细胞的生物学特性

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细胞的生物学特性范文第1篇

【关键词】 红斑狼疮；系统性；骨髓间充质干细胞；生物学特性

骨髓间充质干细胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潜能，并具有支持造血和免疫负调节作用［1］。大量的体外细胞培养实验［2,3］证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治疗中具有较广阔的应用前景。了解SLE患者自身MSC是否异常是判断选择自体或异体MSC移植治疗SLE的重要依据。SLE患者MSC的体外扩增及其生物学特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面。

1 资料与方法

1.1 一般资料 9例SLE患者均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准，SLE疾病活动评分(SLEDAI)判断疾病的活动程度。9例患者的资料见表1。另选5例性别、年龄匹配的健康者作为对照组。

1.2 骨髓MSC分离培养 采用羟基淀粉沉淀联合Ficoll 密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养MSC。具体方法无菌操作下抽取骨髓液 10 ml，以 5×105 U/ml 肝素钠抗凝，先用羟基淀粉按1∶4体积加入，静置20 min，通过自然沉降去除下沉的大量红细胞，剩余的含大量红细胞的下层液体，再用淋巴细胞分离FicollHypaque常规分离单个核细胞。将上述两步分离所得的骨髓单个核细胞充分混匀，悬浮于体积分数为10％的 胎牛血清DMEMLG 培养液中，按约1×106/ml密度接种于25 cm2培养瓶， 置 37 ℃、体积分数为5％的 CO2饱和湿度的培养箱中。当显微镜下观察细胞已达90%融合时，则可传代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美国)消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于完全培养液中，按104/cm2的密度接种于新的培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，每3~4天更换1次培养液，约1周待细胞生长密度达90%左右时，进行再次传代。

1.3 MTT法检测MSC的生长情况 MTT比色法检测SLE患者第2代MSC的生长情况，作传代细胞培养的生长曲线分析。

1.4 流式细胞术检测MSC表面分子的表达 细胞培养扩增到第三代时，分别取100 ul细胞悬液与鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗体室温反应30 min。流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 MSC的传代情况及形态

本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC体外培养。5例健康对照者MSC 均能成功体外扩增。9例患者中，5例MSC能传代扩增，传代率为55.6%。其中女性4例，男性1例，年龄16~26岁，平均年龄21.8岁；病程3~24月，平均病程9.8月；DAI评分为15~21， 平均评分为18.6。5例SLE患者均合并有肾损害，其中1例合并有血液系统损害。MSC体外扩增不成功的4例SLE患者，均为女性，年龄26~45岁，平均年龄38.2岁；病程6~60月，平均病程37.5月；DAI评分为1322， 平均评分为18.5。4例SLE患者均合并有肾损害，其中2例合并有严重血液系统损害。每例患者的临床资料及MSC体外培养基本情况见表1。

2.1.1 体外扩增成功者 5例MSC体外扩增成功的SLE患者，MSC生长情况与健康对照组相比较：原代培养时，细胞形态上与健康对照组相似，但纺锤形、梭形细胞的出现稍晚，一般于2~4 d，健康对照组的一般出现于1~2 d内；随后逐渐见集落形成，原代培养的时间平均为(14.2±1.45)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，细胞呈长梭形旋涡样生长；传代后细胞生长较旺盛，平均传代时间(5.8±0.44)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。消化传代的细胞于24 h内完全贴壁，形态与健康对照组相似。

2.1.2 体外扩增不成功者 MSC生长情况与健康对照组相比较：同等骨髓量分离得到的单个核细胞数量与健康对照组相比明显减少，且贴壁的纺锤形、梭形细胞的出现时间明显较晚，一般于6~7 d，且仅零星分布，不成集落生长，随着培养时间的延长，其中2例可见细胞少量扩增，培养至第15天，约见20％~30％融合的短梭形细胞生长(图3)，至第30天，细胞基本自行凋亡；另2例至第18天，见部分长梭形细胞零星分布，融合少于10％，至第30天细胞基本自行凋亡。

2.2 MSC表面分子的表达

流式细胞术检测BMMSC细胞表面抗原，结果显示体外扩增成功的SLE患者BMMSC均高表达CD29、CD44，而不表达CD34、CD45，第3代BMMSC纯度达95%以上，且各表面标志的表达与健康对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 MSC的生长情况

SLE患者第2代MSC生长趋势与健康对照组相似，第3~4天生长活跃，第4天后生长渐缓，第56进入生长平台期。

3 讨论

MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一群干细胞，体外培养易纯化、扩增迅速，具有支持造血、免疫调节和诱导免疫耐受的作用。本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC的体外培养。健康对照者MSC 均能成功体外扩增。9例SLE患者中，5例可以传代扩增，传代率为55.6%。有4例SLE患者MSC不能成功传代扩增，说明部分SLE患者MSC存在缺陷。另一方面，我们发现能成功传代的5例SLE患者MSC无论是从细胞形态、原代培养所需时间、平均传代时间及表面特异性分子表达均与健康对照组无明显差异，所培养、扩增的细胞能达到临床应用的要求。提示这部分SLE患者MSC生物学特性基本正常。

对两组扩增情况不同的SLE患者的临床资料进行比较，我们发现未能成功体外扩增的SLE患者具有如下的临床特征：①年龄较大。②病程较长。③合并有较严重的血液系统损害。④长期大剂量应用免疫抑制剂。

大量实验发现，MSC的生物学特性与年龄密切相关。骨髓中MSC的含量、质量以及细胞活性随着年龄的增长而下降［4,5］。骨髓中MSC的克隆数随着年龄的增长而逐渐减少，且BMMSC分泌SCF、FLT3L、IL6、TGFβ1及SDF1等与自我更新密切相关的细胞因子的能力逐渐下降，导致BMMSC的增殖能力逐渐减弱。另外，也有研究者指出［6］，病情较重的SLE患者，从骨髓中可提取的单个核细胞数原本就较少，所含MSC就更少。然而SLE病情轻重、病程长短及不同药物治疗是否会影响SLE患者MSC的体外扩增、生物学特性及功能，目前尚未能明确。

我们实验说明SLE患者MSC存在一定的异质性，因此应用MSC治疗SLE前，了解患者自身MSC是否存在缺陷是必需的。如果患者MSC本身存在缺陷，为避免治疗失败或复发，异体MSC输注为首选；如果MSC本身基本正常，自体MSC输注将是有效的。SLE患者MSC的体外扩增及其生长特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面，为SLE患者MSC移植的治疗方法提供了理论依据。

参 考 文 献

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细胞的生物学特性范文第2篇

【关键词】 甲状腺干细胞； 甲状腺肿瘤干细胞； 状癌； 未分化甲状腺癌； 致瘤性

甲状腺癌是临床上最常见的内分泌恶性疾病，也是内分泌肿瘤中最常见的死亡原因。近年来其全球发病率一直处于上升阶段，尽管越来越多的新技术已经应用到临床的诊断和治疗中，但随着对其分子学发病机制的深入研究，分子靶向治疗将会是未来诊断和治疗甲状腺癌的一个新方向。

在临床上甲状腺癌的病理类型主要包括状癌、滤泡状癌和未分化癌。其中大部分肿瘤都发生于内胚层起源的滤泡细胞，这是甲状腺组织中细胞数目最多的一部分。状癌和滤泡状癌分别占甲状腺肿瘤的80%～85%和10%～15%，这两种病理类型分化良好，在临床治疗上主要采取外科手术后化疗或放疗的治疗方法，预后良好[1]。与其相反，临床上罕见的未分化癌通常呈一个高侵袭性、进展迅速的恶性临床过程，因为这类肿瘤缺乏摄碘受体故对化疗或放疗不敏感，临床预后较差。目前临床上主要用紫杉醇治疗未分化癌，然而这也并不能有效地减弱它的恶袭能力，因此迫切地需要新的治疗手段。除了这些来源于滤泡细胞的肿瘤外，还有一种来源于滤泡旁C细胞分化的甲状腺髓样癌，发病率约为5%，临床治愈率极低，极易发生局部或远处转移，如肝、肺、骨骼和脑等，手术治疗后极易复发[2]。近期的研究发现在一些人类癌症中存在肿瘤干细胞，这改变了关于致瘤和肿瘤治疗策略上的一些观点[3]。目前已经有研究证明肿瘤是由一些非正常细胞驱动发生的，这些细胞叫做肿瘤干细胞，它们对启动和维持肿瘤生长起着十分关键的作用。这些肿瘤始动细胞已经在一些人类肿瘤中得到了证实，如乳腺癌和结肠癌[4-5]。最近又有新的研究证实在甲状腺癌中也存在肿瘤干细胞[6]。正因为如此，鉴别和认识这种具有致瘤作用的肿瘤干细胞，对寻找和发现更多靶向的、有选择性的和个体化的治疗甲状腺癌的方法极其重要。

1 甲状腺干细胞

研究发现甲状腺组织具有自我更新能力已经有很长一段时间了，然而直到最近才被认识到是因为存在成体干细胞才使它有这种自我更新能力。在成熟的甲状腺组织中存在甲状腺干细胞群是1992年被Dumont[7]证实的。他的实验是通过在小鼠模型内注入微小数量的这种细胞从而使甲状腺移植物在小鼠体内生长。这一发现又被Thomas在2006年得到更好地验证[8]。他在人甲状腺肿的甲状腺标本中检测到一群表达多能性的干细胞因子Oct-4，内胚层因子Gata-4和HNF4a，还有TTF和Pax8等因子的成体干细胞。不久，这一假设被Lan等[9]用实验证明。他从原代培养的甲状腺细胞中分离出甲状腺干细胞，而且在体外试验中证实了这种细胞有分化成甲状腺细胞的能力。已经有文献描述了几种类型的甲状腺干细胞：滤泡细胞的祖细胞起源于内胚层，C细胞的祖细胞起源于神经脊，还有一种是滤泡细胞和C细胞的共同祖细胞。这些不同类型的甲状腺干细胞都能通过基因突变而引发甲状腺肿瘤[10-11]。

传统的多级多阶段原因导致肿瘤发生的观点认为：甲状腺癌的发生是由于长期积累的甲状腺细胞基因组损伤，导致抑癌基因缺失或致癌基因激活从而发生肿瘤。根据这一观点，那么甲状腺细胞就能通过发生RAS和BRAF突变，或RET/PTC和Trk重排而发生状癌，也可以通过RAS基因点突变或PAX8/PPARγ重排而发生滤泡状癌。相反，未分化癌是通过分化型癌发生p53基因点突变而引起的[12]。

这种在分化型和未分化型肿瘤间发生基因组改变的多阶级致瘤假设的观点曾被Tallini质疑，因为他发现RET基因重排只发生在状癌而在未分化癌中没有发生[13]。另外，他们发现PAX8/PPARγ重排基因仅存在于滤泡状癌而在未分化癌从未被观察到[14]。最近的研究报道p53基因突变与未分化癌的高侵袭性密切相关，但是在其他类型的肿瘤中也有发现这一突变，甚至也发生在滤泡状癌中[12]。

以上这些发现说明如果按照这个多级致瘤假设理论分析甲状腺癌形成，那么就还有一些基因突变后的问题不能被解释。因此，近期又有一些研究提出了关于甲状腺肿瘤成因的另一个不同的观点：胎儿干细胞致癌假设理论。这一观点是根据肿瘤细胞是来源于胎儿甲状腺细胞的残留物，而且它有自我更新的能力，而不是来源于分化好的细胞。滤泡状癌、状癌和未分化癌被认为分别由前甲状腺细胞，甲状腺原始细胞和甲状腺干细胞的残留物产生而来。基因组的改变，包括RET/PTC和PAX8-PPARγ重排，以及BRAF基因突变都会影响胎儿甲状腺细胞分化而促进其增殖。尽管甲状腺干细胞代表着未分化癌的起源，但是它们也能促使前甲状腺细胞和甲状腺原始细胞产生。当甲状腺干细胞自己增殖时就会产生未分化癌，当其促使前甲状腺细胞和甲状腺原始细胞产生时，增殖的结果是产生分化型甲状腺癌。

2 甲状腺肿瘤干细胞在甲状腺癌形成作用中的新观点

这种由肿瘤干细胞产生甲状腺癌的观点很早以前就由几个学者提出过[11-12]。然而直到最近发现甲状腺肿瘤干细胞的存在才被证实[6]。

在甲状腺肿瘤的研究中发现了肿瘤干细胞，最主要是因为发现了能鉴别这种细胞的相关分子标记。例如有研究已经发现CD133是一个能在未分化细胞系中识别干细胞群的分子标记[15]。2010年Todaro的研究数据表明并不是所有的上皮样甲状腺癌标本的肿瘤干细胞中都能发现CD133[6]。相反，有研究发现醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase1 ALDH1）活性增加与乳腺癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤和肺癌的原发细胞有关[16-19]。

通过ALDEFLUOR试验在细胞分选过程中简单而精确地分析了有ALDH酶活性的甲状腺细胞的数量，结果表明三种不同组织学类型的甲状腺癌中未分化癌含有高表达ALDH的细胞比例最高，也许这与它的高恶性程度有关。同时，未分化癌中这种高表达ALDH的细胞与其他正常组织比具有更高的增殖能力，或者说自我更新能力。为了分析未分化癌中这种细胞是否保持有启动肿瘤生长的能力和了解其肿瘤的临床或病理学特点，例如其高侵袭性等，从状癌、滤泡状癌和未分化癌中分离出高表达ALDH的细胞，然后将其注入免疫功能不全的小鼠模型中。结果显示：在甲状腺状癌的小鼠模型中注入了高表达ALDH的细胞后发现肿瘤只在局部生长，而在甲状腺滤泡状癌的小鼠模型中注入了高表达ALDH的细胞后发现肿瘤渗透生长并压迫局部组织，例如压迫喉和气管。此外，在活体的未分化癌患者的全身影像学分析发现这种由高表达ALDH的细胞导致的肿瘤有一个高发的肺转移率。与相应的亲代肿瘤相比，移植后肿瘤的ALDH1、肌酸激酶19、甲状腺球蛋白的表达和肿瘤细胞数目都没有明显的变化，这就说明移植后的甲状腺肿瘤保持着与亲代肿瘤一样的恶性程度。

要描述这种甲状腺移植瘤的生长特性包括：能导致肿瘤生长和侵袭的特定的基因型改变，肿瘤生长的方式和有利于前期临床的靶向治疗方法。在对甲状腺肿瘤干细胞的基因转录程序的研究中发现：肿瘤干细胞潜在的致瘤性和高侵袭性与Met/Akt信号通路有关[6]。事实上，Todaro的研究已经发现如果激活Met、Akt和β连环蛋白，并且下调E钙黏蛋白就能导致一个发生肿瘤的表型，这也是形成未分化癌干细胞的主要因素。有趣的是，如果沉默Met或Akt能抑制描述上皮间质转化的两个关键转录因子Twist和Snail的表达，同时减弱未分化癌干细胞的转移和侵袭能力。这个关于Met/Akt信号能减弱甲状腺癌侵袭能力的观点在体内试验也得到了证实。将沉默了Met和Akt的未分化癌细胞转入小鼠的甲状腺组织中，之后用光子成像分析检测发现沉默Met和Akt能将甲状腺肿瘤干细胞的潜在侵袭能力基本彻底消除[6]。

其他许多团队则致力于研究激活PI3K/Akt信号通路是否能影响甲状腺癌的发生和进展，或潜在的治疗靶点。早在2009年国内就有研究者发现用特异的Akt信号抑制剂（哌立福辛）能阻断甲状腺癌细胞的增殖并促进其凋亡，这是通过激活PI3K/Akt信号通路并改变其基因型而实现的。西罗莫司类药物，是参与甲状腺细胞增殖调控过程中的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶物质，与Akt信号抑制剂一样起着肯定的治疗肿瘤的作用[20]。

3 甲状腺癌治疗中的新策略

临床上治疗甲状腺癌的方法在最近二十年内都保持不变：状癌或滤泡状癌患者在外科手术后再接受一定剂量的放射碘治疗，用以破坏手术不能完全清除的少量癌细胞。另外，未分化癌的恶性程度很高，临床预后很差，这种肿瘤生长迅速，局部浸润易发，而且对放疗或化疗的效果很差，主要是因为缺乏摄碘受体[6]。

随着对甲状腺肿瘤发病机理的深入研究，人们可能会发现更多的新方法来治疗这些目前疗效不满意的肿瘤。之前已经有文献报道，甲状腺癌对化疗诱导的细胞程序性死亡方法抵抗就可能跟自分泌白介素4和白介素10有关，而这个过程是通过上调抗凋亡分子cFLIP，Bcl-xL和PED实现的[21-22]。随后，又有学者发现在未分化癌中，残留细胞的增殖能力和对死亡的耐受程度似乎与细胞因子信号抑制基因（suppressors cytokine signaling SOCS）的表达有关，它是通过下调Akt信号而影响Bcl-2家族蛋白的表达。在体内和体外试验中发现外源性表达SOCS-3和SOCS-5能减弱肿瘤的生长并明显提高化疗的效果，这是通过改变细胞凋亡和抗凋亡分子间的平衡而实现的。这些结果就说明SOCS调控细胞因子程序凋亡可能会是治疗高度恶性甲状腺癌过程中克服其抵抗化疗问题的一个新策略[23]。

甲状腺肿瘤干细胞是研究领域中一个惊喜的发现，它将为甲状腺癌的诊断和治疗提供很多重要的新线索。如果肿瘤干细胞有无限的自我更新和分化能力，那么这将是化疗中要克服的最主要的问题。目前治疗甲状腺癌的方法（手术、放疗、化疗）都能迅速杀灭已分化的癌细胞，但仍有少数静止的潜在肿瘤细胞被存留下来。最理想的治疗方法应是在杀灭已分化细胞的同时也要将潜在突变的肿瘤干细胞破坏掉。

尽管这种针对肿瘤干细胞的理想药物似乎很令人兴奋，但它也不是这么容易实现。肿瘤干细胞能通过多种机制逃避药物诱导的细胞死亡信号，包括上调ATP结合转运蛋白，激活DNA的修复能力和过表达抗凋亡分子。关于这点，鉴别甲状腺肿瘤始动细胞能够为在肿瘤干细胞的自我更新和化疗药物抵抗方面的研究中提供强有力的工具去更好地了解特殊基因和信号转导通路，例如Wnt/β连环蛋白通路。未分化甲状腺癌中激活这条通路似乎与抗肿瘤药的疗效有关，如单用选择性络氨酸激酶抑制剂（甲磺酸伊玛替尼）治疗就无效，尽管它是以β连环蛋白为靶分子，而且能够降低甲状腺肿瘤细胞的侵袭和增殖能力[15]。

有几种药物已经在试验中被研究。他们包括络氨酸激酶抑制剂，如和RET/PTC或RET信号通路有关的吡唑嘧啶PP2和Wnt/β连环蛋白通路有关的伊马替尼，还有激活PPARγ信号的噻唑烷二酮类等[24-27]。将来的挑战就是要发现新的特异的抑制剂去对抗最新在甲状腺状癌中发现的致癌基因BRAF和未分化癌中PI3K的激活[28-29]。关于高侵袭性的甲状腺髓样癌，最新的研究发现在体内或体外试验中有针对RET和FGF受体的特殊药物能抑制肿瘤的生长，这就说明有联合基因和药理学方法对治疗起有效作用[2]。

4 展望

本文着重叙述了甲状腺肿瘤干细胞研究中的一些最新发现和成果，特别是未来治疗策略上存在的一些新挑战。全面而深刻地描述肿瘤始动细胞将有助于了解其在肿瘤发生中的潜在作用，也能明确目前抗肿瘤药物治疗中存在抵抗性或耐药性的一些可能机制。此外，这些细胞也能用于构造动物试验模型来进行活体内研究介导甲状腺肿瘤发生的分子事件，以及更好地研究和发现个体化治疗甲状腺癌的方案或敏感药物，这对于高恶性和高侵袭性的肿瘤来说极为重要。

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细胞的生物学特性范文第3篇

原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNA复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织异性表达。目前的研究表明， Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。

1 Livin基因及蛋白结构功能的多样性

IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是N端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列结构域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一个环指结构域(RING finger domain，RING)。目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP，XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(MLIAP/KIAP)［2］。

Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列(BIR或RING)寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。Kasof等［3］在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。Lin等［4］从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP（kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP）。Vucic等［5］发现Livin基因在G361 和 SKMel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等［6］发现了该基因存在2个剪接变异体（isoforms），分别命名为Livin α和Livin β。 同时，Lin等［4］用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体20q13.3区域，全长4.6 kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约2.2，2.8和4.0 kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含4个α螺旋和一个三股抗平行 β片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RING环指结构［4，6］，氨基酸残基C124，C127，H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。

Livin蛋白有α和β两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5′端54 bp的基因序列编码。Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等［3］认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白 C末端的RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3′端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体RNA有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin 蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。

2 Livin基因在NSCLC中的表达

Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义［2，7］。Tanabe等［7］采用 RTPCR法对15例正常肺组织和38例NSCLC组织作对比研究，发现Livin mRNA在NSCLC组织阳性率为73.6%，正常肺组织阳性率为6.7%，显示Livin基因在NSCLC中呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC中的表达并不相关。CrnkovicMertens 等［1，8］同时采用NSCLC组织和NSCLC源 HeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livin α和Livin β的表达，结果显示Livin α和Livin β在NSCLC中呈高表达。采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livin β和Livin α基因的功能意义不完全相同， Livin β在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等［9］采用RTPCR法检测NSCLC组织中Livin α mRNA和Livin β mRNA的表达，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为71.1％，两种异构体基本同时表达，Livin β mRNA的表达量略高于Livin α mRNA。而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为5.7％和6.7％。而且Livin mRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。陈淼等［10］采用免疫组织化学(SABC)的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为45.5﹪和50.0﹪，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度NSCLC组织之间Livin蛋白的表达无显著性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为72.7﹪和11.1﹪，两组的显著性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等［11］ 的研究结果显示，48例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为22.9%，其表达与NSCLC组织学类型相关，腺癌中Livin mRNA表达阳性率达45.5%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin 蛋白表达与mRNA表达相一致。研究还发现放、化疗后NSCLC组织中的Livin表达的阳性率为43.5%，显著高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表达，这可能与临床上NSCLC对化疗药物和放疗耐受有关。

目前，Livin基因在NSCLC组织异性地高表达的现象已引起许多学者的关注［12］，但Livin mRNA的表达与NSCLC患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC的分子标志物，成为诊断和治疗NSCLC新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。

3 Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制

Kasof等［3，8］研究显示，Livin蛋白N端的羧基与Caspase3，7，9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由FADD（Fasassociated protein with death domain），Bax，RIP，RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。Vucic等［13］将Livin基因转染乳腺癌MCF7细胞，证实转染细胞对Fas，TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1），DR4（death receptor 4）及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）诱导的细胞凋亡。但是各家报道Livin α和Livin β蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。Yang等［14，15］观察在Jurkat T淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNFα及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl 2。Livin α对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livin β则无此作用。CrnkovicMertens 等［8］ 采用RNA干扰技术分别使内源性Livin α和Livin β基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livin β可显著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外线放射治疗（UV irradiation）等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livin α则不明显。更多的研究则认为Livin α和Livin β基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。

许多研究证实［12-16］，Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase 3和Caspase 7结合，抑制其活性。Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase 9结合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、细胞色素C及dATP诱导的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。Sanna 等［12］的研究显示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNFα和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。 TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。此外，Vucic 等［13］证实SMAC（ second mitochondrial activator of caspases， SMAC）及活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAC介导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。

4 Livin基因治疗NSCLC的临床应用前景

鉴于Livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达Livin α和Livin β的NSCLC A549细胞克隆。孙建国等［17］用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染Livin α和Livin β基因后的细胞尤其是表达Livin α的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10 Gy放射线照射下仅有0.2%细胞发生凋亡。可见 Livin基因参与NSCLC的发生发展，也可能是NSCLC细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。

CrnkovicMertens等［18］利用基因转染和特异性小干扰RNA(siRNA)技术，在肺癌SPCA1细胞株中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系，观察诱导SPCA1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性Livin α和Livin β基因沉默后，SPCA1细胞克隆形成能力较对照组显著下降，促使SPCA1细胞发生凋亡，表明Livin α和Livin β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。

由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。Hariu等［20］ 用Livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现HLAA24与Livin 7肽具有特殊亲和力，Livin蛋白表达阳性的NSCLC患者可检测到特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），而Livin蛋白表达阴性NSCLC患者则测不到CTLs。结果提示Livin蛋白可成为NSCLC免疫治疗的靶点，将Livin 7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。

综上所述，Livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在NSCLC组织中的特异性表达为NSCLC的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为NSCLC治疗的新靶点［21，22］。目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mRNA为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。因此，采用反义核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制剂（smallmolecule inhibitors）和免疫介入（immunemediated approaches）等基因治疗手段直接阻断Livin 蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为NSCLC的治疗开辟新的途径［23，24］。同时，对NSCLC患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的Livin蛋白（受体）及其mRNA表达的联合检测，有可能成为NSCLC早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。

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细胞的生物学特性范文第4篇

【摘要】 目的 探讨βcatenin依赖性LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响。方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF1的编码基因，插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5His中，脂质体法转染Hela细胞，G418筛选稳定表达目的基因的细胞株，Western blot鉴定目的基因的表达，MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况，Annexin V方法检测细胞凋亡情况，裸鼠体内成瘤实验检测βcatenin依赖性LEF1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。结果 成功构建LEF1真核表达质粒，获得稳定表达βcatenin依赖性LEF1亚型的HeLa细胞株，转染后的细胞增殖速度加快，凋亡水平降低，体内成瘤能力加强。结论 全长型LEF亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用。

【关键词】 LEF1;增殖;凋亡;宫颈癌

ABSTRACT: Objective To study the effects of βcatenindependent lymphoid enhancer factor (LEF1) isoforms on biological behavior of HeLa cells. Methods βcatenindependent LEF1 genes were obtained by PCR from human lymphoid node cDNA library and inserted into pcDNA3.1/V5His vector to construct the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1FLEF1. Using lipofectamineTM 2000， the plasmid pcDNA3.1FLEF1 was transfected into Hela cells. Then we screened the stable cell lines that expressed the truncated LEF1 isoforms by G418 and identified the expression of target gene with Western blot. Then we analyzed the proliferation， apoptosis， cell clone formation and capability of tumor formation in vivo of transfected cell lines. Results We successfully constructed the βcatenindependent LEF1 eukaryotic expression plasmid and obtained the stable HeLa cell lines that expressed the fulllength LEF1 isoforms. The proliferation and capability of tumor formation in vivo of transfected cells were increased while apoptosis was decreased. Conclusion The overexpression of βcatenindependent isoforms can stimulate the malignant biological behavior of HeLa cells.

KEY WORDS: lymphoid enhancer factor (LEF1); proliferation; apoptosis; uterine cervix cancer

淋巴细胞增强因子(lymphoid enhancer factor， LEF1)最初是JONES和他的同事从Jurkat细胞中分离得到的，并进行了氨基酸测序[1]。LEF1是一种Wnt信号通路中的关键因子，由于LEF1基因剔除小鼠会发生胚胎性致死[2]，因此，LEF1被认为在胚胎发育过程中发挥重要作用。目前的研究表明LEF1至少存在两种以上的亚型[34]，其中βcatenin依赖性LEF1亚型，即全长型LEF1，通过和βcatenin结合募集转录共激活物，继而激活下游靶基因。LEF1在许多动物的胚胎组织细胞中高表达。但是，在个体出生以后其表达量迅速下降[5]。现有报道[2]显示在某些肿瘤和肿瘤细胞株又能重新检测到LEF1的表达，且全部是全长型，其具体机制还不是很明确。本研究通过构建稳定表达全长型LEF1的HeLa细胞株，探讨βcatenin依赖性 LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响，为临床肿瘤的防治提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌XL10、人淋巴结cDNA文库、质粒载体pcDNA3.1/V5His、HeLa细胞为本室保存。载体pMD18T购自TaKaRa公司;脂质体LipofectamineTM 2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公司;鼠抗人LEF1单克隆抗体购自Chemicon公司;鼠抗人βactin单克隆抗体、羊抗鼠二抗均购自北京中杉试剂公司;MTT、DMSO购自Sigma公司;AnnexinV凋亡检测试剂盒购自BD公司;细胞培养试剂购自Gibicol公司;G418购自罗氏公司;去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;DNA胶回收试剂盒、PCR试剂盒、各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司。根据GenBank提供LEF1 mRNA序列(NM016269)设计LEF1截短体引物：上游5′CACAGCGGAGCGGAGATTACA3′;下游5′AAT

GAGCTTCGTTTTCCACCATG3′。

1.2 全长型LEF1真核表达载体的构建 以人淋巴结cDNA文库为模板PCR扩增全长型LEF1开放阅读框。50μL PCR体系为：1μL模板，5μL PCR缓冲液，5μL dNTP，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL rTaq酶，余用高压灭菌的去离子水补齐至50μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃末次循环7min。将PCR产物克隆到pMD18T载体中，BglⅡ和EcoRⅠ双酶切鉴定，阳性克隆命名为TFLEF1，并将其送北京奥科生物有限公司测序。测序正确的TFLEF1及真核表达载体pcDNA3.1/V5His分别经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，胶回收所需要的片段，进行连接转化和扩增，最终获得全长型LEF1的真核表达质粒：pcDNA3.1FLEF1。得到的质粒用EcoRⅤ进行酶切鉴定。

1.3 G418筛选稳定表达目的基因的细胞株 转染前1d将2×105细胞接种于6孔板，LEF1真核表达质粒和对照质粒定量后按照Lipofectamin2000的说明书转染HeLa细胞。细胞转染后24h按1∶5传代，G418筛选(终浓度为800mg/L)阳性克隆，常规换液，直至有单克隆细胞集落形成。挑取单个细胞克隆，在含400mg/L的G418维持浓度的DMEM培养基中筛选扩增。Western blot鉴定目的基因表达。

1.4 Western blot检测目的基因LEF1的表达 提取转染后的稳定细胞株的总蛋白，Bradford法蛋白定量，SDSPAGE电泳，于25V稳压状态下转膜3h，室温用50g/L蛋白干粉封闭1h，小鼠抗人LEF1(1∶500)，4℃，孵育过夜，山羊抗小鼠二抗IgGHRP(1∶2000)室温作用1h，ECL化学发光显影。

1.5 MTT检测获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞的活性 将1×103转染后的稳定细胞株接种到96孔板，每孔体积200μL，每组设5个复孔，并设调零孔。分别在培养的第1、2、3、4、5d取出需测定的培养板，每孔加入MTT溶液(5g/L，用PBS配制，pH=7.4)20μL，继续孵育4h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞克隆形成能力的检测 在60mm培养皿中接种1×103转染了含目的基因质粒及对照质粒的细胞，同时每组设3个复皿。按照常规细胞培养方法、每2～3d换液一次。14d后观察克隆形成，并进行Gimsa染色。弃去培养液，PBS轻柔漂洗2次，甲醇固定30min，弃去甲醇，PBS漂洗3次，加入Giemsa染液1mL(或充分铺满皿底)，染色15min，弃去染液，PBS漂洗2次，体视镜下计数(细胞克隆的标准为≥50个细胞的细胞团计数为一个克隆)并拍照。

1.7 Annexin V/PI检测获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞凋亡情况 将细胞以3×105/孔接种在6孔板中，37℃，50mL/L CO2恒温细胞孵箱中培养3d。用细胞刮轻柔将细胞刮下，将收集得到的细胞在预冷的PBS中洗涤2次，继而以1×106个细胞/mL的浓度在1×结合缓冲液中重悬。将1μL液体(1×105个细胞)转移至5mL的流式管中。分别加入5μL的Annexin VFITC和5μL的PI。轻柔重悬，室温避光染色15min。每管加入400μL的结合缓冲液，1h以内进行流式分析。

1.8 获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞裸鼠体内成瘤能力的检测 将6只BALB/cnude裸鼠随机分成两组，每组3只。将5×106转染后的稳定表达全长型LEF1的HeLa组细胞及对照组细胞分别注射于裸鼠的两侧腹部皮下，注意观察小鼠状态和肿瘤生长状况。注射15d后使用游标卡尺分别测量肿瘤的长径(L)和横径(S)，并做好记录，每3d测量一次。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积= L×S2×0.51。注射30d后，取出肿瘤观察大体形态并称重。

1.9 统计学处理 采用SPSS13.10统计软件进行统计学分析，结果用±s表示，两组之间比较进行t检验，P

2 结 果

2.1 全长型LEF1真核表达载体的构建 以人淋巴结cDNA文库为模板，PCR扩增截短型LEF1开放读框，得到大小为1257bp的PCR产物(图1A)，回收后插入载体pMD18T中，得到TFLEF1，用BglⅡ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，若为正向插入(头在HindⅢ侧)酶切得到大小约1140bp的片段，若为反向插入(尾在HindⅢ侧)酶切得到大小约170bp的片段(图1B)，将正向插入的克隆送北京奥克生物有限公司测序，结果证实与GenBank中的相对应部分序列完全一致。继而将TFLEF1以及真核表达载体pcDNA3.1/V5His经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切片段进行连接转化，最终得到全长型LEF1的真核表达质粒，经EcoRⅤ酶切鉴定，预期得到大小约680bp的片段，琼脂糖凝胶电泳显示与预期片段大小一致(图1C)，表明全长型LEF1真核表达载体pcDNA3.1FLEF1构建成功。

2.2 稳定表达全长型LEF1蛋白的HeLa细胞株的筛选 质粒pcDNA3.1FLEF1及对照质粒pcDNA3.1/V5His转染Hela细胞，经G418筛选后得到阳性克隆细胞株，Western blot检测目的基因的表达情况。结果显示目的基因稳定表达(图2)。

2.3 MMT检测全长型LEF1对HeLa细胞增殖的影响 MTT检测转染后细胞的生长情况，并以时间为横轴，490nm处吸光值为纵轴绘制了生长曲线(图3)。结果显示转染了全长型LEF1的HeLa细胞生长速度，增殖能力较对照组明显增强(P

2.4 Annexin VFITC/PI检测全长型LEF1对HeLa细胞凋亡的影响 Annexin VFITC/PI染色检测转染后细胞的凋亡情况，Annexin V阳性细胞即发生凋亡的细胞，转染了全长型LEF1的细胞凋亡细胞的比例为(7.15±1.62)%，对照组凋亡细胞比例为(13.18±1.48)%，转染了全长型LEF1的细胞的凋亡能力下降(P

图3 MMT检测全长型LEF1对HeLa细胞增殖的影响

Fig.3 The effect of full length isoforms LEF1 on the proliferation of HeLa cells (P

2.5 全长型LEF1对HeLa细胞克隆形成能力的影响 比较转染后细胞的克隆形成情况，转染了全长LEF1质粒的HeLa细胞组形成的克隆体积大，数目多(图5A)，克隆形成率为(68.3±7.6)%(图5B)，而转染了对照质粒的HeLa细胞组克隆形成率为(37.3±6.4)%，形成的克隆体积小，数目少。结果显示获得性表达全长型LEF1后HeLa细胞的克隆生成能力增强(P

2.6 全长型LEF1对HeLa细胞裸鼠体内成瘤能力的影响 将转染后稳定表达全长型LEF1及对照质粒蛋白的HeLa细胞注射于裸鼠两侧腹部皮下，注射后每天观察肿瘤的生长状况，15d后接种部位肉眼可见肿瘤生成，对肿瘤的长径和短径进行测量，每3d测量一次，所绘制的肿瘤生长曲线显示，在裸鼠身上接种的转染了全长型LEF1 HeLa细胞较对照组形成肿瘤的速度快(图6A)。注射后30d取出肿瘤组织观察大体形态(图6B)，并称重，接种的转染了全长型LEF1HeLa细胞所形成的肿瘤的体积和重量大于对照组(图6C)(P

3 讨 论

LEF/TCF是一类含HMG盒(high mobility group)的转录因子家族。LEF/TCF的HMG DNA结合域，位于其蛋白分子的C末端，包括一个HMG盒和一个核定位信号。βcatenin结合域是LEF/TCF家族分子的另一个保守结构域，它位于LEF/TCF的N末端。一般认为βcatenin通过Arm重复序列与LEF/TCF家族成员结合形成βcateninLEF/TCF异二聚体，使HMG盒与DNA 结合特性发生改变，进而使HMG盒与特异性靶基因的调控序列相互作用而活化靶基因的转录[3]。βcatenin具有有效的转录激活结构域，LEF/TCF自身没有激活作用，而是通过和βcatenin结合发挥激活靶基因的作用。在Wnt信号缺失的情况下，LEF/TCF和Groucho/Grg/TLE形成复合物对转录起抑制作用[67]，βcatenin则可以将Groucho从LEF/TCF分子上置换下来，并与其N末端结合而激活下游靶基因[8]。βcatenin/LEF/TCF复合物已经被认为具有癌基因的作用，阻止结肠癌细胞中LEF/TCFs和βcatenin的结合，则可以明显抑制肿瘤细胞的生长，但研究表明只有全长型LEF/TCFs才能发挥这种作用[910]。这和我们的研究结果一致。获得性表达全长型LEF1后的HeLa细胞增殖和存活能力明显增强，而凋亡降低。

肿瘤的持续生长不仅仅是过度增殖的结果，同时伴随的是肿瘤细胞凋亡的减少，而这种减少往往是相对于增殖过快而言的。但是，在我们的研究中，全长型LEF1不仅促进了宫颈癌细胞的增殖，同时抑制了它的凋亡，从正反两方面加速了细胞的生长，提示过表达全长型LEF1后细胞拥有更高的恶性程度。而克隆形成实验结果恰好印证了这一点，与转染了对照质粒的细胞相比较，转染了全长型LEF1基因的细胞的克隆形成能力增强。细胞克隆形成实验反映的不仅仅是细胞的增殖能力，它还反映了细胞之间生长的依赖性，间接提示了肿瘤细胞的恶性程度[11]。

无胸腺小鼠(裸鼠)可进行人体肿瘤异种移植，由于在裸鼠体内移植的人体肿瘤仍保留其原有的组织学形态、免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药物原有的敏感性，因而被认为是一种较为理想的体内实验模型[12]。我们将转染后的细胞接种在裸鼠腹部皮下，观察肿瘤的生长状况，测量其长径和短径并绘制了生长曲线，待接种一个月后，取出肿瘤观察大体形态并称重，结果显示转染了全长型LEF1基因的细胞较对照组体内成瘤能力增强。这和体外观察到的结果一致。过表达全长型LEF1可以促进HeLa细胞的恶性生物学行为。研究表明cMyc是Wnt信号的靶基因之一[13]。它作为一个癌基因，异常激活可以促进细胞分裂，促使细胞无限增殖，导致细胞恶性转化。因此，全长型LEF1促使细胞增殖加强、凋亡减少可能也是由于全长型LEF1的过表达使cMyc表达水平相应提高的结果。

总之，全长型LEF1基因在肿瘤细胞中的重新表达是细胞恶性转化的一个信号。它通过和βcatenin结合持续激活Wnt信号途径，继而激活一系列的靶基因来影响细胞的增殖和凋亡调控，从而参与肿瘤的发生发展过程。

参考文献

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细胞的生物学特性范文第5篇

关键词：胰腺癌；SP细胞；CSC；耐药

胰腺癌预后差，5年生存率不足5%，中位生存期仅6个月[1]，胰腺癌细胞恶性生物学行为的机理复杂，容易对化疗药产生耐药性是主要原因之一[2]，因此研究胰腺癌的耐药机制尤为必要。肿瘤干细胞（Cancerstemcells，CSC）学说认为恶性肿瘤中存在极少数具有成体干细胞特征的细胞亚群，是恶性肿瘤耐化疗药物的根源[2]。本研究引入流式细胞术SP细胞分选法分离胰腺癌CSC，初步探索CSC在胰腺癌耐药中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料 人胰腺癌细胞系PANC-1购自上海中科院细胞库，DMEM培养基购自美国Invitrogen公司、胎牛血清购自美国Hyclone公司、胰蛋白酶购自美国Mediatec公司，Hoechest33342购自美国Sigma公司，Verapamil购自美国Sigma公司，吉西他滨（健择，Gemzar）购自美国Lilly公司，超净台购自AIRTECH公司，二氧化碳细胞培养箱购自NAPACO5410，Zseries细胞计数仪购自美国贝克曼公司，流式细胞仪购自美国Morflow，倒置显微镜购自日本Olympus公司，Western-blot转膜仪购自美国Bio-Rad公司，水浴槽购自江苏常熟医疗器械厂。

1.2方法

1.2.1细胞培养与观察 采用体外细胞培养对人胰腺癌细胞系PANC-1进行传代与培养，培养条件严格按照ATCC推荐条件执行；24孔板细胞计数法绘制细胞生长曲线，Zseries细胞计数仪进行细胞计数，获得实验数据。

1.2.2CSC的分离与鉴定 采用流式细胞术SP分选法，分离并鉴定PANC-1的SP细胞亚群具有CSC特性。

1.2.3胰腺癌干细胞对吉西他滨的耐受性检测 吉西他滨干预SP细胞亚群和non-SP细胞亚群，比较两细胞亚群耐受吉西他滨的差异；进而检测吉西他滨干预PANC-1后SP细胞比例。

2结果

2.1吉西他滨抑制浓度测定 见图1。

图1 吉西他滨抑制曲线

PANC-1细胞系用0.1～100uM浓度的吉西他滨处理72h，结果显示：0.1μM吉西他滨处理72h，细胞的增殖活力急遽下降，到吉西他滨1μM的时候，细胞增殖活力基本达到了最大抑制。结合文献报道，本课题选用1μM浓度和10μM浓度作为吉西他滨干预PANC-1的SP细胞亚群和non-SP细胞亚群的实验浓度，以探讨两亚群对吉西他滨的敏感性。

2.2人胰腺癌细胞SP细胞对吉西他滨作用不敏感 见表1，1μM吉西他滨作用PANC-1的SP细胞72h后，平均活细胞数是39346.7，未分选的PANC-1活细胞数是6463.3，而non-SP活细胞数是496.0（P

2.3吉西他滨诱导PANC-1后SP细胞比例增加 见图2。

图2A

图2B

图2 吉西他滨干预PANC-1后SP细胞比例升高

吉西他滨干预PANC-1细胞后，检测到对Velapamil敏感的SP细胞，其比例升高（图2B），由8.74%±0.33%升高至22.67%±3.21%（图3A），具有统计学差异（P

3 讨论

流式细胞术SP（Sidepopulation）分选法利用干细胞对Hoechest33342拒染的原理，分离出具有干细胞特性的SP细胞，SP细胞在许多肿瘤领域被证实具有肿瘤干细胞特性[3]。获得高纯度的肿瘤干细胞是CSC研究的基础，胰腺癌缺乏公认CSC表面标志物，SP分选法为胰腺癌CSC分离鉴定提供了新的思路。本课题组研究[4]发现人胰腺癌细胞系PANC-1存在Verapamil敏感的SP细胞，含量8.74%±0.33%；加入维拉帕米后SP细胞降低90%左右，数量明显减少，证实人胰腺癌细胞系中确实存在SP细胞亚群存在。本课题组通过平板克隆实验、细胞分化实验、裸鼠成瘤实验、流式细胞仪分析细胞周期、Transwell法检测侵袭和迁移能力检测胰腺癌细胞SP细胞亚群和non-SP细胞亚群生物学功能差别，显示SP细胞亚群具有更强的自我更新和增殖分化能力，证实SP细胞符合肿瘤干细胞学说的特点[4]。

胰腺癌SP细胞是否对化疗药物有较强的耐受性，需要进一步研究。吉西他滨的出现标志着胰腺癌的药物治疗取得显著的进步，被证实为第一个能有效缓解胰腺癌症状和改善预后的抗癌药物，是中晚期胰腺癌和胰腺癌术后的标准治疗[5]。本课题用0.1～100μM浓度的吉西他滨处理PANC-1细胞72h，活细胞计数法检测不同浓度吉西他滨对胰腺癌细胞增殖的抑制作用，结果表明0.1μM吉西他滨能够对PANC-1细胞的增殖活性有明显抑制作用，吉西他滨是治疗胰腺癌的有效药物[5]。

许多接受吉西他滨治疗的胰腺癌患者在承受了化疗毒副作用的同时，没有得到较好的治疗效果，本课题结果也显示吉西他滨处理胰腺癌细胞系后，仍然有残存细胞，提示胰腺癌的内在的或（和）获得性的耐药性是影响胰腺癌化疗效果的主要原因[5]。肿瘤干细胞学说为恶性肿瘤多药耐药特性的研究提供了重要理论基础，实验提示该亚群对化疗药物耐受，治疗后该亚群细胞的丰度还有可能提高，导致残留恶性肿瘤细胞恶性生物学行为的增加，这一现象在一些实体肿瘤中得到了证实[5]。

在胰腺癌领域，Hermann等[6]发现长期吉西他滨治疗使CD133+胰腺癌干细胞的比例增加，CD133+细胞具有明显的耐药性，延长干预时间到5d后，胰腺癌细胞中CSC的比例反而增加至50%；加大药物剂量后也不能完全杀死CD133+细胞。随后研究[7，8]也发现应用放疗和吉西他滨干预人胰腺癌组织异种移植瘤模型后，反而使CD44+CD24+ESA+的胰腺癌CSC比例增加；应用治疗剂量吉西他滨干预胰腺癌细胞后，细胞出现选择性生长，耐药细胞中CSC细胞表面标志物表达呈上升趋势。这些研究以胰腺癌表面标志物分离CSC，胰腺癌CSC目前还没有公认的特异性表面标志物，也使胰腺癌CSC耐药机制受到质疑。

为深入探讨胰腺癌CSC和耐药机制，本课题通过流式细胞仪分析细胞周期显示SP细胞较non-SP胞处于静止状态，符合干细胞特殊生物学特性--CSC通常处于静态[4]，多数抗肿瘤药物都通过抑制DNA合成或肿瘤细胞分裂，抑制肿瘤细胞生长，肿瘤细胞须有积极分裂才能对抗肿瘤药物敏感，化疗只是引起非CSC被杀死，静态的CSC在化疗后大多数生存下来[9]，导致恶性肿瘤复发转移。

本研究结果显示PANC-1的SP细胞和non-SP细胞亚群的细胞增殖能力对吉西他滨的敏感性有明显差异，SP细胞较non-SP细胞对吉西他滨耐受性强，有效剂量的吉西他滨干预后SP细胞能够继续增殖，且增殖能力远高于non-SP细胞；提示SP细胞能够耐受吉西他滨的抑制细胞复制的药理作用。

进一步结果显示吉西他滨干预后胰腺癌细胞系SP细胞含量提高，进一步证实SP细胞对吉西他滨耐受性较强；对吉西他滨不敏感的SP细胞存活下来，提示PANC-1的SP细胞亚群对吉西他滨不仅不敏感，吉西他滨干预可以提高SP细胞的丰度，导致残留胰腺癌细胞恶性生物学行为的增加。

细胞静止状态及耐受化疗药物是CSC的基本生物学特征[4]，人胰腺癌PANC-1的SP细胞亚群具有胰腺癌CSC特性，流式细胞术SP分选法能够分离CSC和非CSC亚群，有效剂量的吉西他滨干预后CSC能够继续增殖，且增殖能力远高于非CSC，提示胰腺癌CSC较非CSC对吉西他滨耐受性强，CSC能够耐受吉西他滨的抑制细胞复制的药理作用，胰腺癌干细胞是胰腺癌细胞耐药的根源：要治愈胰腺癌必须杀灭胰腺癌CSC，而要杀灭胰腺癌CSC就必须继续阐明其恶性分子生物学机制，找到其靶向性的治疗位点[10]。

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