在纳米乳法的基础上，将初乳在70℃以上高压均化，均化的过程使纳米粒粒径更小，更均匀。如杨时成等[27]采用此法制备喜树碱固体脂质纳米粒，初乳80℃通氮气41.4 MPa压力下在高压乳匀机上乳匀5次，得到平均粒径196.8 nm，均匀的纳米粒。
2.2.3 溶剂乳化蒸发法
溶剂乳化蒸发法是将药物和类脂混合物溶于合适的有机溶剂中， 加到含有乳化剂的水相中乳化，然后蒸去有机溶剂，便可形成SLN的稳定分散体系[28]。此方法可以避免药物遇热稳定性发生改变的问题。Zhang等[29]采用此法制得了丙酸倍氯米松-SLN，具有良好的缓释效果。
2.3 磁性纳米粒的制备
2.3.1 乳化聚合法
即在普通的聚合物、天然高分子材料等制备纳米粒的过程中，加入磁性物质，采用乳化聚合法使药物和磁性物质均匀分散在聚合物网状结构中。乳化聚合法根据载体材料的不同，具体的制备方法有所不同，如白蛋白微球通常用乳化-交联固化法或乳化-加热固化法制备；明胶微球可用乳化-交联固化法。通过调整搅拌速度可以控制所得微粒的粒径，得到微球或纳米粒。吴远等[30]采用化学沉淀法制备 Fe3O4超微磁粉，以聚 （5，5-二甲-三亚甲基碳酸酯-共-三亚甲基碳酸酯）为膜材，包裹纳米级Fe3O4磁粉，制备出丝裂霉素-聚碳酸酯磁性微球。该磁性微球具有良好的磁响应性能，体外对肝癌细胞Bel-7402有较强的细胞毒作用，裸鼠人肝癌模型靶向治疗实验显示良好的抑制肿瘤作用。对于肝靶向治疗，显示了很好的研究基础。
2.3.2 二步法
二步法即先制备磁性高分子聚合物微粒，再通过吸附或共价键与药物结合。也可以先制备载药微粒，然后再与磁性物质反应生成磁性纳米粒。石可瑜等[31]采用共沉淀法制备葡聚糖磁性毫微粒，再羧甲基化修饰得羧甲基葡聚糖磁性纳米粒，用高碘酸钠氧化，再与多柔比星药物分子通过Schiff反应偶联制得载药磁性纳米粒。制备的纳米粒直径56 nm，磁导向性能好，能有效定位于靶区，可以起到对肿瘤的定向治疗作用。
3 展望
纳米粒作为一种新型药物载体，其独特的物理化学性质，使之在抗肿瘤制剂的研究中，具有明显的优势。纳米级的粒径，使之能够透过肿瘤组织的血管壁间隙，使载药纳米粒能沉积在肿瘤组织部位，发挥抗肿瘤作用。此外，作为抗生素、抗病毒药物的载体，可以提高药物治疗细胞内细菌感染的作用；作为口服制剂的载体，可以防止药物在胃肠道的失活，提高其稳定性，提高生物利用度；作为黏膜给药的载体，可以延长其在作用部位的时间，提高疗效。在纳米粒上进行糖基、抗体、配体等修饰，又可让其具有主动靶向的作用。其制剂优势非常明显，制备方法研究也很多，但目前实验室研究报道较多，见诸报道的上市产品较少，其原因可能与辅料的安全性、制剂技术的稳定性有关。随着制剂技术和药用辅料的不断发展，纳米粒的研究和应用会有更广阔的空间。
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纳米粒的制备技术范文第2篇
1.1原药纳米化后呈现新的药效或增强原有疗效中药被制成粒径0.1～100nm大小，其物理、化学、生物学特性可能发生深刻的变化，使活性增强和/或产生新的药效。如灵芝通过纳米级处理，可将孢子破壁，并采用超临界流体萃取技术萃取出灵芝孢子的脂质活性物质，从而增强抗肿瘤的功效。
1．2改善难溶性药物的口服吸收
在表面活性剂、水等存在下，直接将药物粉碎成纳米混悬剂，增加了药物溶解度，适于口服、注射等途径给药，以提高生物利用度。
1．3增加药物对血脑屏障或生物膜的穿透性
纳米粒能够穿透大粒子难以进入的器官组织、血脑屏障及生物膜。如阿霉素α聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(NADM)可以改变阿霉素的体内分布特征，对肝、脾表现出明显的靶向性，而血、心、肺、肾中的药物分布则减少。
1．4靶向作用
徐碧辉教授等在研究中发现，一味普通的中药牛黄，加工到纳米级水平后，其理化性质和疗效会发生惊人的变化，甚至可以治疗某些疑难杂症，并具有极强的靶向作用。
1.5使药物达到缓释、控释
借助高分子纳米粒作载体等技术手段，可实现药物的缓释、控释。如雷公藤乙酸乙酯提取物固体纳米脂质粒有良好的缓释、控释功能。
2纳米中药的制备技术及其进展［3］
纳米中药的制备是研究纳米中药最基础的，也是最重要的问题。将纳米技术引入中药的研究，必须考虑中药组方的多样性、成分的复杂性，例如中药单味药可分为矿物质、植类药、动物药和菌物药等，中药的有效部位和有效成分又包括无机化合物和有机化合物、水溶性成分和脂溶性成分等，因此，针对不同的药物，在进行纳米化时必须采用不同的技术路线。此外，还必需考虑中药的剂型。纳米中药与中药新制剂关系十分密切，如何在中医理论的指导下进行纳米中药新制剂的研究，将中药制成高效、速效、长效、剂量小、低毒、服用方便的现代化制剂，也是进行中药纳米化所必须考虑的问题。纳米中药是针对中药的有效成分或有效部位进行纳米技术加工处理，开发中药的新功效。聚合物纳米粒可作为药物纳米粒子和药物纳米载体。药物纳米载体系指溶解或分散有药物的各种纳米粒，药物纳米载体包括纳米脂质体、固体脂质纳米粒以及纳米囊和纳米球。而对于不同类型的纳米中药，有不同的制备方法。
2.1药物纳米粒子的制备
药物纳米粒子的制备是针对组成中药方剂的单味药的有效部位或有效成分进行纳米技术加工处理。在进行纳米中药粒子的加工时，必须考虑中药处方的多样性、中药成份的复杂性。
纳米超微化技术［4］，是改进某些药物的难溶性或保护某些药物的特殊活性，适用于不宜工业化提取的某些中药。如矿物药、贵重药、有毒中药、有效成分易受湿热破坏的药物、有效成分不明的药物。目前比较常用的是超微粉碎技术。所谓超微粉碎是指利用机械或流体动力的途径将物质颗粒粉碎至粒径小于10μm的过程。根据破坏物质分子间内聚力的方式不同，目前的超微粉碎设备可分为机械粉碎机、气流粉碎机、超声波粉碎机。
机械粉碎法［5］是利用机械力的作用来实现粉碎目的。边可君等采用自主开发的温度可控(-30～-50℃)的惰性气氛高能球磨装置系统制备纳米石决明。将石决明置于配有深冷外套的惰性气氛球磨罐中，同时装入磨球，磨球与石决明粉比保持在15：1～5：1范围，控制高能球磨机的转速(200～400r／min)和时间(2～60h)，获得了平均粒度不大于100nm的石决明粉末。
气流粉碎法［6］是以压缩空气或过热蒸汽通过喷嘴产生的超音速高湍流气流作用为颗粒的载体。颗粒与颗粒之间或颗粒与固定板之间发生冲击性挤压、摩擦和剪切等作用，从而达到粉碎的目的。与普通机械冲击式超微粉碎机相比，气流粉碎产品粉碎更细，粒度分布范围更窄。同时气体在喷嘴处膨胀降温，粉碎过程中不会产生很大的热量。所以粉碎温升很低。这一特性对于低融点和热敏性物料的超微粉碎特别重要。世界上首项将纳米技术应用于中药加工领域的纳米级中药微胶囊生产技术，是通过对植物生理活性成分和有效部位进行提取。并用超音速干燥技术制成纳米级包囊。利用这项技术生产出的甘草粉体和绞股蓝粉体。经西安交通大学材料科学工程学院金属材料强度国家重点实验室和第四军医大学基础部药物化学研究室鉴定，均达到了纳米级。其中甘草微胶囊微粒平均粒径为19nm。这样的纳米粒可跨越血脑障碍，实现脑位靶向［6］。
中药纳米超微化技术既丰富了传统的炮制方法，又能为中药的生产和应用带来新的活力。纳米产品目前已成为中药行业新的经济增长点。将这项技术应用于中药行业可以开发具有更好疗效、更优品种的纳米中药新产品。这将对中药行业的发展带来深远的理论和现实意义。
2.2药物纳米载体的制备
药物纳米载体的制备主要是选择特殊的材料，它们应具备以下特征：性质稳定，不与药物产生化学反应，无毒，无刺激，生物相容性好，不影响人的正常生理活动，有适宜的药物释放速率，能与药物配伍，不影响药物的物理作用和含量测定；有一定的力学强度和可塑性(即易于形成具有一定强度的纳米粒，并能够完全包封药物或使药物较完全的进入到微球的骨架内)；具有符合要求的黏度、亲水性、渗透性、溶解性等性质。这与所用药物的性质、给药方式有关［7］。近年来，可生物降解的高分子载体材料被认为是很有潜力的药物传递体系，因为它们性能多样，适应性广，且具有良好的药物控制性质，达到靶向部位的能力及经口服给药方式能够传递蛋白质、肽链、基因等药物的性能。常见的高分子材料有淀粉及其衍生物、明胶、海藻酸盐、蛋白类、聚酯类等。
对于纳米中药载体，目前常用的是纳米包复技术［8］。纳米包复化学药品和生物制品的技术在世界药学领域是最受关注的前沿技术之一。根据待包复的中药的性质不同，可选取不同的纳米包复技术，得到纳米中药。毛声俊等［9］采用3琥珀酸3O硬脂醇甘草次酸酯作为导向分子，采用乙醇注入法制备了甘草酸表面修饰脂质体，作为肝细胞主动靶向给药的载体。杨时成等［10］采用热分散技术将喜树碱制成poloxamer188包衣的固体脂质纳米粒混悬液。陈大兵等［11］用“乳化蒸发—低温固化”法制备紫杉醇长循环固体脂质纳米粒，延长了药物在体内的滞留时间。
此外，还有乳化聚合法［12］、高压乳匀法［13］、聚合物分散法等。制备成纳米微粒载体系统的中药多为单一有效成分，如抗肝癌或肝炎药物：蓖麻毒蛋白、猪苓多糖、斑蝥素、羟喜树碱、黄芪多糖等；抗感染药：小檗碱等；消化道疾病药：硫酸氢黄连素等；抗肿瘤药：秋水仙碱、高三尖杉酯碱、泰素等；心血管疾病药：银杏叶有效成分等；其它还有鹤草酚、苦杏仁苷等。也有将多种中药成分复合后制备纳米微粒载体系统的，如口服结肠靶向给药系统——通便通胶囊，其主药成分为3种极性相似的火麻仁油、郁李仁油和莱菔子油的混合油。还有将中药复合西药后制备纳米微粒载体系统的，如多相脂质体1393，其主要成分为氟脲嘧啶、人参多糖和油酸等；中药复方“散结化瘀冲剂”浸膏和5氟脲嘧啶(5FU)相结合后制备的磁性微球制剂也属此列。总之，不同的制备技术和工艺适合不同种类纳米中药的制备。
3问题与展望
尽管目前纳米技术的研究进展一日千里，纳米技术的飞速发展将有可能使中药的现代化迈上一个台阶，但是，目前纳米中药的研究尚处于基础阶段，纳米中药的制备技术也很不成熟，有许多问题仍需进一步研究。纳米粒制备时，载体材料多为生物降解性的合成高分子，在体内降解较慢，连续给药会产生蓄积，且降解产物有一定的毒性。另外有毒有机溶剂、表面活性剂的应用都给纳米控释系统的产业化带来了较大的困难。美国Rice大学生物和环境纳米技术中心(CBEN)主任VickiColvin认为至少有两点需要引起重视：“一是纳米材料微小，它们有可能进入人体中那些大颗粒所不能到达的区域，如健康细胞。二是对比普通材料纳米量级性质会有所改变”。也就是很有可能在粒径减小到一定程度时，原本可视为无毒或毒性不强的纳米材料开始出现毒性或毒性明显加强，例如改变纳米材料表面的电荷性质，改变纳米材料所处的物理化学环境，相同的纳米材料可能会出现不同的毒性，纳米材料在生物体内可能会出现特殊的代谢情况，并且可能会与某些特定部位的器官或者组织细胞进行作用进而使其带来某些特而且纳米化后中药有效成分和药效学的不确定性，将给药物质量的稳定可控留下隐患。另外纳米中药的范围应有所限制，当一种中药粉碎到了纳米级时，药效可能会发生改变，不能为获得纳米微粒而损坏了药物的有效成分。目前对中药的微观研究尚不深入，对其有效成分与非有效成分还认识不清，仓促对其纳米化处理有可能得不偿失。在目前这个时期，进行商品化的纳米中药生产为时尚早。而应该进行开发纳米中药的制备技术研究并建立一整套纳米药理、药效和毒理学的理论与系统评价方法。
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纳米粒的制备技术范文第3篇
[关键词]人参皂苷；冰片；纳米粒；抗肿瘤
[Abstract]To prepare ginsenosideRh2 lipid nanoparticles， and investigate the synergistic effect with borneol in resisting tumor activity in vitro GinsenosideRh2 lipid nanoparticles were prepared by ultrasonicassisted solvent evaporation method， and orthogonal design was adopted to optimize formulation process Its encapsulation efficiency， drug loading ratio， particle size distribution， Zeta potential， morphology and in vitro drug release behavior were characterized， and synergistic effect with borneol in resisting tumor activity were preliminarily studied by MTT These nanoemulsion particles prepared by the optimized process method were rounding and even in a good shape Encapsulation efficiency and drug loading ratio of three batches of nanoemulsion particles were （773±25）% and （72±02）%， respectively Nanoemulsion particles showed an obvious sustained release characteristics， with 5242% cumulative release within 96 h The killing effect of nanoemulsion particles on glioma cells was dosedependent， with IC50 of 2233 μmol・L-1 and 1146 μmol・L-1 after 24 h and 48 h， respectively After the combination with borneol， the killing effect of nanoemulsion particles on glioma cells was dosedependent， with IC50 of 1636 μmol・L-1 and 804 μmol・L-1 after 24 h and 48 h， respectively
[Key words]ginsenosides； borneol； nanoparticles； antitumor
doi：10.4268/cjcmm20160713
人参Panax ginseng CAMeyer是我国传统名贵中药材，具有大补元气、补气益肺、安神益智的功效，药用历史悠久，素有“百草药王”的美誉，其中人参皂苷是人参中主要有效组分。现代研究表明，人参皂苷具有显著抗肿瘤、抗衰老等药理作用[1]，其中人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）成分是一种次级苷元，具有广谱抗肿瘤作用[25]，其主要作用机制是通过调节免疫功能，抑制肿瘤的浸润和转移、诱导癌细胞凋亡及抑制肿瘤新生血管的形成、逆转肿瘤细胞的耐药性、增强化疗抗癌药物的药效、诱导癌细胞分化并抑制癌细胞生长，还可以预防或减轻化疗的毒副作用等，表现出极强的应用前景。但由于人参皂苷Rh2水溶性差、生物利用度低、易被肿瘤细胞高表达的P糖蛋白外排等特点，极大程度限制其抗肿瘤应用。
近年来，将纳米载体应用于药物抗肿瘤传递研究中，体现出巨大的优势，可显著改善药物水溶性，增加药物在肿瘤组织的蓄积，提高肿瘤细胞中药物浓度，减少药物毒副反应等[6]。目前，纳米乳、脂质体、聚合物胶束、纳米微球等多种纳米形式已广泛应用于中药抗肿瘤活性成分递药研究中，并取得良好效果[7]，但目前还较少有研究对人参皂苷Rh2进行纳米包载和抗肿瘤的研究。脂质聚合物纳米粒[8]是一种新型的纳米载药体系，基于脂质材料与聚合物材料的良好生物安全性，将脂质纳米粒的高稳定性与聚合物内核的优良载药性能相结合，同时具有体内长循环作用和高渗透长滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR effect）。但由于存在血脑屏障，导致游离药物或者脂质纳米粒都很难进入脑部病患，目前化疗手段对于脑部病变的治疗效果仍有限，以脑胶质瘤为代表的脑部疾病治疗缺乏有效的递药手段。
冰片是龙脑香科植物龙脑香树脂的提取物，《本草纲目》记载冰片有“引药上行”之功效，在许多中成药中作为“药引”，可以促进药物跨过血脑屏障，作为脑部病变的引经药，应用于脑靶向给药系统[911]。目前研究表明冰片与药物或纳米载药复合物共用具有促进药物入脑递送的作用[1213]。本研究针对人参皂苷Rh2游离形式在水溶性和抗肿瘤作用的不足，采用脂质聚合物纳米粒将其包载于内核，得到具有核壳结构的纳米递药系统，用以抗脑胶质瘤，并与冰片协同给药，以增强抗脑胶质瘤细胞作用。通过考察人参皂苷Rh2包载工艺、理化性质和协同冰片后纳米粒的体外抗细胞增殖作用，研究其作为脑胶质瘤治疗给药手段的可能性。
1材料
METTELER AE200S型电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；RTElite恒温磁力搅拌器（美国Thermo Scientific公司）；NanoZSP 纳米粒度电位分析仪（英国 Malvern仪器有限公司）；MillQ 超纯水仪（美国Millpore公司）；H600型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；FH100型恒流蠕动泵（美国Thermo Scientific公司）；SpectraMax M5 酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）。
人参皂苷Rh2（纯度≥98%，成都曼斯特公司）；（+）冰片（纯度≥98%，大连美仑生物技术有限公司）；PEG2000DSPE聚二乙醇修饰磷脂（西安瑞禧生物科技有限公司）；PLGA聚（乳酸羟基乙酸）共聚物（山东岱罡生物制品公司）；蛋黄卵磷脂（SIGMAALDRICH 中国）；脑胶质瘤C6细胞株（中国科学院上海细胞研究所）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；DMEM 高糖培养液（武汉博世德生物医药技术有限公司）；其他试剂均为分析纯。
2方法
21人参皂苷Rh2含量测定采用Waters e2695 HPLCUV测定人参皂苷Rh2含量。色谱柱Waters C18柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱温25 ℃，检测波长203 nm，流动相水乙腈（40∶60），流速10 mL・min-1。精密称取人参皂苷Rh2对照品适量于量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度配成储备液01 g・L-1。分别精密吸取一定量储备液配制成100，50，25，125，625，3125 mg・L-1系列质量浓度的对照品溶液，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得线性回归方程及线性关系，并考察日间和日内精密度。
22脂质聚合物纳米粒的制备采用超声辅助溶剂挥发法制备纳米粒。将一定量蛋黄卵磷脂与PEGDSPE溶于少量无水乙醇中，缓慢滴加入温水（水相）中，持续搅拌一段时间，另将人参皂苷Rh2与PLGA材料共溶于乙腈（油相）中，超声后缓慢滴加入脂质水溶液中，冰浴超声再持续搅拌一段时间，采用旋转蒸发仪减压除去残余有机溶剂，过045 μm滤膜，除去未包载药物，再过022 μm滤膜灭菌，得均匀的泛乳光纳米溶液。
在单因素试验基础上，选取蛋黄卵磷脂与PEGDSPE比例、人参皂苷Rh2与PLGA材料比例、油相和水相体积比为考察因素，选取包封率和载药率为综合评价指标，权重系数均为05，采用正交设计优化制备工艺。
23脂质聚合物纳米粒的表征取适量纳米粒溶液（1 g・L-1）滴于铜网上，静置10 min后用滤纸片吸干，再滴加20%磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，用透射电子显微镜观察纳米粒形态。采用激光粒度测定仪测定纳米粒平均粒径和 Zeta 电位。
基于微孔滤膜过滤法除去游离药物，分别吸取等体积过滤前后的纳米溶液，根据体积1∶1加入乙腈超声使其破乳溶解，并定容至刻度，稀释至合适质量浓度，于1万 r・min-1离心10 min，经022 μm微孔滤膜滤过，测定其中人参皂苷Rh2含量，即分别得到纳米粒中药物含量和投药总量。包封率=纳米粒中药物质量/投药总质量×100%。
将上述过滤后纳米粒溶液冻干，精密称重，即得到过滤后纳米粒中药物与载体材料的总量。载药率=纳米粒中药物质量/（纳米粒中药物质量+载体材料质量）×100%。
24脂质聚合物纳米粒的体外药物释放用透析法测定纳米粒中包载人参皂苷Rh2的体外释药特性。将分子截留量3 500的透析袋煮沸并置于蒸馏水中浸泡超过24 h。分别取2 mL纳米粒溶液和游离药物溶液（人参皂苷Rh2溶解于乙醇与聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）置于透析袋中，两端扎紧，置于37 ℃ 40 mL含01%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）的PBS液中，并以 300 r・min-1磁力搅拌器不断搅拌，分别于025，05，1，2，4，8，12，24，48，72，96 h吸取透析袋外部溶液1 mL，每次补充等量的接收液。HPLC测定不同时间点接收液中药物浓度，计算药物的含量，推算得累积释药百分数。
25细胞培养C6细胞培养于DMEM培养基（含45 g・L-1葡萄糖、37 g・L-1碳酸氢钠、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 mg・L-1青霉素和100 mg・L-1链霉素）。培养条件：37 ℃，5% CO2和饱和湿度90%。
26脂质聚合物纳米粒配伍冰片的抗脑胶质瘤细胞增殖作用分别取生长状态良好并处于对数生长期的鼠源胶质瘤C6细胞，用025%胰蛋白酶EDTA液消化，并反复吹打制备成单细胞悬液，将细胞悬液的浓度调整为5×104个/mL接种于96孔板，每孔体积100 μL然后将培养板移入培养箱中，37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h至细胞贴壁后，吸去培养基。采用无血清培基分别稀释游离空白纳米粒、冰片、人参皂苷组分、人参皂苷纳米粒、纳米粒+10 μmol・L-1冰片等组至不同药物浓度，随后按浓度梯度在各孔中分别加入稀释后样品各100 μL，空白培养基作为对照，每组重复6孔，分别培养24，48 h后吸去培养基，各孔加入100 μL培养基稀释的MTT溶液，孵育4 h，再加入100 μL DMSO溶解生成的甲瓒，通过酶标仪（570 nm）检测细胞增殖活力。
3结果
31纳米粒药物包载工艺的考察试验中由于不溶于水的游离人参皂苷Rh2经滤膜已被除去，而溶于水的部分因人参皂苷Rh2在水中溶解度低，与载入聚合物纳米粒中质量相比，可忽略不计[1415]，故计算包封率及载药率时，人参皂苷Rh2溶于水的部分不考虑在内。根据预试验发现各因素水平对粒径影响较小，故以包封率和载药率为评价指标，因素水平见表1，实验安排及结果见表2，方差分析见表3。
由直观分析可知，各因素对制备工艺的影响顺序为B>A>C。方差分析结果表明，因素B对综合评分有显著性差异，而因素A和C对评分影响无显著性差异，故确定最优工艺组合为A3B3C2，即卵磷脂和PEGDSPE比例为3∶1，Rh2与PLGA比例为1∶3，油水相体积比例为1∶5。
按照最佳处方和工艺条件制备Rh2脂质聚合物纳米粒，进行3次重复试验，结果其包封率为（773±25）%，载药率为（72±02）%。
32载药纳米粒的质量评价微孔滤膜过滤前的液态体系带淡蓝色乳光，略浑浊，有肉眼可见的细小微粒悬于其中，静置2 h内均析出细小沉淀，振摇后不能均匀分散。而经022 μm微孔滤膜过滤后液态体系为泛淡蓝色乳光的、均匀的半透明胶体溶液，无肉眼可见细颗粒，静置72 h后无沉淀析出。
通过透射电镜可观察到载药微粒大部分成规则的球形，表面基本光滑，大小基本均匀，纳米粒之间基本无粘连；采用激光散射仪测定其载药纳米粒平均粒径为（964±36） nm，PDI为024±006，电位为（-86±06） mV，见图1。
33载药纳米粒的体外释药行为人参皂苷Rh2从游离溶液中快速释放，在24 h之内即达到释放平衡，总释药量达92%，见图2。而载药纳米粒的释放则更加缓慢，其释放曲线可分2个阶段：突释阶段和稳定释放阶段。在突释阶段中，微粒释放药量在24 h内达到3964%，随后在扩散阶段持续时间最长，释药量保持稳定增长，96 h累积释药量达到5242%，并呈逐渐上升趋势。
34载药纳米粒的抗脑胶质瘤细胞增殖作用人参皂苷Rh2不同形式在系列浓度下不同作用时间对脑胶质瘤C6体外增殖作用的影响，结果见图3，4。图3结果显示，空白材料和游离冰片对C6细胞的增殖无明显抑制作用。由图4结果可知，3种人参皂苷Rh2给药形式对C6细胞增殖均呈抑制作用，并呈现浓度和时间依赖性，且在各个时间点的抗细胞纳米微球[19]，人参皂苷Rg固体脂质纳米粒[20]等。本实验采用超声溶剂挥发法制备脂质聚合物纳米粒用以包载人参皂苷Rh2。在制备工艺中，随其PLGA聚合物浓度的不断增加，单位质量纳米粒可包裹更多的人参皂苷，但辅料的增加可能造成载药量降低，所以综合评分中选择包封率及载药量作为评价指标。而制备过程随水相体积增加，包封率及载药量均降低，原因可能是水相体积增加，有机相扩散到水相的速度加快，而聚合物包载于脂质层需要一定时间，药物来不及被聚合物包载便随有机相扩散到水相中，故包封率及载药量均降低，综合评分降低。
人参皂苷Rh2口服生物利用度很低，其主要原因包括口服后经胃肠道吸收的药量少；易被消化道的酶或微生物分解；肝脏的首过效应明显。将人参皂苷Rh2制成脂质聚合物纳米粒后，有望将其制备作为口服给药。载药纳米粒经口服后，可利用脂质层的粘附性增加载药粒子在肠道的停留时间和接触面积，改善药物在肠道中的分布和传递，提高口服生物利用度。同时，药物经包裹后释药缓慢，同时纳米粒核壳结构可保护药物免受胃肠道消化酶的降解，并实现缓慢持续地释放药物，促进药物的肠道吸收。
研究结果证实，以脂质聚合物纳米粒为载体包载人参皂苷Rh2后能有效增加成分的水溶性，其粒径分布均一，形态圆整，并且具有药物缓释特征，同时体外研究表明纳米粒可增加对脑胶质瘤细胞增殖抑制作用。冰片可迅速透过血脑屏障，具有“独行则势弱，佐使则有功”、“芳香走窜，引药上行”的特点，适宜与他药配伍。许多中成药，如安宫牛黄丸、麝香保心丸和冰硼散等都有冰片的配伍应用。本实验将冰片与人参皂苷Rh2纳米粒配伍使用以期增加纳米粒抗脑部肿瘤效果，结果表明，联合给药后人参皂苷纳米粒的抗肿瘤作用显著增加，说明这种给药方式可能作为抗脑部肿瘤的有效药物传递途径。
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纳米粒的制备技术范文第4篇
【关键词】纳米粒子，磁性材料，纳米Fe3O4，FeCl2
1、磁性纳米材料简介
（1）超顺磁性
所谓超顺磁性是指当外加磁场减小到零时，纳米微粒的矫顽力和剩磁均趋近于零的现象。当磁性纳米粒子的尺寸小到某一临界尺寸时，每个粒子为单个磁畴，此时粒子中电子的热运动动能超过了电子自旋取向能，磁矩呈无规排列，磁性纳米粒子就由铁磁性或亚铁磁性变为超顺磁性。不同磁性材料进入超顺磁性的临界尺寸各不相同，例如，对y-Fe203、纳米Fe304粒子而言，其临界尺寸分别为16nm、 20nm[14]。
（2）高矫顽力
当磁性纳米粒子的尺寸处于单畴临界尺寸时，每个粒子（单个磁畴）相当于一个很小的永磁铁。要想使永磁铁去磁，必须使每个粒子的整体磁矩反转，这需要加一个很大的反向磁场，因此此时纳米粒子表现出非常高的矫顽力[15]。当粒子小到单畴尺度，反磁化过程为均匀或不均匀的磁矩转动过程，Hc和材料的K/Ms成正比，这是提高材料即硬磁性的方法之一。然而纳米软磁材料又正是利用尺度小于交换长度时，交换作用使平均各向异性（K）很小而使Hc变小。粒子尺寸小到超顺磁性临界尺寸时，矫顽力为零。
（3）磁化率
顺磁性材料的磁化率x随温度升高而减小，满足居里一外斯定律x=C/（T-Tc）。然而具有超顺磁性的纳米粒子其磁化率不仅仅与温度有关，还和纳米粒子中电子的奇偶数密切相关。当电子数为奇数时，磁化率服从居里一外斯定律；而当电子数为偶数时。磁化率不再服从居里一外斯定律，而是与热运动动能成正比[16]。纳米磁性金属的磁化率x是常规金属的20倍。
（4）居里温度
居里温度是磁性材料的重要参数，通常与交换积分成正比，还与材料的原子构型和间距有关。在纳米材料研究中，发现居里温度Tc随纳米粒子或薄膜尺度的减小而下降，这缘于小尺寸效应和表面效应。
2、 磁性纳米粒子的制备方法
纳米粒子的制备方法可分要分为两大类：物理方法和化学方法。在物理制备方法中，有蒸发冷凝、机械粉碎、磁控溅射和膜板制备等方法，但往往受到产品质量低、粒度均匀性差和技术要求高的限制。化学制备纳米粒子又可分为气相法和液相法。气相法如气体冷凝法、溅射法等适合制备纳米金属颗粒，而液相法是我们制备纳米粒子时最常采用的方法。液相法即在含有可溶性的或悬浮前驱体的均相溶液中，利用各种途径（如添加还原剂、射线辐照、加热分解等）引发化学反应，通过均相或异相成核及随后的扩散生长，生成一定形状和大小的纳米粒子。同时通过在反应中加入表面活性剂或者聚合物等表面修饰剂可以得到具有窄的粒径分布和表面功能化的纳米粒子，也能避免纳米粒子的团聚及氧化；而目，通过改变反应条件，可以对生成的纳米粒子的尺寸、形状和分布进行控制。
二、实验过程
1、实验试剂
实验所需试剂为FeCl2分析纯、无水Na2CO3分析纯、去离子水、无水乙醇。所有试剂的等级为分析纯，且使用之前未作任何的纯化处理。
2、实验器材
聚四氟乙烯釜、真空干燥箱、x射线衍射仪、场发射扫描电子显微镜、高分辨透射电子显微镜、能量色散谱仪、振动样品磁力仪。
3、实验步骤
用去离子水和FeCl2分析纯配制20mL 0.002mol/L 溶液。然后将20mL 0.004mol/L Na2CO3溶液迅速加入上述溶液中。然后将混合后的溶液倒入一个50mL的密封的聚四氟乙烯釜中，然后在180°C温度条件下水热处理12h，再冷却至室温。产品离心分离后，用去离子水和无水乙醇清洗四次，最后在50°C温度条件下真空干燥12 h。
形貌结构分析通过使用CuK_α射线在Bruker Advance D8 x射线衍射仪进行x射线衍射（X-ray Diffraction，XRD）；样品形貌通过在场发射扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy，SEM，S4800）和高分辨透射电子显微镜（High Resolution Transmission Electron Microscopy，HRTEM， JOEL-2010）下观察；元素成分分析在能量色散谱（Energy Dispersive Spectroscopy，EDS， GENESIS 2000）指定的区域进行了判定；用振动样品磁力仪（Vibrating Sample Magnetometer ，VSM，Lakeshore 7300）测其磁性。
三、 结果及讨论
1、其他铁源和碱源对Fe3O4纳米结构生长形态的影响
用以下反应制备纳米Fe3O4：
FeCl2 + Na2CO3 FeCO3 + 2NaCl （1）
FeCO3 + H2O Fe（OH）2 + CO2 （2）
4Fe（OH）2 + O2 + 2H2O 4Fe（OH）3 （3）
Fe（OH）2 + 2Fe（OH）3 Fe3O4 + 4H2O （4）
在本实验体系中，FeCl2和Na2CO3分别被作为铁和碱的来源。FeCl2和Na2CO3混合后首先会形成不稳定的中间体FeCO3，它会慢慢转变成Fe（OH）2[44]。Fe（OH）2也不稳定，会部分氧化成Fe（OH）3（这是由于产品的溶解度常数差异决定的，Fe（OH）2和Fe（OH）3的溶度积常数分别为4.87×10-17和 2.79×10-39）[45]。接着，形成的Fe（OH）3和原来的Fe（OH）2共沉积而获得Fe3O4 [46]。为了解FeCl2和Na2CO3在形成纳米Fe3O4中的作用，进行辅助实验来研究其他铁源和碱源对形成纳米Fe3O4的影响。将Na2CO3作为碱源、FeCl2替换为FeSO4，在其他工艺条件不变的情况下，得到的最终产品为Fe3O4纳米粒子而不是纳米带（图3 a）；将FeCl2作为铁源，Na2CO3分别替换为NaAc、尿素和NaOH（图3b-d），在其他工艺条件不变的情况下，所合成的产品均是不规则的Fe3O4粒子而不是纳米带。因此，无论FeCl2还是Na2CO3对棒状纳米Fe3O4的合成来说都是不可或缺的。
2、磁性分析
纳米Fe3O4的磁性在室温下用振动样品磁力仪可测出。图4为室温下的样品的磁滞回线。可清晰地看到，样品的磁饱和强度为74.54 emu g-1，低于相应的块状材料的磁饱和强度（92 eum g-1），这可能是由于纳米Fe3O4形状各向异性造成的[47]。纳米Fe3O4的矫顽力为63.2 Oe，表明纳米Fe3O4具有铁磁性。
纳米粒的制备技术范文第5篇
【关键词】 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4; 纳米; 热化疗; 乳腺癌
恶性肿瘤的诊断和治疗一直是医学领域试图攻克的难题，随着医学水平的发展，人们对肿瘤治疗新型方法的研究已经向分子和原子水平迈进。1996年，德国学者Jordan等[1] 发现纳米级磁微粒比微米级微粒能产生更多的热量，提出了磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia， MFH)新技术。本实验采用改良的化学沉淀浸渍法制备了As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，将具有广谱抗癌性的As2O3和磁流体(锰锌铁氧体)热疗结合起来，对乳腺癌MDAMB231细胞株进行热化疗的体外实验研究。
1 试剂和仪器
As2O3、二甲基亚砜(DMSO， Sigma公司);HEPES、胰酶、噻唑蓝(Amresco);硫酸锰、硫酸锌和硫酸亚铁等均为分析纯;DMEM(Gibco Brl， 美国);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);能谱仪(Noran， Vantage，美国);H600透射电镜(Hitachi，日本);扫描电镜(JEOLJSM6360LV，日本);酶标仪(美国BD公司);流式细胞仪(FACS Vantage SE， BectonDickson，美国);原子荧光光谱仪(北京瑞利分析仪器公司); MDAMB231(购自中国科学院上海细胞研究所)。
2 方 法
2.1 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒的制备
采用改良的化学沉淀-浸渍法制备复合纳米粒，按Mn2+、Zn2+、Fe2+摩尔比1∶1∶4准确称量适量MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O和FeSO4·7H2O33种硫酸盐，研成粉末后将适量NaOH溶液加入其中，磁力搅拌器高速搅拌3 h后放入80 ℃烤箱干燥，马弗炉400 ℃焙烧1 h，自然冷却后用热蒸馏水浸洗去除可溶性硫酸钠无机盐，烘干成锰锌铁氧体粉末，配制亚砷酸溶液使As2O3浓度为0.01 mg·ml-1、0.02 mg·ml-1、0.03 mg·ml-1、0.04 mg·ml-1，称取适量锰锌铁氧体粉末浸渍于其中，离心烤干。
2.2 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒的表征
2.2.1 形态观察 取出少量制备的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，加入无水乙醇超声分散20min后滴铜网，在透射电镜下观察形态，取少量粉末在扫描电镜下观察。
2.2.2 能谱仪测定复合纳米粒的成分 扫描电镜下对制备的复合纳米粒成分进行能谱分析，确定其元素组成成分。
2.2.3 磁响应性检测 用适量生理盐水将复合纳米粒配成混悬液，在烧杯下放置一磁铁观察磁性材料聚集情况。
2.2.4 含砷量测定 用原子荧光光谱仪测定其含砷量。
2.3 升温试验
将复合纳米粒用生理盐水配成6、8、10、12 g·L-1的磁流体，置于频率为200 kHz、输出电流300 A的交变磁场下进行升温试验，每5 min记录1次温度。
2.4 释药试验
用生理盐水配成10 g·L-1的混悬液，取10 ml装于透析袋中，外面透析介质亦为生理盐水，磁力搅拌器常温搅拌5 0 h，每隔1 h取液测量释放液中As含量，绘制累积释药曲线。
2.5 细胞株和细胞培养
乳腺癌细胞株MDAMB231常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中。
2.6 MTT比色法检测细胞增殖抑制率
取对数生长期MDAMB231细胞，消化吹打成2.5×104 ml-1，在两块96孔培养板中每孔接种200 μl(每板两组，每组8个复孔)，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。24h细胞贴壁后一块培养板分别加入DMEM培养液(阴性对照组)、5 μmol·L-1As2O3溶液培养(化疗组)，另一块培养板分别加入10 g·L-1的Mn0.5Zn0.5Fe2O4培养液(热疗组)及As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒培养液(热化疗组)，置于200 kHz、4 kW、输出电流300 A的交变磁场加热1 h继续培养，48h后加入MTT20 μl，4 h后弃去液体，每孔加入150 μlDMSO，置于酶标仪上振荡混匀10 min测OD493 nm值，细胞增殖抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值。
2.7 流式细胞术测凋亡率
按上述分组将治疗48 h后细胞制成单细胞悬液，PBS洗涤细胞两次，70%乙醇4 ℃固定细胞24 h以上。检测前用PBS洗涤细胞两次，细胞重悬于0.5 mlPI染色液(20 g·ml-1，0.25 mg·ml-1RNase A)中，室温避光染色30 min，用300目丝网过滤后即可上机分析。
3 结 果
3.1 表征
采用化学沉淀-浸渍法制备的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料为棕褐色粉末，在外磁场作用下具有良好的磁响应性，能够形成明显的磁力线。用透射电镜和扫描电镜观察，As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒近似球形，密度较高，粒径在20～40 nm(图1)，扫描电镜下任选一视野进行能谱分析，均能检测到锰、铁、锌、砷等材料成分(图2)。用原子荧光分光光度计测定的As标准工作曲线为：I=3.737+13.097C，r=0.999 5，其中I为分析信号峰面积，C为As浓度，经测定复合材料中含砷量为0.05%。
3.2 升温情况
不同浓度的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒在体外交变磁场作用下具有升温能力，在前30 min升温迅速，30～45 min升温平缓，之后温度基本保持恒定不变，且10 g·L-1浓度的复合纳米粒升温能达到肿瘤治疗的有效温度(41～46℃)(图3)。
3.3 体外释药速率的动态测定结果
以生理盐水为介质考察了As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料的体外动态释放，计算其累积释放率，48 h释药为14.67%，曲线平缓(图4)。
3.4 MTT比色法检测结果
结果显示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒联合交变磁场加热组能显著抑制细胞增殖，且比单纯As2O3溶液组和Mn0.5Zn0.5Fe2O4联合交变磁场加热组的抑制作用明显(表1)。表1 As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒联合热化疗组可出现DNA含量明显低于G1期的亚G1期细胞峰，即凋亡峰(凋亡率为31.18%)，显著高于化疗组(凋亡率为7.44%)和热疗组(凋亡率为16.17%)，而阴性对照组则几乎无凋亡峰(图5)。
4 讨 论
砷及其化合物是人类最早用于治疗肿瘤的药物，目前As2O3注射液已作为国家二类新药正式上市，国内外研究其对实体瘤的作用，如乳腺癌[2] 、肺癌[3]、食管癌[4]、胃癌[5]，确认了其广谱抗癌性，其机制主要是促进肿瘤细胞分化、诱导其凋亡，多途径抑制肿瘤增殖转移且毒副作用小，对正常细胞无明显影响。而肿瘤热疗是用加热方式治疗肿瘤的一种新方法，即利用物理能量在组织中沉淀而产生热效应，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度(41～46 ℃)[6]以杀死癌细胞，又不损伤正常细胞的新型治疗方法，热疗不仅没有化疗及放疗的副作用，而且可以克服肿瘤细胞的耐药性，大大增强癌细胞对化疗和放疗的敏感性[7]，诱导细胞凋亡。近年来，许多研究者将砷与热疗通过不同的形式联合起来治疗恶性肿瘤，取得了显著的成果，如邢宝玲等[8]将As2O3和自行研制的纳米锰锌铁氧体磁性材料一起用脂质膜包裹起来制成As2O3磁性纳米脂质体，体外抗卵巢癌细胞实验显示，将As2O3与热疗联合起来对癌细胞的毒杀作用强于单纯的As2O3组和热疗组。倪海燕等[9]通过乳化冷冻凝聚法制备了As2O3磁性纳米微球，并通过治疗宫颈癌证明了As2O3联合热疗对肿瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用明显。
本研究中通过制备As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒并作用于乳腺癌细胞，我们探讨了将As2O3的细胞毒作用同磁热疗相结合，以期寻求一个更有效地杀伤恶性肿瘤细胞的方法。As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒是采用改良的化学沉淀-浸渍法[10]制备的，这种方法的优点是合成工艺简单，成本低廉，且制备的粒径为20～40 nm，由于粒径极小，在体内不但可以逃脱MPS的捕获，而且还具有很强的吸收电磁波能量而转化为热能的能力。将活性组分AS2O3溶液用浸渍法加到载体纳米级锰锌铁氧体粉末上，由于作为载体的Mn0.5Zn0.5Fe2O4比表面极大，吸附性能优良，能使被吸附的药物与载体周围的药物之间始终保持着一种动态平衡，当游离的药物被体液稀释或被机体代谢浓度下降时，根据吸附等温曲线的平衡曲线，制剂马上释放等量的药物来补足被消耗的量，可以控制药物的缓慢释放，这不但提高了药物疗效，还可以使靶区以外的A. 阴性对照组 B. 化疗组C. 热疗组 D. 热化疗组图5 各实验组流式细胞分析结果
Fig 5 The results of flow cytometry
砷浓度大大降低，从而减轻了药物对正常组织的毒副作用。另外复合纳米粒的体外升温实验表明，复合纳米粒在交变磁场中具有良好的升温控温能力，不同浓度的复合纳米粒在交变磁场中升温控温的能力有所差别，实验结果表明浓度为10 g·L-1的材料在交变磁场中能升温至肿瘤治疗的恰当温度45 ℃且保持温度不变，可发挥既杀死肿瘤细胞而又不损失正常细胞的作用。实验中我们分为阴性对照组、化疗组、热疗组及热化疗组，MTT比色法检测结果显示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料联合交变磁场热疗组对于人乳腺癌细胞具有强烈的细胞毒性，此组的细胞生存率明显低于化疗组和热疗组。流式细胞分析亦显示， As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料联合交变磁场热疗诱导的细胞凋亡率较相应同等浓度的单纯As2O3液及单纯磁性材料热疗组的细胞凋亡率要高，前者为 31.18%，而后两者分别为 7.44%、16.17%。
本实验成功制备了直径为20～40 nm、升温能达到肿瘤治疗有效温度同时可控缓慢释放药物的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，合成工艺简单、易行，成本低廉.通过体外细胞实验证实，该纳米粒联合交变磁场热疗对肿瘤细胞具有很强的生长抑制和凋亡诱导作用，为治疗乳腺癌提供了新的思路。
参考文献
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