微生物研究方法
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微生物研究方法范文第1篇
[关键词] 水产品；微生物；检测技术
[中图分类号] R254.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）07-0116-02
Research progress of microbial test method of aquatic product of microorganisms in food
WANG Guoqin
Pingdingshan Center for Disease Control and Prevention in Henan Province， Pingdingshan 467000， China
[Abstract] This article in DNA and immunology as the foundation， from immune magnetic bead separation， using gene chip method， the traditional PCR technology and quantitative PCR technology aspects of microorganisms in aquatic products detecting way briefly elaborated.
[Key words] Aquatic products； Microbial； Detection technology
在水产品当中存在着大量的微生物，对人类的身体健康带来了很大的威胁，会引起腹泻、呕吐、败血症等一系列病症。微生物对水产品的影响是造成食品安全隐患的首要因素。现在对水产品微生物检测方向主要是对大肠杆菌、菌落总数和致病菌等研究[1]。传统的微生物检测方式以分离培养、血清试验和生化技术等为主，但是，面临的主要问题是资金使用大、人工劳动多、效率有待提高、特异性较弱等问题，没能从根本上解决水产品的质量安全，检测力度没有达到标准要求[2]。随着我国分子生物学技术的不断发展，整体的检测效率有了质的飞跃，主要有检测效率高、针对性强、准确性有保证等特点，在对水产品微生物检测方面有着很大的使用前景，并且具有很大的挖掘空间。本文对水产品中微生物的检测方法做一探讨。
1 水产品中微生物的检验方法
1.1 采用免疫磁珠的分离方式
之所以使用免疫磁珠的分离方式，是因为可以将特异性的抗体与磁性颗粒的表面进行关联，可以让样品中的微生物进行特异性的结合，通过外部磁场的影响，装有病毒的微生物磁性球会在其作用之下向两端靠拢，这样就可以使微生物从样品当中脱离出来[3]。
这种方法较普通检测方式而言，有着很明显的优势，可在含有大量细菌的溶液当中具有选择性的将微生物分离出来，并且具有较高的效率。与使用镜检技术和PCR等快速检测方式相互取长补短，免疫磁性分离技术可以将水产品微生物检测效率大大提高。例如：在创建免疫捕获-RT-PCR技术的过程中，即首先使用IgG抗体将甲型肝炎病毒吸收到标本之上，之后把该病毒的RNA通过逆转录形成cDNA[4]。使用PCR技术进行增长扩充，将传统核酸提取方式的步骤进行精简。这种方法体现出的优势在于更加灵敏，可以达到逆转录-PCR技术与打点杂交相结合的效果。把水产品当中的李斯特菌通过免疫磁性分离进行作用，以PCR技术为基础，可以产生具有独特效果的李斯特菌IMS-PCR技术，对水产品进行检测。通过使用该种技术进行检测，我们可以得到如下结论：该方法可以保证食品基质、杂菌和培养及成分不再对PCR检测带来严重性干扰，并且具有高敏感度、高效率和高准确性的特点。
1.2 采用基因芯片检测方式
所谓的基因芯片技术就是把每个基因寡核苷酸放在芯片的表面上，取得微生物样本的DNA，经过PCR扩增之后可以使用荧光标记探针，与芯片表面的寡核苷酸进行点杂交，最后使用精确的扫描仪进行定量并对荧光分布进行分析，最终确定被检测样品当中是否存在某种微生物[5]。基因芯片检测方式可以对微生物进行全面、高效和并行的检测。从数据角度分析，它可以对隐藏的病原体进行检测，使用一张芯片对某一种病原菌的各项指标进行检测，因此具有很好的效果。例如：经过混合之后的基因组可以准确地分辨出各种李斯特菌相关联的分离物，美国科学家经过分析，将单管复合体扩增与基因芯片技术对李斯特菌进行检测和分辨。使用固定、高效的措施对水产品中各种微生物进行获取、处理和分析是我们所期望的。现在，我国虽然在对样品的处理和相关基因芯片技术有了很大程度的提高，但是，使用基因芯片方式还需要对水产品中的微生物进行深入研究，而且要对外部标准化程序、资金、设备和条件等环境进行细致化建设，亟需对这一系列问题给予解决。总而言之，基因芯片技术还有着很大的发展空间。
1.3 采用传统的PCR技术
所谓的PCR技术，就是聚合酶链式反应，它是在上个世纪八十年代首先由美国科学家提出的，是一种可以在体外快速增长的特定基因，所以，又称之为基因体外扩增技术。该技术可以在试管中进行，经过数小时的培养，可以使很少的目标基因增长数十万倍，即把不易检测的皮克单位扩增到易于检测的微克单位，省去了克隆流程，缩减了大量的费时程序。现在，PCR技术已经具有对微生物病原的检测、分析、克隆、分离以及序列分析等功能，而且在水产品微生物检测当中也予以高度的重视。
例如：在辽宁近海地区，大量的海水样品以及贝类中具有甲型肝炎病毒，经过分析研究，使用石英粉滤柱法将水样品进行浓缩，同时使用PCR技术在附近海水中检测出RNA，最终结果表明，该部分海水中存在HAV污染，在此之后，使用抗原捕捉聚合酶链反应技术对辽宁周边沿海城市的水产品进行检测，结果为RNA阳性[6]。麻痹性贝毒是由甲藻类浮游生物分泌出的，对人体神经具有一定的麻痹作用，也是水产品中毒的主要元凶之一。可以通过建立PCR快速检测Alexandrium属和 A.minutum污染贻贝中的相关毒素类型方式，结果得出，PCR是一种对目标浮游生物进行有效深入的检测措施。
1.4 经过改进的PCR技术
新型的PCR技术与传统PCR技术具有相同的原理，但是在定量技术等方面原理有所不同。经过改进的PCR技术是使用荧光染料和探针来确保增长的特异性，而且荧光信号的强与弱直接影响增长产物的多少，以此来确保准确性[7]。采取实时荧光逆转录-PCR方法是在常规逆转录-PCR检测的基础之上使用荧光探针，摒弃了电泳的使用，而且不再使用具有致癌作用的溴化乙锭，这样保证了工作人员、研究人员以及环境的安全性。而且可以进行实时性检测，与其他方法（普通逆转录-PCR、电镜法）相比，更加敏感、特异，并且具有可观的速度。例如：根据副溶血性弧菌的基因为序列设计并合成具有一定特异性的引物和荧光标记探针时，使用定量-PCR技术对虾、鱼片等水产品进行检测，方法是在其中放入副溶血性弧菌，采用直接定量的方式检测出的低限是102 cfu/g。通过24 h的菌类扩增培养，低限可以达到2 cfu/g[8]。
在研究的初期，使用的扩增方式是多重嵌套，在软体动物当中取得DNA部分片段，以PCR增长之后的片段和DNA序列为基础，分析人类粪便中的隐贾第虫和孢子虫的检测结果，在贻贝的DNA中引入两者的基因片段，以此来完成对目标检测基因的建立，之后使用ABC-PCR检测方式，最终表明，这种方法对贝类中隐胞子虫和贾第虫具有很明显的检测效果。
2 结语
综上所述，对水产品中微生物进行安全性检测是极为重要的研究课题，并且更加趋近于实时、准确。通过微生物自身的遗传因子和免疫系统的特点来判断微生物数量的PCR技术、免疫技术和基因技术等都有着使用范围较广的价值，实时处理可以更加准确地进行预防和预报。PCR技术极大地提高了检测效果和灵敏度，但在实际操作当中还是会出现较多的假阳性现象。此外，在外部环境发生极大变化的时候，会产生相应的连锁反应，是灵敏度等优势下降的原因。而基因芯片技术弥补了相关不足，但是整体费用较高，所以，多种方式合理搭配，相信会找到行之有效的检测途径。
[参考文献]
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微生物研究方法范文第2篇
[关键词] 微生物限度；方法验证；回收率； 医院制剂；软膏
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）12-105-03
氯达软膏、利唑软膏、硫磺软膏作为梅县慢性病防治院常用的医生处方药，在临床被广泛应用，原质量标准无微生物限度检查方法学验证，为控制产品质量，确保安全用药，本文按照《中国药典》2010年版二部规定[1]进行微生物方法学验证。根据制剂抑菌活性的强弱和对不同菌种抑菌程度的大小选择适当的检查方法，加入5种验证试验菌株：枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球、白色念珠菌、黑曲霉菌于氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏中，对各试验菌的回收率进行验证，建立氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏细菌、霉菌及酵母菌检出方法；控制菌以加入2种验证试验菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行检出实验，建立氯达软膏、利唑软膏和硫磺软膏控制菌检查方法。
1 试药与仪器
1.1 试验样品
氯达软膏（批号分别为130629，130712，130718；利唑软膏（批号分别为13720，130625，130723），硫磺软膏（批号分别为130610，130615，130623）均由梅县慢性病防治院提供。
1.2 验证用仪器
电热恒温鼓风干燥箱、BSC-1300ⅡA2生物安全柜、DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温培养箱、HCB602H电子分析天平（0.01g）、ZW-808A微型智能集菌仪、一次性无菌过滤器、ZW-808D智能匀浆仪、卧式灭菌器、HH.Bll.500-电热恒温培养箱、SPX-150型生化培养箱等
1.3 试验菌株
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501-2a1]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003-5a]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102-3a]、白色念珠菌[CMCC（F）98001-3a]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104-2a]黑曲霉[CMCC（F）98003-1a]均由中国食品药品检定研究院提供，以上菌株传代次数均不超过5代。
1.4 验证用培养基及稀释剂
pH=7.0的氯化钠一蛋白胨缓冲液（批号：1112292）、营养肉汤培养基（批号：3101032）、营养琼脂培养基（批号：201112262）、改良马丁培养基（批号：3101466）、改良马丁琼脂培养基（批号：3101223）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：201112231）、胆盐乳糖培养基（批号：3101078）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：120315），溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：110223）均由北京三药科技开发公司或广东环凯微生物有限公司出品。其他试剂均为分析纯或化学纯。
2 方法与结果
2.1 菌液制备[1-12]
接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养温度（34±1）℃，培养24h，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养温度（25±1）℃，培养46h，将上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养温度（25±1）℃，培养6d，加入4mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
2.2 供试品溶液制备[1-12]
氯达软膏、利唑软膏供试液：取氯达软膏10.12g、利唑软膏9.95g，分别加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的二个三角瓶中，充分振摇使供试品溶解后，各加入45℃的pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100mL，振摇6min，静置使油水明显分层，取其水层，作为1∶10的供试液。
硫磺软膏供试液：取硫磺软膏5.05g，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，加入45℃ 的pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为120的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数验证[1-12]
试验组：取按“2.2”项下制备的供试品溶液1mL和试验菌液1mL按常规法：取供试液1mL注皿；培养基稀释法：取供试品溶液1mL注入10个平皿（0.1mL/皿）；离心法：取一定量的供试品溶液，以500 r/min离心5min，取上清液试验；薄膜过滤法：取供试品溶液1mL，采用薄膜过滤法，依法检查，以pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液为冲洗液。
菌液组：取1mL试验组中相同稀释级的菌悬液，同法测定其菌数，得出试验组中加入的菌数。每株试验菌平行制备2个平皿，计算平均菌落数。
供试品对照组：取与试验组同一供试品溶液和方法，不加菌液，测定样品本底菌。
稀释剂对照组：用pH=7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液替代供试品，加入试验菌，按试验组的方法测定其菌落数。
计算公式：
结果判断：稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%，若3次独立平行试验中试验组的菌数回收率均不低于70%，则说明可照该供试品溶液制备方法和计数方法测定该供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，则说明所采用的方法不可行，应改用其他方法（离心法、中和法、薄膜过滤法等）消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。验证试验结果见表1（表中薄膜过滤法：冲洗量为100mL×3次。）
上表试验结果表明，3个样品中的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌3个菌株回收率试验，氯达软膏、利唑软膏抑菌作用较强，需采用离心法+薄膜过滤法联用消除供试品的抑菌活性；而硫磺软膏则用培养基稀释法0.1mL/皿，回收率能达到70%以上；氯达软膏、利唑软膏白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验需用离心法+薄膜过滤法联用、硫磺软膏用培养基稀释法（0.1mL/皿）回收率才能达到70%以上。
2.4 控制菌检查法的验证
试验组： 取 “2.2”项下制备的供试品溶液10mL和50～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
阴性对照组： 除菌液为大肠埃希氏菌1mL（10～100cfu），方法同试验组。
上表试验结果表明，氯达软膏与利唑软膏因其抑菌作用较强，只能采用离心法+薄膜过滤法检查金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌；硫磺软膏用培养基稀释法检查金黄色葡萄球菌（200mL）及常规法检查铜绿假单胞菌。
3 讨论
上述细菌、霉菌及酵母菌计数验证及控制菌检查法的验证数据表明，3种医院外用软膏制剂均不能按常规法检查微生物限度， 抑菌作用较强的品种氯达软膏和利唑软膏需要采用离心法+薄膜过滤法进行微生物限度检查，而硫磺软膏则用培养基稀释法可进行微生物限度检查。
软膏剂供试品的制备一直比较繁琐，笔者采用中国药典规定非水溶性供试品的两种制备方法，发现平皿法测定供试品时，用药典规定的方法1更适合；方法2的十四烷酸异丙酯容易与一次性塑料培养皿发生反应，使培养皿表面变白，难以计数。因此，在2.2 供试品溶液制备中采用了两种供试品溶液制备方法。
采用药典规定非水溶性供试品的方法2时，如供试品难溶，可尝试用匀浆仪低速档混溶，在供试品的冲洗液中加入1%无菌聚山梨酯80[13]，可以明显减少薄膜上药物的残留，使计数更准确。
[参考文献]
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微生物研究方法范文第3篇
【关键词】
复方丹参片；微生物限度检查；方法学
复方丹参片属于中药复方制剂，临床用于心绞痛（冠心病）、高血压、颈椎病以及胸中憋闷等病症，处方中丹参和冰片两种中药材，均含有抑菌物质，对某些细菌的生长繁殖有一定的抑制作用，常规法和培养基稀释法不能有效检出该药品污染存活的细菌数量，结果不能准确反映该药品品种的微生物质量。根据《中国药典》2010 年版二部附录微生物限度检查法的规定[1]，参照近年来相关文献[2]，本文对该品种的微生物限度检查方法进行了方法学研究，通过研究，采用薄膜过滤法，可以消除药品中抑菌成分的干扰，准确检出药品中污染存活的细菌数量。
1仪器与材料
1.1仪器LS-B50L 立式灭菌锅；JJ200 电子天平；JT-B电动匀浆仪；MJX-250B-Z霉菌培养箱；SPX-250B-Z 生化培养箱；ZSD-A1160 生化培养箱；格兰仕微波炉；BJ-2 cD净化工作台；AC2-4S1 ESCO生物安全柜。
1.2培养基营养琼脂培养基 批号： 100408；玫瑰红钠培养基 批号：100921；营养肉汤培养基 批号：110406；胆盐乳糖增菌液 批号：110121；MUG培养基 批号：111012；pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液 批号：100603；曙红亚甲蓝琼脂培养基 批号：1011222生产单位：北京三药科技开发公司。
1.3验证用菌种大肠埃希菌[CMCC（B）44102]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉菌[CMCC（F）98003]来源：中国食品药品检定研究院。
1.4菌液制备取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物0.1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10.-4～10.-6约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物0.1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10.-4～10.-6约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3 ml，洗下霉菌孢子，取0.1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10.-5～10.-7约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。
2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.1供试液制备取本品10 g 置锥形瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，以4000转/分开机1分，即为1：10的供试液。
2.2回收率测定
2.2.1供试品对照组①培养基稀释法：取1∶10的供试液2份，每份1 ml分别注入5个平皿中，倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基各约15 ml，点计菌落数。②薄膜过滤法：取供试液1 ml过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次，每次100 ml，取出滤膜菌面朝上贴于营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，测定供试品本底的菌数。结果见表1。
2.2.2试验组取供试液1 ml按供试品对照组同法操作，同时加入50～100 cfu相应试验菌1 ml，置规定温度培养，观察结果并计数，结果见表1。
2.2.3菌液组分别取菌液1 ml，注入平皿中倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察结果，测定所加入的试验菌数，结果见表1 。
微生物研究方法范文第4篇
目的：建立陈香露白露片微生物限度检查方法。方法：根据该样品的微生物限度标准，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，用委托厂家3个批号的陈香露白露片进行验证试验，以考察确定陈香露白露片微生物限度的检查方法。首先用常规法进行预试验，初步考察该样品对试验菌检测的影响，然后根据预试验结果，用离心沉淀集菌法进行再试验。结果：常规法试验时，大肠埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率小于70%，控制菌检查检出试验菌。采用离心沉淀集菌法试验时，可以有效消除抑菌作用，使金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率大于70%。结论：采用离心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，简便、准确。
【关键词】 微生物限度检查 验证试验 离心沉淀集菌法
Validation of Microbial Limit Test for Chenxianglubailu Tablets
YIN Chunrong， SUN Ping， XIAO Juli
（The Institute of Food and Drug Control， Yunnan Chuxiong 675000， China; Yunnan Longfa Pharmaceutical Limited Company， Yunnan Chuxiong 675000， China）
［Abstract］ Objective: To establish a microbial limit test method for Chenxianglubailu tablets. Methods: The microbial limit test for Chenxianglubailu tablets was studied according to the guidance of the microbial limit standard for this product and the principle of the validation of microbiological test in “Chinese Pharmacopoeia” (2005)， and tested in three batches of Chenxianglubailu tablets. The test was conducted with routine and centrifugal precipitation methods. Results: When doing routine test the rate of recovery of escherichia coli and candida albicans was over 70%， but the rate of recovery of staphylococcus aureus and bacillus subtilis was below 70%. Test organism was obtained by controlled bacteria detection test. The results showed that centrifugal precipitation test could eliminate bacteriostasis effectively. Conclusions: Centrifugal precipitation test could eliminate bacteriostasis effectively and the test was simple and accurate.
［Key words］ Microbial limit test; Verification test; Centrifugal precipitation methods
陈香露白露片是一复方中成药制剂，由川木香、大黄、石菖蒲、陈皮、甘草、次硝酸铋、氧化镁、碳酸氢钠组成，用于胃溃疡、糜烂性胃炎、胃酸过多等疾病［1］。《中国药典》2005年版规定，在进行药品微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。为此，笔者对陈香露白露片的微生物限度检查方法进行了验证试验。
1 试验材料
1.1 样品
陈香露白露片（云南龙发制药有限公司；规格：100片/瓶；批号：060401、060402、060403）。
1.2 稀释剂及培养基
pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、TTC营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基。
1.3 菌种
金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，均来源于云南省食品药品检验所。
2 验证试验
2.1 试验菌液的制备
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35 ℃培养18～24 h，分别取上述培养物 1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液 9 mL，10倍递增稀释，取稀释液1 mL，加入到1个平皿中，每种菌的每1个稀释级平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养24～48 h，计数，选择每1 mL含菌数为50～100 cfu的稀释级菌悬液，作为验证试验用菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置23～28 ℃培养24～48 h，取上述培养物1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，10倍递增稀释，取稀释液1 mL，加入到1个平皿中，每1个稀释级平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数，选择每毫升含菌数为50～100 cfu的稀释级菌悬液，作为验证试验用菌悬液。
2.2 供试液的制备
从两瓶样品中取样品10 g，至灭菌匀浆杯中，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，经匀浆仪混匀，制成1∶10的供试液。陈香露白露片3个批号样品同法操作。
2.3 细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法的验证
2.3.1 预试验（常规法）
（1）试验组：取1∶10的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿；取1∶100的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿；取1∶1 000的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。含大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；白色念珠菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。
（2）菌液组：分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到1个平皿中，每种菌平行制备2个平皿。含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；白色念珠菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。
（3）供试品对照组：取1∶10供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。取1∶100供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。取1∶1 000的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。每一稀释级中的2个平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；每一稀释级中的另2个平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。
（4）试验组菌回收率计算：菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）∕菌液组平均菌落数。
（5）结果：见表1。大肠埃希菌、白色念珠菌在样品的1∶10、1∶100、1∶1 000供试液中回收率均大于70%；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在样品的1∶1 000供试液中回收率均大于70%，在样品的1∶10、1∶100供试液中回收率均小于70%。根据上述情况，笔者采用离心沉淀集菌法进行再试验。
表1 陈香露白露片的细菌数、霉菌及酵母菌数常规方法的验证预试验结果（略）
2.3.2 再试验（离心沉淀集菌法）
（1）试验组：从100 mL的1∶10供试液中取上清液10 mL，3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，留底部集菌液约2 mL，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液补至10 mL，混匀。取其1 mL加入到1个平皿中，同法制备4个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。另取其1 mL，加入到9 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液中，混匀，即为1∶100供试液。取1∶100供试液1 mL加入到1个平皿中，同法制备4个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液l mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。在制备好的平皿中倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数。
（2）菌液组：分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到1个平皿中，每种菌平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数。
（3）供试品对照组：取1∶10供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备2个平皿。取1∶100供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备2个平皿。同法制备4个平皿。倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数。
（4）试验组菌回收率计算：菌回收率（%）=（试验组平均菌落数﹣供试品对照组平均菌落数）∕菌液组平均菌落数
（5）结果：见表2。采用离心沉淀集菌法后，可去除供试液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。
表2 陈香露白露片的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌离心沉淀集菌法的验证试验结果（略）
2.4 控制菌检查方法的验证
2.4.1 大肠埃希菌检查方法的验证
（1）试验组：取1∶10供试液10 mL和大肠埃希菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到胆盐乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠埃希菌检查法进行检查。
（2）阴性对照组：取1∶10供试液10 mL和金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到胆盐乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠埃希菌检查法进行检查。
（3）供试品对照组：取1∶10供试液10 mL，加入到胆盐乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠埃希菌检查法进行检查。
（4）结果：试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组结果为阴性，供试品对照组未检出大肠埃希菌。
2.4.2 大肠菌群检查方法的验证
（1）试验组：取1∶10、1∶100、1∶1 000供试液各1 mL和大肠埃希菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支胆盐乳糖发酵培养液中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法中的大肠菌群检查法进行检查。
（2）阴性对照组：取1∶10、1∶100、1∶1 000供试液各1 mL和金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支胆盐乳糖发酵培养液中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005版一部附录微生物限度检查法中的大肠菌群检查法进行检查。
（3）供试品对照组：取1∶10、1∶100、1∶1 000供试液各1 mL，加入到3支胆盐乳糖发酵培养液中，置35～37 ℃培养18～24 h，按《中国药典》2005版一部附录微生物限度检查法中的大肠菌群检查法进行检查。
（4）结果：试验组检出大肠菌群，阴性菌对照组结果为阴性，供试品对照组未检出大肠菌群。
3 讨论
采用常规法试验时，该样品对大肠埃希菌、白色念珠菌的加菌回收率均大于70%，证明其对上述2种供试菌无抑菌作用。该样品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，在1∶10、1∶100的稀释级，其加菌回收率小于70%，低于《中国药典》2005年版规定的回收率不得低于70%才视为无抑菌作用的要求。结合该样品的物理特性和常规法试验结果，采用离心沉淀集菌法进行试验后，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的加菌回收率可大于70%。故陈香露白露片的细菌数检查可采用离心沉淀集菌法，霉菌及酵母菌数的检查采用常规法。
由控制菌检查方法的验证试验结果表明，采用常规法试验时，该样品对大肠埃希菌、大肠菌群的检查无干扰，故陈香露白露片的控制菌检查可采用常规法。
因安全原因，黑曲霉［CMCC（F）98003］的验证试验未进行。
微生物研究方法范文第5篇
【关键词】发散思维 生物教学 对策
【中图分类号】G633.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）10-0176-02
发散思维在生物教学中合理的运用能够激发学生学习生物的积极性和主动性，提高中学生物教学质量。教师在教学中要采取相应措施激发学生的学习兴趣，培养学生发散性思维能力的发展。学生发散思维是在教师合理引导性和教育下进行的，因此，教师要构建和谐的课堂氛围，还要对学生进行知识讲解，与学生一起进行讨论学习，培养学生良好的学习习惯和学习行为，让学生在学习中自由的进行探索，提高自己对生物的认知能力，拓展自己的思维能力，从根本上促进中学生物教学质量的提高。
1.发散思维的内涵及特点
1.1发散思维的内涵
发散思维是美国心理学家J.P.吉尔福特提出的，也称为扩散性思维。是指在考虑和解决问题中通过自己对问题的分析、判断，不受外界各种因素的干扰，最终达到解决问题目的的思维方式。发散思维在中学教育中非常重要，中学阶段也是学生思维能力比较活跃的阶段，教师通过对学生合理的引导和教育，能够激发学生对问题的想象，拓展自己思维能力的培养，提高自己在学习中解决问题的能力。
1.2发散思维的特点
发散思维具有以下几个方面的特征：第一，流畅性。主要是指学生面对问题时能够流畅的发挥自己的想象力，不受到其它因素的干扰，拓展自己的思维空间，对问题进行有效的探究。第二，变通性。发散思维与一般的思维有很大的不同，要求在对问题的思考中进行有效的变通，对问题举一反三，思考到一般人不能思考的领域。第三，独特性。发散思维与一般思维的区别就是发散思维在对问题思考中能够发现一般人发现不了的地方，能够对问题进行深入本质的思考。教师在对学生教育过程中要激发学生对发散思维的培养，提高学生的思维能力。
2.提高学生发散性思维培养的教学探索
2.1加强实验教学，培养学生的发散性思维
生物教学与一般科目教学的差别就在于生物教学的实验课程比较多，这就要求学生不仅要有课堂分析能力，而且要有动手能力，互相结合才能拓展学生学习生物的兴趣，激发学生对生物的思维动力。中学生物教师在教学过程中要对学生进行引导，让学生自己参与实验，增加动手能力，这样学生对实验过程中遇到的问题就会积极的思考，从而能够激发学生思维能力的培养。
2.2加强引导，充分发挥学生的创造潜能
中学生物教学离不开教师的引导，特别是在实验教学过程中加强教师引导更加能够促进学生发散思维能力的培养。比如在实验教学中让学生对实验进行自主设计、自己动手，分析结果。教师只是对实验遇到的问题进行有效的引导，对学生的思考进行启发，这样学生在教师的启发下就能够对问题进行深入的思考，激发自己的思维能力，促进发散思维能力的提高。同时，对实验过程中产生的异常现象和结果要引导学生进行探究式分析，比如为什么会出现这样的结果，导致这些结果产生的原因是什么，这些结果与日常生活有没有必然的联系等等。这些都能够提高学生的发散思维能力。
2.3 教师要提高自身的专业知识
专业的生物知识文化是教师吸引学生学习兴趣，促进思维能力发展的重要因素之一。教师的专业水平和教学效果能够给学生带来积极的影响。因此，教师不仅要具备基本的教学专业知识，而且在教学过程中要运用心理学的教学方法不断提高学生学习生物的心理素质和综合能力。用心理理论与教学相关方法来指导对自己的教学实践。因为学生在学习过程中不仅受自身学习能力的影响，而且受到心理因素的影响，所以，教师要对不同的学生进行不同的教学。教师只有调动学生学习生物各个方面的积极性和主动性，增加学生的心理素质，中学学生才能够在教师的指导下进行有效的学习，促进自己发散思维能力的培养。
发散思维在生物教学中合理的运用能够激发学生学习生物的积极性和主动性，提高中学生物教学质量。教师在教学中要采取相应措施激发学生的学习兴趣，培养学生发散性思维能力的发展。在教学实际中教师要加强实验教学，培养学生的发散性思维；加强引导，充分发挥学生的创造潜能；教师要构建和谐的课堂氛围，还要对学生进行知识讲解，与学生一起进行讨论学习，培养学生良好的学习习惯和学习行为，让学生在学习中自由的进行探索，提高自己对生物的认知能力，拓展自己的思维能力，从根本上促进中学生物教学质量的提高。
参考文献：
[1]卢文祥.新课程理念与初中生物课程改革[M].长春：东北师范大学出版社，2010
