基因多态性分析的意义

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基因多态性分析的意义范文第1篇

【摘要】 目的 探讨亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)C677T多态与上海地区汉族人群骨质疏松性骨折遗传易感性的关系。方法 采用TaqMan方法检测205例骨质疏松性骨折患者(骨折组)与205例健康人群(对照组)MTHFR C677T的基因型分布及差异。结果 骨折组中的T等位基因频率为43.7%，显著高于对照组(36.1%，P=0.027)，提示T是骨折发生的危险因素(OR=1.37，95% CI=1.04～1.82)。与CC基因型相比，CT基因型和TT基因型携带者的骨折发生风险分别增加至1.48倍(95% CI=0.95～2.31，P=0.083)和2.11倍(95% CI=1.15～3.89，P=0.017)。将CC、CT和TT视为不同的等级，存在等位基因剂量反应关系(P=0.027)。结论 T增加骨折发生风险，并呈等位基因剂量反应关系，TT基因型是上海地区汉族人群发生骨质疏松性骨折的遗传易感因素。

【关键词】 骨质疏松性骨折;疾病遗传易感性;基因，亚甲基四氢叶酸还原酶;基因多态

近年来遗传因素对骨质疏松性骨折发病的影响逐步受到重视。现已经发现多种与其发病相关的基因，如维生素D受体、雌激素受体、I型胶原蛋白等〔1～3〕。亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)是另一重要的影响骨质疏松性骨折发病的候选基因，其编码蛋白与同型半胱氨酸代谢密切相关，而高水平的血清同型半胱氨酸被证实参与骨质疏松性骨折的病理发生〔4，5〕。MTHFR基因在人群中具有多态性，其中以位于催化区的C677T最为常见，导致酶活性、热稳定性下降和血清同型半胱氨酸水平增加。已有研究显示，MTHFR C677T是欧洲丹麦人群发生骨质疏松性骨折的遗传易感因素〔6～8〕。但对我国香港人群的研究结果则显示，MTHFR C677T与骨质疏松性骨折发病风险无关〔9〕。本研究旨在探讨我国上海地区汉族人群中MTHFR C677T多态性与骨质疏松性骨折的关系。

1 材料与方法

1.1 对象 从门诊及住院病人中随机抽取确诊为骨质疏松性骨折的上海籍汉族患者205例，男58例，女147例，年龄52～83岁，平均(66.3±7.2)岁。其中椎体骨折89例，髋部骨折116例。骨质疏松诊断标准依据WHO规定(骨密度低于同性别骨峰值的-2.5个标准差)。对照组为门诊体检的上海籍汉族健康人群205例，男57例，女148例，年龄51～83岁，平均(66.6±7.2)岁。入选标准为骨密度大于同性别骨峰值的-1个标准差。两组性别、年龄方面保持均衡，具有可比性。对全部对象行腰椎(L2～L4)及髋部(髋部骨折患者检测健侧)骨密度检查，排除影响骨代谢的疾病(代谢性、废用性及某些药物、营养不良等所致骨病;骨肿瘤;特发性骨质疏松等)或曾服用影响骨代谢的药物者。

1.2 方法 按常规蛋白酶K、酚/氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，MTHFR基因C677T多态基因型分析采用TaqMan方法，引物和探针的设计用Primer Express软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)完成。引物和探针的序列如下：上游引物：5′AGGCTGACCTGAAGCACTTGAA3′;下游引物：5′CTCAAAGAAAGCTGCGTGATGA3′;等位基因C特异性TaqMan 探针：5′FAMTGTCTGCGGGAGCCGATTTCAMGB3′;等位基因T特异性TaqMan探针：5′TETAGGTGTCTGCGGGAGTCGATTT

CAMGB3′;扩增片段长度74 bp。PCR扩增体系(25 μl)中含:1× TaqMan PCR master mix (Applied Biosystems，Foster City，CA)，1 μl(50 ng/μl)基因组DNA，1 μmol/L上游、下游引物，0.2 μmol/L FAM标记探针，0.2 μmol/L TET标记探针。扩增参数：50℃ 预热2 min，95℃ 预变性10 min，然后95℃ 变性15 s，62℃ 复性1 min，共40个循环，最后在ABI 7700上检测荧光信号。基因型分析用Sequence Detector System 2.0 软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)。

1.3 统计学处理 以非条件Logistic回归法计算表示相对危险度的比值比(OR)及其95%可信区间(CI)。OR值均经性别、年龄、吸烟和体重指数(BMI，kg/m2)校正。采用SPSS11.0统计分析系统。HardyWeinberg遗传平衡和趋势检验在Internet上进行(ihg.gsf.de/ihg/snps.html)。

2 结 果

见表1。较大体重指数者(>24.0)在骨折组和对照组中分别占29.3%和50.7%(P

对照组MTHFR C677T基因型频率：CC 41.0%、CT 45.9%和TT 13.2%，符合HardyWeinberg遗传平衡定律(P=0.931)，而骨折组的基因型频率：CC 31.2%、CT 50.2%和TT 18.5%。骨折组中T等位基因频率为43.7%，对照组为36.1%，T的骨折发生风险是C的1.37倍(95% CI=1.04～1.82，P=0.027)。与CC纯合子比较，CT杂合子的骨折风险增加至1.48倍(95% CI=0.95～2.31，P=0.083)，而TT纯合子的骨折风险显著增加至2.11倍(95% CI=1.15～3.89，P=0.017)。将CT和TT基因型合并计算，则其骨折的发病风险显著增加至1.62倍(95% CI=1.06～2.46，P= 0.025)。若将CC、CT和TT视为不同的等级，存在等位基因剂量反应关系(P=0.027)。表1 两组对象多种危险因素频率及其与骨质疏松性骨折的风险〔n(%1)经表中各危险因素校正

3 讨 论

MTHFR与同型半胱氨酸代谢密切相关，而高水平的血清同型半胱氨酸被证实参与骨质疏松性骨折的病理发生〔4，5〕。MTHFR C677T多态性改变可导致酶活性和热稳定性下降，血清同型半胱氨酸水平增加。因此，该多态性可能是人群骨质疏松性骨折的一个危险因素。本研究证实，MTHFR C677T至少是我国上海地区汉族人群骨质疏松性骨折的一个遗传易感因素。

以往对MTHFR C677T与骨质疏松性骨折发病风险关系的研究主要集中于欧洲丹麦人群，Abrahamsen等〔6～8〕研究显示，MTHFR T等位基因携带(CT、TT基因型)与骨质疏松性骨折发病风险增加有关，这与本研究结果一致。但Li等〔9〕以我国香港人群为对象的研究则显示，MTHFR C677T与骨质疏松性骨折发病风险无关。其不一致的原因可能香港地区正常人群中CC、CT及TT基因型频率分别为0.62、0.33和0.05，而上海地区正常汉族人群中三种基因型频率分别为0.41、0.46和0.13，提示人群差异可能是造成两项研究结果不一致的重要原因之一。新近以我国安徽省女性人群为对象的研究显示〔10〕，MTHFR T等位基因女性携带者发生骨质疏松性骨折的风险与CC基因型相比呈显著性增加。本研究进一步表明，T等位基因携带不仅显著增加女性发生骨质疏松性骨折的风险，也同样增加男性的发病风险。

综上所述，MTHFR 677TT基因型至少是我国上海地区汉族人群骨质疏松性骨折的一个遗传易感分子，可作为骨质疏松性骨折高危人群的筛选指标。

参考文献

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3 Navarro MC， Sosa M， del PinoMontes J， et al. Collagen type 1 (COL1A1) Sp1 binding site polymorphism is associated with osteoporotic fractures but not with bone density in postmenopausal women from the Canary Islands：a preliminary study〔J〕.Aging Clin Exp Res，2007;19(1)：49.

4 van Meurs JB，DhonuksheRutten RA，Pluijm SM，et al.Homocysteine levels and the risk of osteoporotic fracture〔J〕.N Engl J Med，2004;350(20)：203341.

5 McLean RR，Jacques PF，Selhub J，et al.Homocysteine as a predictive factor for hip fracture in older persons〔J〕.N Engl J Med，2004;350(20)：20429.

6 Abrahamsen B，Madsen JS，Tofteng CL，et al.A common methylenetetrahydrofolate reductase (C677T) polymorphism is associated with low bone mineral density and increased fracture incidence after menopause：longitudinal data from the Danish osteoporosis prevention study〔J〕.J Bone Miner Res，2003;18(4)：7239.

7 Villadsen MM，Bunger MH，Carstens M，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism is associated with osteoporotic vertebral fractures，but is a weak predictor of BMD〔J〕.Osteoporos Int，2005;16(4)：4116.

8 Bathum L，von Bornemann Hjelmborg J，Christiansen L，et al.Evidence for an association of methylene tetrahydrofolate reductase polymorphism C677T and an increased risk of fractures：results from a populationbased Danish twin study〔J〕.Osteoporos Int，2004;15(8)：65964.

基因多态性分析的意义范文第2篇

【关键词】 成人迟发自身免疫型糖尿病； MICA基因； 第5外显子

中图分类号 R587.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）16-0036-02

随着社会与经济的发展，糖尿病患者数量在迅速增多，对糖尿病的研究也逐渐深入。目前糖尿病主要分为1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM），其中成人迟发自身免疫型糖尿病（LADA）属于缓慢进展性1型免疫介导性糖尿病中一个亚型，因其发病时间较晚主要存在于成人中而得名，在糖尿病患者群体中约占有12%[1]。该病慢性进展为T1DM是受到触发因素的影响还是由于遗传背景原因一直是临床争论的焦点，因此对于MICA基因中第5外显子多态性与LADA发病的关系也成为了对该病的一个主要研究方向[2]。本文对笔者所在医院LADA患者、T2DM患者以及正常体检者的MICA外显子5多态性进行对比观察，以分析其与LADA发病之间的相关性，作为临床参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年5月-2013年8月收治的LADA患者33例（LADA组），其中男17例、女16例，平均年龄（39.82±7.14）岁；另选取同期收治2型糖尿病患者35例（T2DM组），其中男19例、女16例，平均年龄（38.75±8.36）岁；以及正常体检者40例（NC组），其中男21例、女19例，平均年龄（37.42±11.25）岁。三组年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。LADA组入选标准，年龄超过25岁，有明显“三多一少”等糖尿病临床症状，起病后6个月可不依赖胰岛素治疗且未出现酮症，胰岛自身抗体呈阳性[3]。

1.2 方法

所有入选研究对象均实施同样的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术及PAGE银染技术队MICA第5外显子多态性进行观察，具体步骤如下：首先制备基因组DNA，通过DNA试剂盒对全血基因组DNA进行提取，并使用无水乙醇进行DNA沉淀。而后实施PCR扩增，所应用上游引物序列为5’-CCT TTT TTT CAG GGA AAG TGC-3’，下游引物序列为5’-CCT TAC CAT CTC CAG AAACTG C-3’；反应体系为50μl，其中包括基因组DNA（0.3 μg/μl）含量为5 μl，其上下游引物（10 pmol/L）含量为各5 μl，MgCl2（25 mmol/L）含量为2.5 μl，Taq酶（5 U/μl）含量为0.5 μl，dNTPs（2 mmol/L）含量为1 μl，以及10*buffer缓冲液5 μl和ddH2O 26 μl；设定以下反应条件，在94 ℃环境下进行5 min预变性及45 s变性，而后通过57℃退火及72 ℃延伸各30 s为一个循环，经过30个循环后，进行5 min的72 ℃延伸，而后保存在4 ℃环境下[4]。扩增后使用2%琼脂糖凝胶进行电泳并使用溴化乙锭进行染色，通过紫外灯照射观察。

1.3 观察指标

与NC组相对比，观察LADA组及T2DM组MICA基因外显子5的5种等位基因（A4、A5、A5.1、A6、A9）频率分布情况，并进行统计学对比分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS 15.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用字2检验，P

2 结果

LADA组患者MICA第5外显子中A5.1等位基因的频率相比NC组明显增高，两组比较差异有统计学意义（P0.05）；T2DM组患者MICA第5外显子等位基因多态性分布与NC组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。详见表1。

3 讨论

随着我国社会经济发展与居民生活水平提高、饮食结构改变等，糖尿病已经成为对我国居民健康、生命造成严重影响的重点疾病之一，给患者的家庭与社会均造成了极大的负担[5]。而随着对糖尿病研究的进一步深入，不同类型糖尿病之间差异以及诊治特点成为有效治疗糖尿病患者的重要前提。

LADA属于1型糖尿病中的缓慢进展型，也具有自身免疫破坏的特点，但该病发病初期与T2DM具有较为相近的临床表现，在临床上进行初诊时常会因临床特征而被误诊为T2DM。如按照T2DM治疗方法在该病早期应用降糖药能够形成控制，但随病程缓慢进展会逐渐失效，甚至可产生酮症酸中毒[6]。

该病发病机制与糖尿病患者引起自身免疫破坏机制基本相同，但其中较为特殊的是胰岛β细胞的免疫破坏会呈现缓慢进展性，这一机制的诱发是受到外界触发因素的影响，还是受到遗传因素的干扰是临床上争论的焦点。在1994年发现MIC基因家族中的MICA基因后，对其与LADA发病之间的相关性研究一直收到国内外相关领域的重视。相关研究发现，MICA基因包含外显子6个、内含子5个，而其中第5外显子具有GCT重复序列微卫星多态性，包含有A4、A5、A5.1、A6、A9五个等位基因[7]。通过对MICA等位基因与LADA发病过程之间关系的研究，发现其中等位基因A5.1与LADA发病之间存有密切的关联，从这一角度而言为LADA受到遗传因素诱发提供了有力的依据[8]。

因各国患者群体MICA基因多态性有所不同，因此本文作者对我国患者的MICA外显子5多态性与LADA之间进行研究，发现LADA组患者MICA第5外显子中A5.1等位基因的频率相比NC组明显增高，两组比较差异有统计学意义（P0.05）；T2DM组患者MICA第5外显子等位基因多态性分布与NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。由此可见，LADA患者的MICA基因外显子5多态性与正常人有异，其中等位基因A5.1与LADA发病存在较密切相关性，是LADA的重要危险因素。

参考文献

[1]刘鹏鹰，丁洪光，刘君英，等.MICA外显子5多态性与成人迟发自身免疫型糖尿病的相关性研究[J].深圳中西医结合杂志，2010，20（1）：22-24，28.

[2]李玉萍.CTF7L2基因多态性与2型糖尿病及LADA的相关性研究[D].长沙：中南大学，2011.

[3]柳江.成人隐匿性自身免疫糖尿病的临床筛查线索及其与LYP/PTPN22基因多态性相关性研究[D].苏州：苏州大学，2009.

[4]周圆，汪大望.成人隐匿性自身免疫性糖尿病研究进展[J].国际内分泌代谢杂志，2008，28（4）：249-252.

[5]谭愈昱.自身免疫性糖尿病患者NK细胞关键受体与配体基因及其表达的探讨[D].长沙：中南大学，2010.

[6]丁洪光.LADA与CTLA-4、VDR、MIC-A基因多态性的相关性研究[D].广州：广州医学院，2010.

[7]王竞.成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）临床特征及其与CTLA-4基因多态性关系的病例对照研究[D].天津：天津医科大学，2008.

基因多态性分析的意义范文第3篇

【关键词】IL-8；龋；牙周炎

【中图分类号】R78 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）01-0115-01

龋病是一种危害人类健康的常见口腔疾患。细菌及其毒素极易侵袭至牙髓，从而激发牙髓的免疫系统，产生多种细胞因子。IL-8是重要的促炎因子和免疫调节因子，在龋病性牙周炎的发病机制中具有重要作用[1]　。本文检测正常、不同龋病龈沟液中IL-8，并进行基因多态性分析。了解IL-8在不同牙周状态下含量的变化及其在龋源性牙周炎发生、发展过程中的意义。

1　资料和方法

1.1　病例选择：所选我院就诊患者。选择因修复等原因拔除的30　颗无龋损和充填体、无牙髓疼痛史的完整牙齿为对照组。选择临床诊断为不同龋齿的患牙各30颗。

1.2　标本的收集和检测：去除受试牙面的龈上菌斑、牙石，将吸潮纸尖分别插入每颗受试牙的颊、舌面的近中和远中4个位点。将取完后的四根吸潮纸尖一同放回原EP管中再次称重，减去原记录重量，即为所测龈沟液重量。用双抗体夹心ABC-ELISA法检测牙髓组织中IL-8含量。所有研究对象都是汉族，用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析检测病例组和对照组的IL-8基因-251位点的基因型分布，IL-8基因251位点有3种基因型，TT纯合子、AT杂合子、AA纯合子。

1.3　统计分析：　采用SPSS10.0统计软件包对结果进行秩和检验。

2　结果

2.1 龋病及牙周炎程度与IL-8含量关系

所有龈沟液及牙髓标本均检出了IL-8，不同个体IL-8含量差异较大。IL-8含量在深龋、重度牙周炎中最高，分别与正常牙齿牙髓组分别对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

龈沟液中IL-8浓度（ng/L）

2.2　龋病牙周炎程度与IL-8基因多态性分析

分析酶切产物，IL-8基因-251位点有3种基因型：TT、AT、AA。如图所示，如为TT纯合子，则l条DN段长度为106bp，AT杂合子3条DN段长度分别为106，75，31bp，AA纯合子2条DN段长度为75和31bp。

3　讨论

龋病的发生、发展是一个由变链菌、粘性放线菌和乳杆菌等参与的感染性慢性进行性牙体硬组织的破坏过程[2]　。细胞因子（CK）　的深入研究使人们对炎症的认识有了突破性的进展。在对炎症的认识过程中，已从传统的炎性介质深入到CK　途径[3]　，　IL-8是诱导炎症细胞反应中的最初介质，具有广泛的生物学效应，可活化各种炎细胞，减低血管张力，增加血管通透性。从试验结果看，牙髓组织中均存在IL-8，其含量可反应龋病进展过程中的牙髓健康状态及其免疫防御功能，它是反应龋病牙髓状态的重要细胞因子。在龋病牙髓炎中TA、AA基因型出现频率的差别具有统计学意义，说明在遗传背景下携带TA、AA基因型者发生龋病的风险可能增加，IL-8基因-251位点AA及TA基因型可能是汉族人群龋病的易感基因型。研究龋病现状、病因及病变程度中细胞因子的变化及其与龋病病变程度的关系，为临床防治及判断预后有重要的意义。

参考文献：

[1]　刘军，刘岚，曹志中，等.　肿瘤坏死因子对创伤牙髓组织修复的调节作用.　中国临床康复，2004　，8　（5）　：860　-　861.

基因多态性分析的意义范文第4篇

【摘要】 目的： 探讨klotho基因c?1818t多态性与中国苏皖地区汉族人群不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris, uap）的可能关系。方法： 应用聚合酶链反应（pcr）及基因芯片（gene microarray）方法，检测146例uap患者和235例非冠心病者的klotho基因c?1818t多态性。结果： 与对照组相比：(1)uap患者cc，ct和tt基因型以及t等位基因型频率分布差异无统计学意义（p值均＞0.05）；(2)年龄<60岁的uap组tt基因型频率和女性uap组tt基因型，t等位基因频率均明显升高（p值分别为0.017，0.049，0.026）。在调整相关危险因素并经多元logistic回归分析后，tt基因型与女性uap的发生存在相关性（p=0.041），而t等位基因与女性uap的发生无明显关联（p=0.472）。结论： 在中国苏皖地区汉族人群中，klotho基因c?1818t多态性tt基因型与女性uap的发病存在相关性。

【关键词】 klotho；基因多态性；不稳定性心绞痛

［abstract］ objective: to investigate the possible association between the klotho gene c?1818t polymorphism and unstable angina pectoris (uap)in a chinese han population of suwan region. methods： this study was conducted with a case?control design including 146 patients with uap and 235 control subjects who were free from coronary artery disease. the klotho gene polymorphism was determined by polymerase chain reaction and gene microarray. results： compared with the control group, (1)the frequencies of cc，ct，tt genotype and the t allele of the c?1818t in uap group was not significantly different; (2)the prevalence of the tt genetype was obveriously higher in younger (age＜60)patients (p=0.017), the frequencies of tt genetype and t allele were also higher in female (p value was 0.049 and 0.026 respectively). furthermore, after adjustment for conventional risk factors by multiple logistic regression analysis showed that the tt genotype was a significant risk factor for uap in the female carrier (p=0.041), but the t allele had no association with uap in female (p=0.472). conclusion： the tt genetype of klotho gene c?1818t polymorphism was associated with the susceptibility to uap in the female among the chinese han population of suwan region.

［key words］ klotho; genetic polymorphism; unstable angina pectoris

内皮细胞的凋亡及更替在动脉粥样硬化斑块形成中起着关键的作用［1,2］。kuro?o等［3］发现动脉粥样硬化是klotho基因缺陷鼠的一种表型，对klotho蛋白的研究［4-9］认为它可通过上调血管紧张素转换酶（ace）、调节内皮细胞释放血管内皮生长因子、no等产物及改善血管应激、影响血管紧张度和血栓形成达到抗粥样硬化作用，从而保护心血管系统。以上研究表明klotho基因与动脉粥样硬化存在着重要的联系。虽然目前所知与动脉粥样硬化形成相关的基因已有400个左右，但对动脉粥样硬化候选基因进行的一系列大规模基础研究尚未获得预期结果［10,11］。本研究旨在探讨中国苏皖地区汉族人群klotho基因c?1818t多态性分布及其与不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，uap）的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

入选病例均选自2003年11月～2007年2月在江苏大学附属武进医院、江苏省人民医院住院患者。选择uap患者（uap组）146例，男117例，女29例，年龄41～84（平均65.82±9.47）岁，均符合2002年aha/acc关于uap诊断指南的诊断标准。对照组为经相关检查排除冠心病者235例，其中男138例，女97例，年龄36～84（平均61.58±10.93）岁，大部分经冠状动脉造影证实冠状动脉主支无狭窄或狭窄直径小于50%。所有研究对象均为中国苏皖地区汉族人。

1.2 方法

1.2.1 聚合酶链反应（pcr） 酚?氯仿法提取白细胞基因组dna。由takara公司合成引物，上游引物：5′?gaatgtttacctgtgggatg?3′，下游引物：5′?丙烯酰胺?tgtggttcacctgggact ?3′，预计pcr扩增产物片段长度为209 bp。反应体系：10×缓冲液5 μl，mg2+终浓度为2.0 mmol/l，4种dntp终浓度为0.2 mmol/l，上下游引物各5 pmol，taq dna酶1.25 u（takara），模板dna 100 ng。反应条件：94℃ 5 min，然后94℃ 48 s，58℃ 40 s，72℃ 55 s进行37个循环，72℃延伸5 min。取pcr产物5 μl采用琼脂糖凝胶-溴化乙啶法进行电泳（图1），uvi自动凝胶成像分析系统观察并结合dna分子量标准及测序方法（大连宝生物公司）判断是否为预期的目的片段。

m: dl?2000 标准参照物 (takara)；1～8: pcr产物电泳条带

图1 klotho基因c?1818t多态性pcr产物电泳图（略）

fig 1 electrophoretic image of pcr protector klotho　gene c?1818t polymorphism

1.2.2 基因芯片制备 冰异丙醇沉淀pcr产物，12 000 r/m离心45 min后37℃烘干备用，同时制备玻片（sigma公司）；取上述纯化产物，加18 μl点样液溶解，0℃保存20 min；将上述混合液置于384微孔板中，放入smartarrayer?48（晶芯，博奥生物公司）点样仪并在玻片上完成全部点样；点样后，玻片在temed中真空干燥1 h，然后按序置于0.1×naoh缓冲液变性10 min，1×tbe缓冲液电泳10 min；取等量5′?cy3? atgcacgttacacatt, 5′?cy5?aaatgcatgttacacatt单核苷酸探针，与杂交液1:3稀释后，在37 ℃下与点有样品的玻片杂交3 h后置于冰冷的1×tbe缓冲液中电泳10 min。

1.2.3 基因型判断 用capitalbiotm扫描仪（晶芯，博奥生物公司）对杂交后的玻片进行扫描，并根据cy5/cy3比值判断基因型（图2）。

1.2.4 生化指标测定 采用全自动生化分析仪（奥林巴斯公司）测定三酰甘油（tg）、低密度脂蛋白（ldl）、高密度脂蛋白（hdl）和血糖（glu）等指标。

1.3 统计学分析

计量资料结果以±s表示，采用t检验，研究对象组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，应用多元logistic回归分析基因型与uap的相关性，关联程度用优势比（odds ratio, or）和95%可信区间（confidence interval, ci）表示。所有资料均采用spss 13.0软件进行分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 uap组与对照组临床资料分析

两研究组收缩压（sbp），舒张压（dbp），glu，tg，ldl水平差异无统计学意义；uap组年龄、男性性别比及吸烟比例明显高于对照组，而hdl水平明显低于对照组（表1）。

表1 两组基本资料比较（略）

tab 1 baseline characteristics in two groups

2.2 klotho基因型分析及dna序列测定

第四外显子c?1818t多态性pcr扩增产物为209 bp的片段（图1），采用基因芯片方法判断基因型，本研究检测到3种基因型：红色为tt基因型；黄色为ct基因型；绿色为cc基因型（图2）。并抽取部分pcr产物经测序验证其基因型（图3）。

2.3 klotho基因多态性分布

与对照组相比：(1)uap组cc，ct，tt基因型及t等位基因频率差异无统计学意义（表2，p>0.05）；(2)亚组分析：女性uap患者的tt基因型（p=0.049）及t等位基因（p=0.026）频率、非老年（＜60岁）uap患者tt基因型频率（p=0.017）均明显升高（表3，4）；老年（≥60岁）、男性uap患者cc，ct，tt基因型和t等位基因频率与非老年uap患者cc，ct基因型和t等位基因频率及女性cc，ct基因型频率差异均无统计学意义（表3，4）。

表2 klotho基因c?1818t多态性分布（略）

tab 2 genotype distribution and allele prevalene of klotho gene c?1818t polymorphisms

表3 不同年龄组klotho基因c?1818t多态性分布（略）

tab 3 genotype distribution and allele prevalene of klotho gene c?1818t polymorphisms in different age populations

表4 不同性别研究对象klotho基因c?1818t多态性分布（略）

tab 4 genotype distribution and allele prevalene of klotho polymorphisms in different sexual populations

2.4 klotho基因tt基因型和t等位基因与女性uap患者的关系

在调整吸烟、年龄，sbp，dbp，glu，tg，ldl，hdl等危险因素并经logistic回归分析后，tt基因型与女性uap存在相关关系（p=0.047，表5），而t等位基因与女性uap无明显相关关系（p=0.472，表6）。

表5 klotho基因c?1818t多态性tt基因型与女性uap患者的关系（略）

tab 5 unadjusted and adjusted odds ratios for the association between tt genotype of the　c?1818t polymorphism and cases in female

* ：为调整吸烟、年龄，sbp，dbp，glu，tg及ldl等危险因素并经logistic回归分析的or值，95%ci及p值

表6 klotho基因多态性t等位基因与女性uap患者的关系（略）

tab 6 unadjusted and adjusted odds ratios for the association between t allele of　the c?1818t polymorphism and cases in female

*：为调整吸烟、年龄，sbp，dbp，glu，tg及ldl等危险因素并经logistic回归分析的or值，95%ci及p值

3 讨论

klotho基因位于染色体13q12区域，全长约为50 kb，由5个外显子和4个内含子组成。该基因编码两种蛋白，一种为含有1 014个氨基酸的跨膜蛋白，其膜外段含有两个重复序列，与细菌、植物的β?葡萄糖苷酶存在20%～40 %的同源性，且含有一段lys?lys?arg?lys的碱性氨基酸序列，该处可被裂解,释放出小片段肽链进入体液循环发挥作用［12］；另一种为含有549个氨基酸的分泌性蛋白。klotho基因缺陷小鼠依赖乙酰胆碱的主动脉舒张功能较野生型明显下降，其内皮源性no较野生型生成减少［5，13］。在运用腺病毒将klotho基因转入具有多种动脉粥样硬化危险因素的大鼠后，可以增加内皮细胞no合成，且具有减轻动脉粥样硬化的作用［13］。kuwahara等［6］的研究发现klotho基因具有抗动脉粥样硬化作用，在抗氧化亚氮合酶（nos）抑制剂处理后，粥样硬化的进程减慢。研究发现［4］klotho基因缺失的老鼠血浆中1型纤溶酶原激活物抑制剂（pai?1）明显增高。pai?1的表达增加，引起血栓形成的几率也随之增加，这预示着klotho基因与血栓的形成存在密切联系。

klotho基因第四外显子c?1818t多态性t等位基因频率在韩国冠心病（cad）人群中为0.172［14］，本研究发现，冠心病中的uap患者为0.178（表2），两组结果相近。由此提示，在两国冠心病或uap人群中，t等位基因出现的频率相似。另外，rhee等［14］研究发现，t等位基因（包括ct，tt基因型）携带者冠心病患病率（47.1%)较cc基因型携带者（60.6%)低(p=0.036），特别是小于60岁的t等位基因（包括ct，tt基因型）携带者较cc基因型携带者的冠心病患病率低（p=0.025），他们认为c?1818t多态性cc基因型可能是早发冠心病的易感基因型。本研究发现，女性uap患者的tt基因型（p=0.049）及t等位基因（p=0.026）频率、非老年（＜60岁）uap患者tt基因型频率（p=0.017）均明显升高（表3，4）。经logistic回归分析后显示tt基因型与女性uap的发生存在相关性（表5）。由于在年龄<60岁的对照组中并没有发现tt基因型，所以tt基因型是否与年龄<60岁的uap存在相关性，尚不能定论。

综上所述，本研究结果提示，在中国苏皖地区汉族人群中，klotho基因c?1818t多态性tt基因型与女性uap的易感性有关，不管是否存在uap发病的其他危险因素，携带该基因型的女性有发生uap的潜在性；携带t等位基因的女性有发生uap的倾向，但只有同时存在uap发病的其他危险因素时才有发病的可能性。klotho基因广泛的生物学效应，决定了它不仅在调控衰老的过程中有着重要地位，而且与众多疾病，特别是冠心病及其特殊类型uap的发病有着密切联系。我们对klotho基因多态性与uap相关性的研究结果在国内外属首次报道，为uap患者的基因学研究和一级康复干预补充了实验室数据，为进一步阐明uap发生的遗传背景和机制提供了一些线索，进一步补充了冠状动脉疾病基因klotho单核苷酸多态性的数据库信息。当然，klotho基因第四外显子c?1818t多态性与uap的确切关系及具体机制还有待于深入研究。

近年来，有研究推测一些基因变异可以用来预测cad/acs，但所得结果很多不能够被重复。本研究与国外研究所得出的结论也不尽相同，分析其原因，首先，最大可能与被研究人群的地区和种族差异以及冠心病的类型不同有关。其次，研究对象不完全一致，比如，本研究对象为冠心病中的uap，而不是所有类型冠心病患者；再者，配对设计的方法不同和样本量偏小等原因也会引起研究结果的不一致。而且klotho基因变异对cad/uap的作用可能与环境因素和其他基因的交互作用有关。所以，虽然有些研究揭示klotho基因所表达的蛋白在调控动脉内皮细胞no和pai?1的生成、血管紧张素ⅱ介导的血管损害以及血栓形成、斑块破裂等方面起着重要作用，或该蛋白的代谢产物具有拮抗粥样硬化作用，但klotho基因多态性使动脉粥样斑块不稳定的机制尚不清楚。

本研究的局限性：(1)样本量相对较小，对统计学结果会产生一定影响；(2)对照组部分未行冠脉造影，仅以无胸痛和心电图正常等为排除uap的标准，其中可能有无症状性uap患者；(3)对于c?1818t多态性与冠状动脉狭窄严重程度和冠状动脉病变范围（支数）之间的关系未进行研究；(4)行冠脉造影者以冠状动脉主支无狭窄或狭窄直径小于50%为入选标准，而冠脉狭窄直径<50%者将来有可能进展为uap；(5)所入选的研究对象尚存活于世，存活偏倚不可避免，且未对c?1818t多态性与uap、患者生存率进行随访。因此klotho基因c?1818t多态性与uap的确切关系以及与uap预后、生存率的关系还有待于下一步的研究。

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基因多态性分析的意义范文第5篇

[关键词] 蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因；基因多态性；IVS6+G82A；妊娠期高血压疾病

[中图分类号] R714 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）06（b）-0041-03

[Abstract] Objective To investigate the polymorphism of protein tyrosine phosphatase 1B gene in patients with hypertensive disorder complicating pregnancy and to investigate its correlation with the disease of pregnancy induced hypertension. Methods 50 cases of patients from June 2013 to December 2015 with preeclampsia， pregnancy induced hypertension， normal pregnant women and normal physical examination personnel were selected as the research object， and the IVS6+G82A gene polymorphism of 1B gene was sequenced. Results Preeclampsia and gestational hypertension GG genotype（40.00%， 26.00%） and the G allele （62.00%， 46.00%） was significantly higher than in normal pregnancy （16.00%， 40.00%） as well as normal medical personnel [to the specific data] （14.00%， 38.00%）， P

[Key words] Protein tyrosine phosphatase 1B gene； Gene polymorphism； IVS6+G82A； Pregnancy induced hypertension

妊娠期高血压疾病是产科常见妊娠并发症，其诱发病因复杂繁多[1]。相关研究指出，其发生具有一定遗传倾向[2]。妊娠期高血压疾病的发生严重影响临床母婴妊娠结局。近年有关蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因与糖尿病及血脂异常等的相关研究较为广泛，对其与高血压的相关研究也有涉及，但其与妊娠期高血压疾病的相关性研究甚少。该文为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因多态性与妊娠期高血压疾病的关系，以便为临床妊娠期高血压疾病的预防以及治疗提供可靠依据和临床治疗思路，现从该院随机选取2013年6月―2015年12月期间收治入院的200例人员作为研究对象进行蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因的IVS6+G82A基因位点多态性研究，对照分析妊娠高血压疾病患者与正常人群之间的差异，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该次研究所选研究对象为该院近年来收治入院的50例子痫前期患者、50例妊娠期高血压患者、50例正常妊娠孕妇以及50例正常体检人员。入选患者以及正常人员资料来源于2013年6月―2015年12月。入选均为在该院随机数字法选取，均具有临床代表性。50例子痫前期患者年龄在20～41岁之间，平均年龄为（27.36±4.25）岁，孕周在22～40周之间，平均孕周为（37.11±2.63）周。50例妊娠期高血压患者年龄在23～46岁之间，平均年龄为（28.24±5.02）岁，孕周在25～40周之间，平均孕周为（38.04±3.20）周。50例正常妊娠孕妇年龄在23～44岁之间，平均年龄为（27.97±4.00）岁，孕周在26～40周之间，平均孕周为（37.52±4.58）周。50例正常体检人员年龄在19～47岁之间，平均年龄为（28.55±7.21）岁。入选人员在年龄、孕周以及体重指数等一般资料上差异无统计学意义（P>0.05），可进行对比分析。

1.2 临床纳入与排除标准

①入选患者均经临床确诊；②入选正常人员均未合并高血压且不存在高血压疾病家族史；③排除存在妊娠期糖尿病等其他妊娠期合并症的患者；④入选人员之间不存在血缘关系；⑤入选患者以及正常人员均签署知情同意书，均为自愿参与研究[3-5]。

1.3 研究方法

入选200例人员均抽取外周静脉的EDTA-K2抗凝血300ul备用，采用碘化钾法提取备用外周血细胞DNA。采用紫外分光光度法测定提取DNA的浓度。用限制性片段多态性PCR（PCR-RFLP）方法对IVS6+G82A多态性位点进行检测。将PCR产物纯化后限制性内切酶Hha I进行酶切，酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳30 min。仅显示301 bp为IVS6G+82A突变纯合型，显示187 bp和114 bp为IVS6G+82A野生型，显示301 bp、187 bp以及114 bp为IVS6G+82A突变杂合型。测序后选取三型样本进行正反向DNA测序进行结果验证。

1.4 观察指标

蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因IVS6+G82A基因位点多态性分布。

1.5 统计方法

采用SPSS 18.0统计学软件统计分析资料；其中计量资料用（x±s）表示，并用t检验；计数资料用χ2检验；P

2 结果

蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因IVS6+G82A基因位点多态性分布入选人员IVS6+G82A基因位点基因型以及等位基因频率见表1。

3 讨论

妊娠期高血压疾病是一种严重威胁母婴生命健康的妊娠期并发症，患者可出现多系统功能的紊乱现象，导致多种不良妊娠结局的发生。据相关报道显示[6]，妊娠期高血压疾病在我国患病率高达9.4%，子痫前期患者占到0.9%，极大程度上降低了孕产妇的生育质量。妊娠期高血压疾病的发生受到孕产妇年龄、营养状况、体重指数以及精神状态等多方面因素的复杂影响。近年来有关资料显示[7]，各型妊娠期高血压疾病的发生与基因位点突变具有一定相关性。其中盐皮质激素受体基因、血管紧张素原基因、降钙素基因以及内皮素1基因的突变均可诱发妊娠期高血压疾病的发生。相关研究指出[8]，在肥胖相关性高血压患者中，超质量高血压组患者蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因IVS6+G82A基因位点GG基因型的频率（33.89%）显著高于单纯高血压（9.27%）、超质量正常对照组（12.93%）以及正常对照组（18.00%），其等位基因（272）显著高于其他3组（132、101、140）。

该文为探讨妊娠期高血压疾病患者的蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因多态性与疾病发生的相关性，现从该院随机数字法分别选取子痫前期患者、妊娠期高血压患者、正常妊娠孕妇及正常体检人员各50例进行研究，子痫前期患者以及妊娠期高血压患者的IVS6+G82A基因位点GG基因型（40.00%、26.00%）和G等位基因频率（62.00%、46.00%）均显著升高。与临床相关高血压与蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因IVS6+G82A基因位点突变的研究存在较高的一致性。

综上所述，G等位基因频率的升高可在一定程度上增加妊娠期高血压疾病患病的危险性，是疾病发生的独立危险因素，妊娠早期加强对其筛查及早预防，可有效提升妊娠质量。

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