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关键词:中成药;木香顺气丸;微生物限度;验证
Abstract:Objective To provide a method of the microbial limit test for proprietary chinese medicine Muxiangshunqi Pill and carry out the verification of the method test of method.Methods Routine method,medium dilution method(0.5ml/dish and 0.2ml/dish)were adopted for the test according to test methods of Chinese Pharmacopoeia 2010 edition of a microbial limit.Results Based on recovery test,the number of bacteria were tested by medium dilution method(0.2ml/dish),molds and yeasts were tested by routine method,and using the toutine method for the inspection of the control bacteria.Conclusion The method can be used for microbial limit for proprietary chinese medicine Muxiangshunqi Pill.
Key words:Proprietary chinese medicine;Muxiangshunqi Pill;Microbial limit;Validation
木香顺气丸是由木香、砂仁、香附、槟榔、甘草、陈皮、厚朴、枳壳、苍术、青皮等中药组成的复方制剂,主治行气化湿,健脾和胃,用于湿浊中阻、脾胃不和所致的胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐恶心、嗳气纳呆。按照《中国药典》2010年版规定,在进行药品中微生物限度检查时,只有在该检验条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生长时,才能使供试品中的微生物的得到真实反映,从而保证检验结果的科学性和准确 性[1]。对于具有抑菌作用的品种,必须采取一定的措施,如培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法或其中2种方法连用,消除其抑菌作用后,再进行检验,以保证方法的可靠性[2]。在进行木香顺气丸微生物限度检查时发现其具有一定的抑菌作用,故建立了木香顺气丸微生物限度检查方法,为该类品种制定微生物限度标准提供了科学依据。
1仪器与材料
1.1仪器MJ-Ⅱ 型霉菌培养箱(生产企业:上海一恒科技有限公司),SPX-150型生化培养箱(生产企业:上海金慧科电子有限公司),SPX-250B-Z型生化培养箱(生产企业:上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2样品 木香顺气丸(陕西利君现代中药有限公司,规格:8袋/盒)。
1.3稀释液 0.9%无菌氯化钠溶液(用于菌液稀释);pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(用于供试品制备)(按中国药典方法制备,高压蒸汽灭菌法灭菌)
1.4培养基 营养琼脂培养基(批号140807)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号140904)、胆盐乳糖培养基(批号140912)、MUG培养基(批号150413)、乳糖胆盐发酵培养基(批号150310)、改良马丁液体培养基(批号140905)、氯化钠蛋白胨缓冲液(批号141213)均由北京陆桥技术有限公司生产。
1.5阳性对照菌 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]均由陕西省食品药品检验所提供。
2方法
2.1菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至营养琼脂培养基上,35℃培养24 h;接种白色念珠菌至改良马丁琼脂培养基上,25℃培养48 h,以上培养物均用0.9%无菌氯化钠溶液制成50~100 cfu/ml的菌悬液;接种黑曲霉菌至改良马丁琼脂斜面25℃培养5 d(用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子,标准管比浊),再将培养物用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成50~100 cfu/ml的菌悬液。
2.2供试品溶液制备称取供试品10 g,研细,加稀释液100 ml,制备成1∶10供试液。
2.3常规法
2.3.1试验组 取1∶10供试液1 ml和试验菌50~100 cfu,采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌数的测定。
2.3.2菌液组 取试验菌液1 ml,采用常规法测定所加试验菌数。
2.3.3供试品对照组 取1∶10供试液1 ml注入平皿中,不加试验菌,倾注相应培养基,采用常规法测定供试品的本底菌数。
2.3.4回收率的计算 按如下方法计算试验组的加菌回收率。
首先,用试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数,然后用这个结果再除以菌液组的平均菌落数,最后再乘以100%,得到回收率结果[4]。
即:试验组菌回收率(%)=[(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数]×100%
2.3.5结果 试验结果表明,试验组金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均70%,可采用常规法进行霉菌和酵母菌数测定,见表1。
2.4培养基稀释法(0.5 ml/皿)
2.4.1取1∶10的供试液,采用0.5 ml/皿,分别加入试验菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌50~100 cfu,同常规法进行试验。
2.4.2回收率的计算:同常规法。
2.4.3结果 试验结果表明,实验组金黄色葡萄球菌的回收率>70%,可采用培养基稀释法(0.5 ml/皿)进行测定,验证方法通过;而试验组枯草芽孢杆菌的回收率
2.5培养基稀释法(0.2 ml/皿)
2.5.1取1∶10的供试液,采用0.2 ml/皿,加入试验菌枯草芽孢杆菌50~100 cfu,同常规法进行试验。
2.5.2回收率的计算:同常规法。
2.5.3结果 试验结果表明,实验组枯草芽孢杆菌的回收率>70%,可采用培养基稀释法(0.2 ml/皿)进行测定,验证方法通过,见表3。
2.6控制菌检查方法验证(常规法) 当建立产品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法是否适合于该药品的控制菌检查。验证时,依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。验证大肠埃希菌和大肠菌群时,采用的验证菌株都是大肠埃希菌。
2.6.1大肠埃希菌 试验组:取菌数回收率测定项下1∶10的供试液10 ml和大肠埃希菌试验菌液10~100 cfu,接种至100 ml的胆盐乳糖培养基中,依据大肠埃希菌检查法试验。阴性对照组:取稀释液10 ml加入到胆盐乳糖培养基100 ml中,依据大肠埃希菌检查法试验。
2.6.2大肠菌群 试验组:取菌数回收率测定项下1∶10的供试液1 ml和大肠埃希菌试验菌液10~100 cfu,加入到10 ml的乳糖胆盐发酵培养基管中,依据大肠菌群检查法试验。阴性对照组:取稀释液1 ml加入到10 ml乳糖胆盐发酵培养基管中,依据大肠菌群检查法试验。
2.6.3结果 试验结果表明,可采用常规法进行控制菌(大肠埃希菌和大肠菌群)的检查,见表4。
2.7结果 本品按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法要求,进行方法学验证试验,结果可采用培养基稀释法(0.2 ml/皿)进行细菌菌数检查,可采用常规法法进行霉菌和酵母菌数检查;可采用常规法进行大肠埃希菌和大肠菌群的控制菌检查[5]。
3 讨论
由于中成药含有多种成分,其中任何成分具有抑菌作用,均可能影响微生物限度检查的准确性,常规法可用于无抑菌作用或抑菌作用弱的药物,而对抑菌作用较强的药物,可采用培养基稀释法减少药品中抑菌成分的数量,从而消除其对细菌、霉菌与酵母菌生长的影响[3]。因此药品在进行微生物限度检查前,要排除自身抑菌作用所带来的干扰,这样测出的结果才能可靠、有效。中成药木香顺气丸处方中所含有的木香、苍术、甘草、厚朴提取物对金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用[4-7],苍术和厚朴提取物还对枯草芽孢杆菌有明显抑制作用[5,8]。而这几种中药材作为木香顺气丸的主要成分,其对微生物限度检查的影响有多大无法确定,故采用依次渐进的办法来确定最为合适的检查方法。从实验结果表明,木香顺气丸对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用,这与实验前对成分抑菌作用的分析一致,因此,在进行中成药微生物限度检测前,进行必要的成分分析,有一定的参考价值。
参考文献:
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关键词:微生物学实验;教学内容;教学方法;教学模式
中图分类号:G633.55 文献标志码:A 文章编号:1674-9324(2014)35-0249-02
微生物学是高等院校生物类专业一门重要的专业基础必修课,发酵工程、基因工程、细胞工程都是在微生物学的基础上形成和发展起来的。微生物学实验课程是一门操作技能很强的基础课程,其重要性不亚于其理论课程。该实验课程是将理论与实践相结合的桥梁与纽带,是培养学生理论联系实际的科学态度、树立创新意识、提高独立科研能力和素养的重要环节。传统的微生物学实验课程在教学方法、教学内容、课程考核等方面都存在弊端,因而对微生物学实验教学进行改革迫在眉睫。
一、该课程存在的主要问题
1.教学方法。在很多高校以往的实验教学活动中,教师通过讲授法进行教学,学生往往被动地、机械地按照教师的讲解、演示、实验注意事项等完成实验[1]。这种方法只发挥了教师的主导地位,忽略了学生的主体地位,使学生的主观能动性不能有效发挥,导致学生学习热情不高,缺乏思考的独立性。
2.教学内容。微生物学实验主要包含无菌技术、染色技术、纯培养技术、显微技术这四大技术[2]。传统的微生物学实验课程通常将这些实验技术分散在相对独立的实验单元中,各单元之间缺乏方法和内容的有机结合,不能有效地培养学生融会贯通,以联系性、全面性的思维去解决问题的能力。此外实验内容多采用验证式模式[3],该模式对于激发学生学习的积极性和主动性往往事倍功半,导致学生到了工作岗位缺乏独立工作的能力,不能将已学过的微生物学基本实验技能串联起来去设计实验方案和解决实际问题。
3.课程考核。由于实验课学时比理论课学时少,有相当一部分学生把实验课当作理论课的“附属课”,没有意识到实验课程对于微生物学科的重要性。实验课程的评分依据一般以学生课下完成的实验报告为主,造成学生只看重实验报告而轻视实验操作的不良后果[4]。此外微生物学实验多以小组为单位来进行,存在抄袭甚至篡改数据等现象,不利于培养学生动手能力和实事求是的科研品质。
二、项目研究目标
研究型高校一个重要任务是培养学生的思维和创新能力。基于此,开发新的实验教学模式、重组实验教学内容、最大程度地发挥实验教学在培养学生创新思维和创造能力中的作用将成为微生物学实验教学改革的主要方向。本教改项目在确保学生全面掌握微生物学实验基本操作技术和方法的基础上,实现学生学习方式的根本性转变,教师更多地发挥引导和服务的功能,将学习的主动权真正还给学生,最大限度地培养学生的科研能力。
三、项目研究内容和方法
研究型微生物学实验教学改革采用模拟科研课题的方式,将分散独立的实验课程内容串联成有着密切联系的整体,通过针对解决某一科学问题而展开实践和探索。
1.探索式研究。在这一层次上,首先由教师将一系列独立单元实验设计成围绕为解决某一模拟课题而展开的系列关联的实验环节;然后学生遵循框架式实验内容,在一定范围内自主选择实验对象,学习和掌握相关的实验技术和方法,并学会对不同实验结果进行分析比较;最后教师从总体上剖析模拟课题的目标与实验内容设计的思路,学生在反观已开展的实验设计的基础上探讨其他可行方案,从整体/系统的角度看待模拟课题,对实验课题如何入手、如何安排获得基本认识。
2.综合式研究。在这一层次上,教师围绕某一专题通过课堂集中讲述或提供实验技术录像的方式,分别阐述针对同一目的的不同技术方法,并设定不同的背景条件或者给予不同的实际样本。学生通过课堂讨论及辅助教学手段学习多种技术方法,对教师提供的一系列不同情况/样品进行自主选择适用方法并开展实践,并对结果进行比较分析。例如:以“微生物的生长和控制”为专题,对不同的微生物(原核、真核),不同的培养基质,不同的细胞浓度(极低、高浓度),围绕生长测定方法的选择和使用,半自主设计小型方案研究理化因素(pH、温度、碳氮源等)对微生物生长的影响,通过实验获得数据结果,初步掌握培养条件优化的方案。
3.设计式研究。在这一层次上,采用“学生自主实验”的开放式教学模式。学生通过前两个阶段的学习和实践,在开放式的教学平台上,分组开展独立课题研究,自主进行方案设计、内容安排、时间分配及相互配合完成整个过程,并获得结果进行分析讨论,提出改进或后续研究规划。例如:以“产特定目标产物的目的菌株的筛选”为研究课题,通过生境分析明确采样地点,自行采样,查找或自行设计快速检出方法,进行富集和选择培养,比较获取相对优良的产生菌株,并进行初步鉴定和简单的培养优化。这不仅可以提高学生对实验课的学习兴趣,更重要的是使他们获得一个真实的实验研究过程的锻炼。
4.改革课程考核评价体系。考核的内容不仅应包括对实验原理的理解和基础实验技能的掌握,还应包括分析和解决问题的能力、团队协作精神以及科学严谨的态度。因此实行实验过程与结果并重的考评方法对于培养学生良好的实验技能和求真务实的科学态度很有必要[4]。教师要加强对实验课程的管理和考核,要严格规范微生物学基本实验操作,除了在课堂上做好操作演示外,要随时指导纠正学生不正确的操作方法。对于一次实验课能够完成的基础性实验,指导教师应当场检查学生的实验完成情况和结果,发现问题当场指出,并评定课堂表现成绩,并要求学生当堂提交实验报告。教师将根据实验课堂表现和实验报告完成情况,给出每个单元实验的综合成绩,这样避免了学生对实验结果作假和抄袭实验报告的现象发生。对于需要多次实验才能完成的综合性和设计性实验,要求提供详细的原始记录、实验结果分析报告作为实验成绩考核的重要依据。
我们希望通过上述改革能够很好地解决微生物学实验教学存在的问题,提高学生的学习热情,培养学生的创新思维、实践动手能力、分析问题解决问题的能力,为培养能够适应社会发展的优秀人才做出贡献。
参考文献:
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基金项目:江南大学2013年本科教学改革项目(JGB2013078)。
关键词:微生物油气勘探 储层评价 异常模式 含油气性预测
作为近地表油气化探技术的重要指标,微生物的数量与种类在近地表油气化探创立初期就为人们所注意。上世纪30年代,前苏联地质学家最早提出了以近地表土壤的烃氧化菌作为指标进行油气勘探的设想。50年代末,美国菲利普石油公司创造了微生物石油测量技术。大致同时,德国研究人员提出了油气微生物勘探技术。它们的本质都是利用特定种群的微生物指标来推断储层的含油气性。
一、微生物油气勘探技术体系
1.技术原理
油气埋藏中的烃类成分向地面方向的铅直运动位移是地表油气化探的原理。微生物油气勘探技术作为地表油气化探的手段之一同样基于此。地下油气藏中烃类组分在浓度和压力的作用下,必然会向上运移,在地表形成自身浓度较高的区域。而这个区域存在的某些微生物,以这些烃类作为唯一的碳源。因此,随着烃类浓度的变化,这些微生物的发育程度也会有所变化。主要体现在微生物高值的异常。这样就可以将微生物的异常与油气的埋藏联系起来。
2.常用指标筛选与异常划分
上世纪五六十年代,地表微生物油气勘探技术初现之时,人们首先对指标的细菌的种类进行了探索。最早用于油气勘探的是甲烷氧化菌,但后续成果表明这类细菌在应用中存在影响因素,首先甲烷来源上,由于近地表中大量存在的纤维素分解菌可以把土壤中的纤维素分解为甲烷和二氧化碳,引起甲烷浓度增加,从而导致甲烷氧化菌发育。所以必须在纤维素分解菌浓度比较低时,才可使用甲烷氧化菌为勘探指标。所以地表微生物油气勘探时,甲烷氧化菌须和纤维素分解菌一起使用,或进行碳、氢同位素检验,以确定甲烷的来源与类型。相比于甲烷氧化菌,乙/丙/丁烷等氧化菌受地表干扰相对比较小,这是由于这些较重的烃类难以因地表作用产生。基本是地下油气藏烃成分的运移产物。因此,在地表微生物油气勘探的过程中最常用的指标是乙烷、丙烷和丁烷氧化菌。地表微生物技术使用于天然气勘探,因天然气藏主要成分为甲烷,很难在地表造成乙、丙和丁烷等氧化菌的异常,所以主要采信甲烷氧化菌。依照测量值的大小,把测区分成A级异常区、B级异常区、不确定区与背景区。
3.典型异常模式
通过已知区域上方进行的地表微生物测量,得出地表微生物油气勘探的几种典型异常模式。
甲.干孔大都位于微生物测值背景区或不确定区。
乙.已开采的老区域微生物总表现出低值异常。油气藏经开采压力降低,向上的渗漏就会减弱或停止。导致微生物低值异常。相反,未经开采区域,由于垂向渗漏,将会导致高值异常。已开采油井因为注水导致使压力升高,继续引发油气微渗漏,亦会引发地表微生物的高值异常。
二、微生物油气勘探技术发展概况
微生物油气勘探技术滥觞至今已经有近80年的历史。最早由前苏联微生物学家和勘探家发轫,40年代美国分离出地表土壤中的烃氧化菌并将其作为油气藏性质指标。我国自1955年由中科院菌种保藏委员会与前石油工业部合作了微生物勘探石油的研究。90年代中期至今已在二连盆地、四川盆地、华北油田等已知或未知区域进行了地表土壤微生物的勘探研究,取得了良好的验证与预测效果。2002年,合肥石油化探研究所在其研究项目中也对微生物油气勘查进行了试验探究。
三、微生物油气勘探技术应用领域
1.未采区含油气性预测
地表微生物的高值异常区域是油气藏烃渗漏的有效指标,所以单独使用微生物技术针对未知区开展含油气性预测从理论上可行。但在综合勘探已是目前大势的情形下,该技术应更多地与其他勘探手段相结合。既可与其他地球化学勘探方法结合使用,也可将其与本地地质资料和地震等物探资料对照使用。
2.成熟探区储层评价
在其应用早期,微生物油气勘探技术仅应用于油气远景区的预测。但近10年来,在测量结论的解释上,这种技术也大有突破。美国首先在对地下油气储层分布状况的评价之中使用该方法,并产生了微生物储层特性评价技术,将该技术的使用由勘探领域拓展到开发领域。
四、结论与建议
依据理论上的支持,微生物油气勘探技术已拥有比较完善的操作方法和理论体系。并且经济高效。可有效地确定出未知区的含油气远景区块,是判断构造是否存在烃类埋藏的可靠措施;在已采的老油气田区域,可找出潜在的漏失层。对于地表微生物测量,对油气藏的特征分析,连通性以及封闭单元分布状况和含油气储层的延伸方向范围的确定上大有裨益。
近年来我国油气勘探中的地表微生物技术也受到了很多单位和研究者的重视, 大大减小钻探风险。但综观全局,我国微生物油气勘探技术在探究与实践方面仍然处于起步期,在地震探明构造含油气远景评价与地下储层性质描述方面的研究与应用尚未见报道。
进行地表微生物勘探将会是一件投入少见效快的勘探方式。可以获得最有利的含油气远景区或是老产区地下储层的埋藏情况。这对于油气田勘探工程意义重大。因此,加强地表微生物油气勘探技术的研究与应用,应该引起我国油气勘探者的重视。
参考文献
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关键词:现代生物技术 废水生物处理 生物修复 水处理剂
0 引言
随着工业的高速发展,水环境污染问题越来越严重地威胁着人类的生存环境,制约着社会和经济的进一步发展。因此,水污染控制成为全世界共同关注的问题。目前的水处理技术中,生物处理法已成为世界各国控制水污染的主要手段,尤其是现代生物技术将成为水污染控制领域重点开发和应用的技术手段,主要应用于废水处理、生物修复以及微生物水处理剂等方面。
1 现代生物技术的内容与特点
现代生物技术是指以dna 技术为先导,包括微生物工程、细胞工程、酶工程、基因工程、蛋白质工程和生物修复技术在内的一系列生物高新技术的统称[1,2]。其中每个方面都有其特定的理论基础和不同的应用领域,但它们之间又相互补充和衔接,形成一个完整的体系。
生物技术的特点大致有[3]:①以生物为对象,不依赖地球上的有限资源,而是着眼于再生资源的利用;②在常温、常压下进行,过程简单,可连续化操作,并可节约能源,减少环境污染;③开辟了生产高纯度、优质、安全可靠的生物制品的新途径;④可解决常规技术和传统方法不能解决的问题;⑤可定向地按人们的需要创造新物种、新品种和其他有经济价值的生命类型。
2 现代生物技术在废水处理中的应用
废水生物处理是利用微生物的生命活动过程对废水中的污染物进行转移和转化,从而使废水得到净化的处理方法。废水生物处理技术发展迅速,好氧法、厌氧生物法以及生物发酵法已趋于成熟,所以,这里只介绍固定化等新兴技术。
2.1 固定化微生物技术 固定化微生物技术是生物工程领域中的一项新技术。进入80年代后国内外开始应用这种具有独特优点的新技术来处理工业废水和分解难生物降解的有机物质,一些具有特异性的优势菌种不断得到改造或创造,将这些高效专性菌如脱色菌、脱氮、脱磷菌假单胞菌等进行固定化后,菌体密度提高,大大提高了处理效率,尤其是对难降解有毒物质有明显优势。王增长等人利用新研制的聚集—交联固定化细胞技术,将筛选的高效优势脱色菌种固定在活性污泥上,投加于“厌氧—好氧—生物滤池 ”工艺流程中,处理印染废水,结果表明:出水色度极低,处理后的水可回用[4]。
2.2 生物强化处理技术 为了提高废水处理的效果,而向废水中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种,以去除某一种或某一类有害物质。主要强化方法有:①高浓度活性污泥法,以高污泥浓度和长泥龄来促进对难分解物质的处理,加快反应速度。日本用该法处理难分解的聚乙烯醇和粪便污水取得显著效果[5]。②生物—铁法,是在普通活性污泥中加入无机盐,多用铁盐(氢氧化铁或氧化铁粉),形成生物铁絮凝体活性污泥,具有高浓度活性污泥法的特点,主要用来提高除磷效果。③生物—活性炭法,综合利用微生物氧化能力和活性炭良好的吸附能力,使二者产生协同增效作用。在该系统中,每g活性炭去除 1~3gcod ,分解废水毒性能力明显增强,同时提高脱氮水平。
2.3 生物反应器技术 生物反应器技术,是现代生物技术发展的一个主要方向。现代化的新型生物膜反应器,其共同特点是反应器内装有比表面大的载体,有利于微生物附着生长形成生物膜,供气或供给的其他反应条件优越,污染物具有充分的时间与微生物接触,有利于增强微生物的分解代谢能力。目前,2000m3的反应器已经问世。虽然其处理能力较低,造价较高,但其管理方便 ,运行费用低,所以欧美地区约有 7%的污水处理厂采用该技术[6]。
3 生物修复技术
生物修复技术[7]是利用生物,特别是微生物将土壤、地下水或海洋中污染物现场降解为co2和h2o或转化为无害物质的工程技术系统。这项技术正被用于清除地下水、废水中的污染物。金属虽然不能被生物降解,但微生物可将其转移或降低其毒性。为了加快去除污染物的进程,常常采用许多强化措施,使自然生态系统维持原状的前提下,使受污染的环境得以修复。研究表明 ,生物修复与传统的物化法相比具有以下优点:①经济,仅为物化法30%-50%;②对环境影响小,不产生二次污染,遗留问题少;③最大限度地降低污染物的浓度;④修复时间较短,就地修复,操作方便。
生物修复中主要涉及两大问题,即有效性和安全性评价。为提高有效性今后将应用分子微生物学分离、鉴别、制造更高效降解和聚集有害有毒化合物的微生物。为提高生物修复的安全性评价水平,需发展鉴定微生物的分子生物技术,以确定微生物在环境中的去留和基因[8]。
4 微生物水处理剂
微生物水处理剂主要集中在以下几个方面:①微生态制剂。微生态制剂是一种由优势互补的微生物菌群、繁殖促进剂和活化剂配制而成的活性微生物制剂,已经在保健领域发挥重要作用。用于环境净化的微生态制剂由于其应用范围广、使用安全、无副作用,为区域环境保护提供了新的重要手段。欧美近年来加快了这方面的研究开发,已有采用微生态制剂原位修复水体的成功实例[9]。②生物吸附剂。生物吸附剂是废水生物处理的一个新的发展方向,主要有两大类:一类是高比表面积和高吸附率的生物体吸附水中的污染物;另一类是集生物吸附和生物降解能力为一体净化废水中的污染物的生物吸附剂。目前生物吸附剂的固定化技术使生物与离子交换树脂一样能解吸回收金属和重复利用。③微生物絮凝剂。微生物絮凝剂是利用生物技术,通过微生物发酵,抽提精制而得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、无毒的廉价的水处理剂,这些是无机或有机合成高分子絮凝剂所不具备的。其特点是降解性能好,成本低,无二次污染等。目前,已筛选出19种具有絮凝能力的微生物,其中,霉菌8 种,细菌5种,放线菌5种,酵母菌1种[10]。随着生物技术的发展,微生物水处理剂的开发与应用具有良好的前景。
现代生物技术在水污染控制领域已显示出独特的魅力和应用前景。但笔者认为,今后应从四个方面进行深入研究:①分离、筛选和培养高效降解菌,利用微生物共代谢作用、多菌种协同作用降解难降解污染物;②构建高效反应器,优化运行条件,探索新技术新方法;③开发高效、无毒、廉价、可大批量生产的微生物水处理剂;④着力实践和推广生物修复示范工程,为生态环境建设提供有力的技术支持。
参考文献:
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[2]王凯军.发达国家环境生物技术研究规划简介[j].给水排水.1996.22(9):7-9.
【关键词】有机污染物微生物处理基因代谢
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:
一、引言
环境中存在一些滞留时间长、难于直接降解的有机污染物,其中有一些污染物毒性高,具致畸、致突变、致癌及生殖毒性,对人类健康造成威胁的物质。随着有机化合物使用量增大,在很多自然水体中都可以检测到,而且远远超过联合国环境规划署规定的安全浓度,造成严重的环境污染,采用生物降解手段来处理这些污染物成为国内外的研究热点。
微生物对广泛分布在自然界中的有机污染物具有降解作用,已经发现许多微生物对有毒、难降解的有机化合物具有生物降解能力,使得被污染的环境得到修复。微生物修复技术由于成本低、效果好、对环境负面影响小且无二次污染等优点,受到广泛关注。因此,利用生物界中存在的有净化能力的微生物进行生物治理,已成为环境治理的主要手段之一。
国内外许多学者致力于研究如何利用微生物处理技术来提高有机污染物的降解效率,本文综述了近年来微生物处理有机污染物等方面的研究进展,并对其研究方向进行了概述。
二、有机污染物的微生物处理研究进展
1、利用有效菌种降解有机污染物
通过从污染现场的分离,目前已经得到不少能够降解有机污染物的特殊菌种。如广州科研所研制出了具有广谱脱色能力和降解苯胺能力的希瓦氏菌;中科院兰州化物所从土壤中筛选出的“帕氏氢噬胞菌LHJ38”和“类黄氢噬胞菌LHJ39”,对芳香烃类化合物有较强的降解作用。任华峰等人从活性污泥中分离出一株降解对氯苯胺的细菌PCA039菌株,该菌株能够以对氯苯胺为唯一碳源与氮源生长。美国研究人员发现一种叫G4的细菌,对高浓度的三氯乙烯(TCE)有分解能力。日本研究人员也获得一种叫M菌的菌株具有类似的降解TCE的效力。在美国,还获得耐抗生素的拟球菌195菌株,能专一地使高氯乙烯(如四氯乙烯)完全转化为无害的乙烯。
2、基因工程菌在生物降解中的应用
基因工程技术作为生物降解处理有机污染物研究的前沿领域,能够提高微生物的降解速率,拓宽底物的专一性范围,维持低浓度下的代谢活性,改善有机污染物降解过程中的生物催化稳定性等。因此从环境中筛选分离出的菌种,经过基因工程手段改造后能够成为具有特殊降解功能的超级工程菌。
石油污染在中国乃至世界是一个很大的危害,所以急需寻找能够降解石油污染物的工程菌。Chakrab-arty等人在20世纪70年代首先构建成功了具有多种降解功能的细菌菌株。他们将假单胞菌中不同菌株的CAM、OCT、SAL、NAH四种降解性质粒接合转移至1个菌株中,构建成1株能同时降解芳香烃、多环芳烃、菇烃和脂肪烃的“超级细菌”。该菌能将天然菌要花一年以上才能消除的浮油缩短为几个小时,取得了美国的专利权,在污染治理工程菌的构建上,这是第一块里程碑。
崔中利等分离到一株假单胞菌(Pseudomormssp)P3,该菌能够以对硝基苯酚为唯一碳源和氮源进行生长,P3有比较广泛的底物适应性,对多种芳香族化合物都有降解能力,以P3为受体菌,通过接合转移的手段将甲基对硫磷水解醇基因mpd克隆至P3菌中,获得了具有甲基对硫磷水解酶活性的基因工程菌PM,PM能够以甲基对硫磷为唯一碳源进行生长,具有较高的甲基对硫磷降解活性及稳定性。多环芳烃萘可采用现场活体转基因微生物进行修复。Sayler等利用经过萘降解质粒PUTK21修饰的Pseudomonas fluorescens菌株HK44对萘进行降解,其中降解质粒经过了lux基因诱变。该转基因微生物对萘的降解分为两步,首先是使萘转化为水杨酸盐,然后氧化水杨酸盐使其成为乙醛和丙酮酸盐。当该转基因微生物暴露于萘或其代谢中间产物时,该生物体就会发光,我们就可以通过光学和光子计算模型对其进行在线监测。
3、代谢工程在生物降解中的应用
通过代谢工程手段可以把不同宿主细胞来源的代谢组件组装到一个宿主细胞中,从而达到创造新的代谢途径,扩大宿主底物利用范围,使宿主对某些环境污染物部分降解为彻底矿化等目的,防止生成难以降解的终端产物或有毒的中间产物而对环境造成二次污染。
如恶臭假单胞菌P・prtida mt22虽然具有降解广泛底物的甲苯途径,但它不能直接利用苯作为底物,这限制了对石油污染物的降解。Lee等人克隆了编码甲苯还原酶的基因todClC2BA,并将重组质粒导入P・prtida mt22中,使重组菌株可以彻底降解苯、甲苯和二甲苯。
Walker等将有机磷水解酶基因opd和来自Pseudomonas sp・ENV2030的对硝基苯酚降解酶基因转入Pseudomonas putida中得到能以对硫磷作为唯一碳源和能源生长的工程菌,为该类污染物的降解提出了新的方法。
2-氯甲苯(2-chlorotoluene)也是一类较难降解的氯代芳香族化合物。Haro MA等对2-氯甲苯的代谢降解途径进行了深入的研究,并构建了可以降解2-氯甲苯的假单胞工程菌。组合的途径包括:从菌株Pseudomonas putida F1的TOD系统获得一个编码甲苯双加氧酶基因(todC1C2BA)的片段,可以将2-氯甲苯转化为2-氯苯甲醛;另一个片段来自Pseudomonas putida mt-2菌株的PWW0质粒,编码整个TOL途径,表达的苯甲醇脱氢酶(由xylB编码)和苯甲醛脱氢酶(由xylC编码)可以将2-氯苯甲醇转化为2-氯苯甲酸。将上述的TOL和TOD片段组合到单个的mini-Tn5转座子,再将此转座子整合到2-氯苯甲酸降解菌Pseudomonas aeruginosa PA142和Pseudomonas aeruginosa JB2的染色体上,然后通过实验,证明的确可以将2-氯甲苯矿化,同时证明,PA142和JB2都不能将2-氯甲苯作为唯一的碳源。
三、微生物处理技术研究的主要方向
1、寻求能够降解有机污染物的高效的多功能菌种
前面已经介绍了大量的国内外关于这方面的报道。但是这些已发现的自然菌种或者已经构成的工程菌大部分都是专一性菌种,寻找降解性更强的多功能降解菌群仍是研究的主要任务之一。
2、提高有机污染物的可利用性
大部分有机污染物的辛醇水分配系数都很高,尤其是污泥中的有机污染物,因为它们都是经过水处理以后富集在污泥当中的。这些污染物吸附在污泥上,难以与微生物接触,由此导致有机物的可利用性降低。为了提高有机物的可利用性,这方面的工作主要集中在对疏散和解吸污染物非常有效的表面活性剂上。TiehmA等人用两种聚乙烯烷基苯基醚非离子表面活性剂研究了多环芳香烃的生物可利用性。结果表明,由于表面活性剂增强了多环芳香烃的活性而加快了PAHs的降解,所有的实例中均发现了土壤污染毒性的降低。房敏等人研究多环芳烃的降解性时添加了非离子表面活性剂吐温80,发现吐温80的添加对蒽和芘的生物降解率有着显著的作用,分别是不加表面活性剂对照处理的1.5倍和2.5倍。
3、探明高效降解菌株的代谢动力学和代谢机理
目前对于微生物降解有机污染物的代谢动力学和代谢机理的报道还不太多,尤其是关于共代谢的机理,到目前也没有形成统一的解释。Foster认为微生物不能在某种基质上生长的原因,并不是因为微生物不能分解代谢该物质,而是由于微生物本身缺乏吸收、同化其氧化产物的能力。Hughes提出卤代芳烃化合物的共代谢是由于微生物无法从苯环上脱去卤素取代基,并把芳香环基质导向碳吸收同化的节点。Tranter和Cain把具有氧化代谢卤代芳烃化合物功能的细菌不能在该基质上生长的原因归结于中间产物的抑制。但目前提出的各种假设都不能圆满的解释实际工程中所发生的各种共代谢现象,而且不同的生长基质培养出的细菌的驯化能力是不一样的。对于机理的研究一般包括阐明共代谢底物的反馈机制、传递效率、氧气供应等。王建龙等人对具有高效脱氯能力的微生物群落的生理特性进行了研究,结果表明,该微生物群落可以利用丙酮酸为碳源和能源,丙酮酸发酵、硫酸盐还原和脱氯反应三个过程严格的按顺序依次进行,并且丙酮酸浓度在最初2天内急剧下降,同时有代谢产物乙酸、甲酸和氢气形成。只有当硫酸盐被还原成硫化物后,脱氯反应才会发生,硫酸盐和钼酸盐的存在会强烈抑制微生物的脱氯活性。溴乙烷磺酸酯可以完全抑制微生物的产甲烷活性。
总结
科学技术的发展扩大了环境微生物研究的广度和深度,这些技术的发展必然提高人们对降解性微生物的整体和系统的认识,使得这项研究更具目标性和可控性,为更有效地治理难降解污染物提供坚实的理论和技术支持。
参考文献
[1] 陈维璞,柴硕,李茹山,史雪廷.难降解有机污染物的生物治理[J].黑龙江科技信息.2010(18)