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关键词:创新实践能力;中药药理学实验教学;改革探究
中药药理学是在中医药理论指导下,应用现代科学技术和方法,研究中药与机体相互作用及作用规律的一门课程,是理论教学内容的重要补充和扩展,是学生将课堂上所学到的理论知识联系实际的重要实践过程。学生通过中药药理学实验课程的学习,巩固和加深对中药药理学基本理论知识的理解和掌握,从而具备一定的实验技能,为日后的中药学研究工作奠定必要的基础;培养科学而严谨的作风,提高科研能力、独立分析问题和解决问题的能力;拓展对实验中药药理学内涵的了解,明确其目的、意义和方法,初具实验药理思维。如何通过实验教学改革,培养大学生的创新思维能力和实践探索能力,提高大学生的科研创新能力,是我们中药学专业教育教学改革的重点。本文从传统的教育模式出发,逐步分析教育中的不足与欠缺,积极开展新的教育模式,拓展教育思路,从而达到实验教学改革的目的。
一、中药药理学实验教学改革的必要性
受实验经费、实验仪器设备、实验环境以及传统的教学观念等诸多因素所限,中药药理学实验课程多以验证性实验为主。实验内容从属于单一的理论知识,以教师讲授为主,学生只是根据实验讲义,照葫芦画瓢,观察到的实验现象也只是死板地套用理论课的知识得出结论。这种学习模式,非但没有加强学生的动手操作能力,还忽略了学生创新能力以及临床药学使用知识能力的培养,忽略了学生独立思考药物作用机制的能力,忽略了学生发现问题和解决问题的能力。随着科学技术的发展,药品市场的逐步扩大,对于中药学专业的学生,具备一定的科研能力至关重要。而中药药理学是在药品的研制开发过程中必不可少的,对于中药药理学的能力更不单单是理论知识和实验技能,对学生发现问题、分析问题、解决问题的能力也提出了更高的要求。新时期下,要求培养出既具有扎实的理论知识、娴熟的实验动手能力,又具有自主学习能力、独立设计能力和创新思维能力的高水平、综合素质人才。传统的“填鸭式”中药药理学实验教学模式是达不到这一要求的。因此,在进行中药药理学实验教学改革时,需要弥补传统教学模式的不足,研究出适合现代化人才培养目标的中药药理学实验教学模式。
二、基于大学生创新实践能力培养的中药药理学实验教学模式
中药药理学实验教学是培养学生动手能力、创新意识和综合能力的重要环节。在教学过程中,如何由浅入深启发学生,提高学生学习药理学的兴趣,培养学生的创新实践能力是教学模式改革的关键。1.精选中药药理学实验教学的课程内容。中药药理学可以说是一门实验性科学,它所阐述的理论内容大多来自于动物实验和临床医疗实践的研究,所以在传统的中药药理学实验教学中以验证性实验为主,其内容单调、陈旧、方法简单,很难激发学生深入思考和探索的欲望,达不到实验教学的预期效果。因此,我们优选中药药理学实验教学的课程内容,丰富实验性质,多增设一些综合性实验、设计性实验,调动学生的积极性,由被动变成主动,培养学生的思维能力和创新能力。比如说我们在研究中药钩藤对心血管系统影响的时候,考查了学生对品剂量的换算,检验了学生的操作能力,让学生学会与不同药物进行对比,观察不同药物的作用效果,结合药物的分类、作用原理,整理数据,得出结论。通过这个实验,使学生形成了比较完整的实验性思维。2.改变中药药理学实验教学的教学模式。在总结与归纳以往的教学经验中,我们发现传统的“自述”式的授课方式不仅不适用于理论教学,同样也不适用于实验教学。我们鼓励学生提出问题,讨论问题,但是如何能让学生提前发现问题,而不是“临阵磨枪”呢?在教学中,我们采用问题讨论方式,提高学生学习的主观能动性,课前预习,课上讨论,避开了一些实验中会出现的常见问题,提高了课堂效率,充分调动了学生的积极性、主动性,增强了学生的参与意识,提高了学生独立思考问题、分析问题、解决问题的实际能力,无论是为今后毕业论文研究思维的形成,还是为更好地适应临床工作,都打下了扎实的基础。
三、加强中药药理学实验教学的创新实践性
实践教学是中药药理学教学的重要环节,也是检验学生综合能力的有效方式。在我们的实验教学中,我们不停地强调“创新”、“实践”能力,可是单单通过几十学时的课程,怎么能激发学生的“主动创新”潜能,仅仅通过我们精心编撰的实验课程内容,怎么能调动学生的“积极实践”能力?于是,我们鼓励学生参加学校举办的实验技能大赛,以不同形式的比赛方式,达到发掘学生“主动创新”潜能,考查学生“积极实践”能力的效果。近几年,我们更是推荐学生参加国家级的实验技能大赛,让学生的学习不仅仅局限在学校的层面,不是一孔之见,而是开阔视野,取长补短。在实验教学中,我们也会发现,通过这样丰富而有趣的比赛,学生在课堂上的主动性提高了,也常常出现“举一反三”的现象,由“被动学习”变成了“主动思考”。另外,“大学生科技创新”项目也是我们为培养学生的创新性和实践性所提倡的。鼓励学生积极申报“大创”项目,以小组为单位,在老师的指导下,撰写申请书、探讨课题创新性和应用性、设计实验方案、总结课题、汇报等系统的科研训练。通过此类科研训练后,学生的实验兴趣被调动,在平时的中药药理学实验课程中也会注重一些实验的细节,树立科研态度,形成科研创新的认知,大大提高了学生与老师互动的积极性。总之,中药药理学实验教学课程的改革,改变了原来传统、单一的教学内容和模式,积极构建一种多元化、趣味化、系统化的实验教学模式,更有利于培养学生的创新性和实践性,形成一种新的中药药理学实验教学体系。
参考文献:
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关键词: PBL教学模式 《中药药理学》理论课教学 影响
PBL(problem-based learning)教学模式是一种逆向学习模式,强调从问题入手,使学生去探索那些他们需要知道的知识,并能应用这些知识去解决实际问题。这种教学模式在美国等一些国外的高等院校已广泛应用多年,并取得了相当大的成功[1]。PBL教学模式在中药药理学实验课教学中应用改革虽有报道[2],但尚未见其在《中药药理学》理论课教学中的应用报道。为改革传统的教学模式,探索适合本科《中药药理学》理论课教学的方法,建立符合当今本科教育要求,既能促进学生成长、教师发展,又能提高学校教学质量的教学模式,笔者进行了研究和实践。
1.研究设计
1.1研究对象。
我院2006级中药学专业的85名学生,男女生之比为4∶5,年龄在18―21岁之间。
1.2教学内容。
对《中药药理学》其中两章《第十九章开窍药》和《第二十章补虚药》的部分内容采用PBL教学模式授课。根据教学目标和“问题设计的十项基本原则”[3],本研究设计了两个问题。第一个问题涉及教材中两章的内容,一是人参对心血管系统和中枢的作用及应用各有哪些,再就是麝香抗血小板聚集的机制;第二个问题涉及多方面的知识,当然主要是补虚药治疗疾病的机理及在临床应用方面的知识。
1.3教学方法。
(1)课前分组:将中药学班81名学生分为5组,每组选出一名组长。(2)提出问题:每次提前一周布置一个问题。(3)收集资料:学生围绕所设定的问题,根据教师的引导,通过图书馆、网络、求教专家等途径,寻求问题的答案。(4)小组讨论:每组学生就所设定的问题,结合自己收集到的资料进行深入的讨论。(5)完成报告:每组交1份书面总结报告。(6)课堂交流:每组选出1名代表借助PowerPoint进行演讲,每组演讲时间控制在1分钟。每组发言后,其他组别的学生和教师可以提出问题。问题由演讲的学生回答,所在组的其他成员进行补充。(7)总结升华:教师对学生的发言进行讲评和总结,归纳出每次课学生应掌握的知识点和重点内容。
1.4研究方法。
本研究采取了问卷调查和座谈两种方式。
采用问卷调查的形式对PBL教学模式的必要性、对PBL教学模式的喜欢程度、PBL教学模式的趣味性、学习积极性、发现及解决问题的能力、归纳总结能力、对学习内容掌握及对所学知识的理解与应用能力等多方面内容进行综合评价,结果见表1。
在授课班根据学生的学习成绩,同时参考学生是否参加课堂演讲选取6名学生进行座谈。好、中、差生各两名,参加演讲的1名,在研究者的办公室内围绕5个问题进行师生一对一的座谈。得到学生的同意后对座谈内容进行录音,将录音内容转换成文字材料作为定性分析的资料。
3.讨论
调查问卷显示,较施行PBL教学模式前,学生对中药药理学重要性的看法明显提高了,学习兴趣和积极性明显增强了,而且学习态度更加认真了。就知识的学习而言,调查问卷显示,实行PBL教学模式后,学生不仅认为中药药理学本身知识的获得明显增加,而且对系统掌握药理知识和对相关学科的学习都有明显的帮助作用。座谈中有的学生说:“只有通过亲身体验获取的知识,才能真正融入自己的血液。”PBL教学模式是以“问题为中心,学生为主体,教师为引导”。解决问题的方法并不是唯一的,答案也是多种多样的。要解决问题,不仅需要本学科中不同领域的知识,而且要用到许多相关学科的知识,弥补“以学科为中心”教学所存在的不足,推进基础课程之间、基础课程与临床课程之间的融合。
在加强学生各种意识的培养和师生沟通方面,PBL教学模式也体现出了明显的积极作用,学生的参与意识、竞争意识和合作意识都得到了明显的增强。
通过座谈发现,学生认为PBL教学模式可培养团结合作意识、竞争意识、参与意识。以问题为中心的教学法从问题教学的产生、讨论到解决需要经过小组共同努力来完成教学目标。在合作中既能各抒己见,又能达成一致意见,取长补短。通过活跃而融洽的讨论,逐渐建立协调、积极、相互尊重而又充满竞争气氛的关系,真正体现了这种以问题为中心,以学生为主体,以教师为引导的优越性。这说明PBL教学模式可显著加强师生之间的沟通和增强学生的参与意识、合作与竞争意识。
另外,PBL教学模式也可明显提高学生的各种能力,主要包括对中药药理学问题的解决能力、发散思维能力、信息处理能力、实践能力、写作能力、自主学习能力、语言表达能力。在座谈中学生谈到,要解决问题,就要利用各种信息资源,查阅、整理资料,进行讨论和总结,撰写交流报告,制作PowerPoint演示文稿。在这一学习过程中学生逐步形成一种以自我学习为主独立分析、解决问题的习惯,培养独立思考、创新和独立获取知识、信息处理的能力。他们还认为以问题为基础的教学模式注重学生能力的培养,不同于以往以教师为中心的传统教学模式,教师的作用由单一的“教”转变为既“教”又“导”,在更深层次上既传授了课本上的基本知识,又培养了学生分析问题、解决问题的能力。同时,绝大多数学生对问题的组织能力加强,语言表达更清晰,心理承受能力提高,为学生创造性思维的发挥提供了一个平台,使他们将来更加适应社会,成为21世纪的新型医药人才。因此,PBL教学模式可显著增强学生的问题解决能力、发散思维能力、信息处理能力、实践能力、写作能力、自主学习能力、语言表达能力。座谈中大部分学生认为要获得问题的答案,就要花费大量的时间和精力通过各种途径搜寻所需要的资料。由于学生学习的时间是有限的,消耗在该环节上的时间过多,就可能导致学生在其他学科上学习时间的减少,因此,如果时间充足,这种教学模式的优越性是显而易见的。
4.结语
本研究发现,学生对中药药理学的认识和态度在实行PBL教学模式后都有显著的提高和转变。PBL教学模式对系统掌握中药药理知识和相关学科的学习都有很大的帮助作用。同时,该模式还可明显增强学生的各种意识和提高各种能力。因而,PBL教学模式对学生中药药理学的学习有着显著的积极影响。
参考文献:
[1]林莎,冯志,王全乐等.PBL教学法在中专药理学教学中的局部应用[J].卫生职业教育,2003,21(2):93.
【关键词】 血清药理学;中药制剂;疗效
doi:10.3969/j.issn.1004-7484(x).2012.08.691 文章编号:1004-7484(2012)-08-2973-01
目前,临床使用的中药制剂多为复方制剂。而中药的复方制剂是由很多味中药组成,这些不同味的中药有的需经过炮制处理,在制剂过程中需要经过一系列的煎煮、提取、提纯等制备过程再给予患者进行服用,所以会产生十分复杂的化学变化,并且其有效成分有的是直接由药物本身的化学成分直接发挥出治疗作用,更多的有效成分则需要通过在体内经肝脏代谢的作用才能发挥出其药效作用,还有一些时候是需经第二信使起间接的药效作用[1,2]。因此,直接提取中药制剂中的化学成分进行体外药理实验往往无法准确并客观地反应药物在体内产生的实际效应[3]。而血清药理学实验恰恰解决了这一难题。其通过事先建立动物模型的基础上,给予动物服药,然后采集其的血清作为实验源,进行体外相关的药理学实验及观察。本文就血清药理学如何通过其实验方法在提高中药制剂的疗效方面进行讨论,现综述如下:
1 中药制剂的疗效与血清药理学关系
1.1 血清药理学与中药药理学的区别 血清药理学不同于普通的药理学,普通的药理学主要是研究根据药物本身的化学成分与机体间互相产生的作用及作用机制的一门学科。研究的前提是单纯的忽略药物化学成分的任何变化,总体观测对人体所起到的治疗作用。有学者提出应用血清药理学研究中药制剂的疗效很准确,更客观[3]。因为血清药理学能够客观的探究药物进入人体内产生的化学变化,还原药物进入体内的一系列反应(柯玮、朱建华在检测乌骨藤时比对总结其优势[1])。血清药理学的试验方法是给实验动物服用研究的药物,选取不同的时间进行采血,通过血清检测得以更为细致的研究结果。血清药理学的发展扩展了中药药理研究新方法,实现了从细胞角度研究中药疗效的新途径。例如侯小萍,康永等人在研究中药的复方制剂时先利用药理学将每味中药的有效成分进行研究,在探究实际起作用成分时就选择了血清药理学,从而将中药的有效作用成分分离出来[3]。
1.2 血清药理学利于提高中药制剂疗效 中药制剂在我国的发展已有悠长的历史,但针对于中药疗效的药理研究却一直是半模糊的状态[1]。有资料对我国中药药理研究目的进行了总结:制备出精制的中药制剂、寻找中药中的有效部位或有效成分、降低药物毒副作用及提高临床疗效等作用为对象[4]。有学者提出,只有建立血清药理学实验方法,才能有效完成上述中药制剂研发目的[4]。主要体现在:可以通过体外的药理学实验,进一步对药物的有效成分及其疗效进行验证与评价,选取含有药物有效成分的血清或是有效药物的血清进行初步的实验筛选(程珠炉等在实验中采取的方法[5]);可有助于快速寻找并鉴定出药物中的有效成分及其有效部位(程珠炉,洪浩等在研究中准确的鉴定出了蛇床子的有效作用成分—蛇床子素[5]);血清药理学实验能对比及筛选出合理的药物制剂工艺。
1.3 血清药理学实验方法对于研发鉴定抗肿瘤中药制剂疗效的应用 在研发中应用广泛的离体实验是公认的有效开发、研究抗肿瘤中药药物有效成分的作用机理的重要方法之一。但柯玮、朱建华在检测乌骨藤[1]时采用这种方法却发现其有很大的不足:难以发现各种配伍的中药的血清中的有效药物成分及其定量分析、检测。这也是我国针对抗肿瘤的复方中药制剂的开发研究中一直未有突破性进展的主要原因之一。程珠炉等在研究蛇床子的实验中发现[5],采取血清药理学实验方法能有效地研发抗肿瘤的复方制剂。其研究层面广泛,主要有抑制肿瘤细胞的基因表达、促进肿瘤细胞的凋亡、诱导肿瘤细胞的分化、阻碍肿瘤细胞的增殖、阻断细胞周期的调节、干扰端粒酶活性的调控等[5]。
1.4 血清药理学实验方法对于协助神经药理学及反映其药效的应用 神经系统疾病的治疗药物的药理作用机制研究中需要有大量的体外模型,通过各种模型进行快速及高效地有效治疗疾病的药物筛选。蒙一纯等在研究茯神的药效时显示,合理运用血清药理学的实验方法,能在结合神经系统疾病的体外模型的基础上,进一步协助分析茯神治疗失眠、健忘、心虚悸惊的作用机理,进行中药药效的有效反映。
2 血清药理学实验方法与中药制剂的疗效评价的关系
血清药理学实验方法最为突出的作用是对于中药制剂的疗效评价。由于其特殊的实验方法学,能发挥其针对中药制剂成分有效性分析的独特优势。蒙一纯等[4]学者应用血清药理学实验研制滴囊制剂时发现根据方法学中的要求,能协助解决中药复方制剂中无法直接采用实验验证药效的难点,有机地将中医药研究通过此方法直接结合实验及分子生物学的技术,对中医药的现代化发展起积极的推动作用;程珠炉,洪浩等[3]在研究中准确的鉴定出了蛇床子的有效作用成分—蛇床子素提出血清药理学实验能以原复方的粗提物作为参照物,同步进行分析对比含有药物成分的血清的药效作用机制和药动学作用机制,从中寻找并发现中药复方制剂中主要发挥药效的物质基础,为验证并总结出中药复方制剂的药理作用规律提供科学的依据及新思路[5]。
3 讨论
血清药理学是一门独特的科学,能有机结合与血清药化学、中药分析化学、中药药动学等学科的内容,特别是经常会与中药证治药动学、中药血清药动学、中药胃肠药动学等学科理论结合研究分析,血清药理学对于更快的找到提高中药制剂疗效的方法和途径是有重要意义的。以后血清药理学在针对中药复方制剂方面的研究上会起到越来越重要的作用。虽然目前对中药复方制剂的血清药理实验还是起步阶段,但我相信血清药理学的优势是显而易见的,通过更多、更细致的研究势必会使血清药理学在提高中药制剂的疗效方面起到更为重要的地位。血清药理实验法这种对于内含药物成分的血清进行血清药理学实验的方法因为能直接有效地对药物在体内环境发挥药效后产生相关的效应的真实过程作出集中的反应,具有科学及真实地理论支持,从细胞学的水平上进行中药药理作用机制的分析,也会逐渐具有重要的临床意义。
参考文献
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摘 要 目的:观察复方乌头酊治疗类风湿关节炎的疗效。方法:类风湿关节炎患者30例,男8例,女22例,平均年龄48±10岁,每天给予乌头酊40ml搽患痛处,连用8周。结果:总有效率93%,不良反应轻微。结论:乌头酊治疗类风湿关节炎,在此剂量用法下,有效、方便、安全。
关键词 制川乌 制草乌 类风湿关节炎 酊剂
关键词 制川乌 制草乌 类风湿关节炎 酊剂
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.05.188
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.05.188
资料与方法
资料与方法
2005~2010年收治类风湿关节炎患者30例,所有患者明确诊断患有类风湿性关节炎并处于活动期,病例选择按美国风湿病协会1987年诊断标准。其中女22例,男8例;年龄26~65岁,平均48±10岁;病程5±5年,平均3~10年。给予方法乌头酊每天不超过40ml外擦痛患处。治疗前1周停用非甾体类抗炎药及其他中成药。连用8周后进行临床分析。酊每天不超过40ml外擦痛患处。治疗前1周停用非甾体类抗炎药及其他中成药。连用8周后进行临床分析。
处方及用法:制川乌、制草乌、通草、甘草、木瓜、杜仲、甘草、当归、牛膝、陈皮、威灵仙、土茯苓、川断、桑枝以上药材各50g,均取自本院中药房,用60%医用酒精5000ml浸泡在适宜的容器中,30天后取滤液外用。用法与用量:2次/日,20ml/次涂搽患痛处。
处方及用法:制川乌、制草乌、通草、甘草、木瓜、杜仲、甘草、当归、牛膝、陈皮、威灵仙、土茯苓、川断、桑枝以上药材各50g,均取自本院中药房,用60%医用酒精5000ml浸泡在适宜的容器中,30天后取滤液外用。用法与用量:2次/日,20ml/次涂搽患痛处。
治疗前后临床指标:晨僵(分)、左手和右手握力(kPa)、关节压痛指数、关节肿胀指数、关节功能。治疗前后实验室指标:血沉、类风湿因子、C-反应蛋白。
治疗前后临床指标:晨僵(分)、左手和右手握力(kPa)、关节压痛指数、关节肿胀指数、关节功能。治疗前后实验室指标:血沉、类风湿因子、C-反应蛋白。
治疗前后不良反应指标:血、尿常规,肝肾功能。
治疗前后不良反应指标:血、尿常规,肝肾功能。
疗效判断标准:各项指标改善率相加求均值后评价。①显效:各项指标改善率>60%;②进步:各项指标改善率30%~60%;③无效:各项指标改善率<30%。
疗效判断标准:各项指标改善率相加求均值后评价。①显效:各项指标改善率>60%;②进步:各项指标改善率30%~60%;③无效:各项指标改善率<30%。
结 果
结 果
疗效:患者治疗后各项临床指标与治疗前比较有显著性改善,血沉、C-反应蛋白、类风湿因子降低,见表1。
疗效:患者治疗后各项临床指标与治疗前比较有显著性改善,血沉、C-反应蛋白、类风湿因子降低,见表1。
其中显效14例(46.6%),进步14例(46.6%),无效2例(6.6%),总有效率93.3%,见表2。
其中显效14例(46.6%),进步14例(46.6%),无效2例(6.6%),总有效率93.3%,见表2。
不良反应:治疗前后不良反应指标未见异常。除有1例酒精过敏外,其余未见不适。
不良反应:治疗前后不良反应指标未见异常。除有1例酒精过敏外,其余未见不适。
讨 论
讨 论
本方取自民间验方,文献记载乌头碱口服3~4mg即可引起中毒死亡[1,2]。安全性不能很好的掌握。应用此方治疗类风湿关节炎时,对毒性药材的炮制和用法用量明确规定,防止用量过大经皮吸收中毒。从实验中看,不良反应轻微。取得了显效(P<0.01)。值得推广应用。本文不足之处是样本数小,且未设对照组。对本药长期的作用有待临床进一步总结。
本方取自民间验方,文献记载乌头碱口服3~4mg即可引起中毒死亡[1,2]。安全性不能很好的掌握。应用此方治疗类风湿关节炎时,对毒性药材的炮制和用法用量明确规定,防止用量过大经皮吸收中毒。从实验中看,不良反应轻微。取得了显效(P<0.01)。值得推广应用。本文不足之处是样本数小,且未设对照组。对本药长期的作用有待临床进一步总结。
参考文献
参考文献
1 王筠墨,主编.中药药理学.上海:上海科学技术出版社,1987:60.
1 王筠墨,主编.中药药理学.上海:上海科学技术出版社,1987:60.
2 张唐颂,陈家璇.误服生附子中毒1例.中国医院药学杂志,1991,12(11):572.
2 张唐颂,陈家璇.误服生附子中毒1例.中国医院药学杂志,1991,12(11):572.
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1.2 沙棘化学成分分子库的准备 通过文献考察和TCMSP数据库(http:///tcmsp.php)查询共获得了沙棘223个化学成分的分子结构。将上述223个化合物代入软件分析,通过口服利用度和类药性这2个决定药物分子是否具有较好的口服生物利用度以及成药性优劣的关键参数进行筛选[1011]。设定口服利用度(OB)≥30%,和类药性(DL)≥0.18 2个条件,得到同时符合条件个化合物有33个。这些化合物再通过PubChem(有机小分子生物活性数据库,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)进行结构辨别,筛选出2个苯环(A环与B环)通过中央三碳相互联接而成的这类化合物(黄酮类化合物),满足黄酮类结构共7个化合物分别是槲皮素(quercetin,PubChem CID:5280343)、异鼠李素(isorhamnetin,PubChem CID:5281654)、山柰素(kaempferol,PubChem CID:5280863)、花葵素(pelargonidin,PubChem CID:5281605)、表儿茶素(epicatechin,PubChem CID:72322)、儿茶素(cianidanol,PubChem CID:2353)、AC1LDVZ[(2R)5,7dihydroxy2(3hydroxy4methoxyphenyl)2,3dihydrochromen4one,PubChem CID:3593],化合物具体信息见表1。
1.3 沙棘黄酮类化合物潜在靶点预测与筛选 用ChemBioOffice2010绘制 7个沙棘黄酮类化合物的结构,将其存为MOL2格式,并导入 ChemMapper服务器进行潜在靶点的预测分析,参数设置如下,Options for ChemMapper:Target Navigator;3D similarity method:SHAFTS;Similarity Threshold:1.2;Bioactivity Database: DrugBank。ChemMapper[12]是基于分子相似性方法的靶效药理学及化学关系发现的多功能平台,本文通过ChemMapper整合Drugbank数据库已知的包含生物活性及靶点注释信息的药物分子,然后应用三维分子相似性方法SHAFTS[13]来计算查询分子与药物分子的相似度,从而预测查询分子的潜在靶点。基于对心肌缺血发病机制的总结,进一步通过KEGG数据库靶点功能分析比对心肌缺血病理过程所对应靶点,筛选出相应的靶点进行下一步分析。
1.4 GO富集分析与通路注释 将预测获取的靶点蛋白信息导入MAS 3.0数据库,即可得到靶点的相关通路信息。参数设置如下,Species: Homo sapiens (Human);Molecule Type: Protein;Database Symbols: Gen Bank ACC;Functions: Gene,mRNA,Protein,Pathway;Regulation Threshold: Up 2.0,Down 0.5。另外,KEGG包含的通路稻菘獯⒋媪嘶因功能的相关信息,通过图形来表示细胞内的生物学过程。利用此数据库可以对由MAS 3.0得到的通路进行注释及GO富集分析,以及结合KEGG数据库进行通路分析。
1.5 网络构建 通过Cystoscope 3.3.0建立“化合物靶点通路”网络模式,绘制沙棘黄酮类化合物分子与靶蛋白作用网络图。以选取的7个沙棘黄酮成分、预测出的靶点和通路及通路注释为节点(node),建立相互关系,导入Cytoscape 3.3.0软件,运用network analyzer插件分析藏药沙棘黄酮类成分治疗心肌缺血的“化合物靶点通路”网络图。在网络中,以节点(node)表示活性成分、靶点和通路。以边(edge)相连接表示某一靶点为某化合物的潜在作用靶点和某一靶点与某一通路相关。
2 结果
2.1 靶点预测与筛选 通过ChemMapper数据库对TFH 7个黄酮类成分的分析,共预测得到了68个潜在靶点,经靶点功能分析后确认其中有31个靶点直接或间接与心肌缺血有关,相关靶点信息见表2。各化合物所对应的作用靶点数不尽相同,其中槲皮素14个、异鼠李素4个、山柰素14个、花葵素15个、表儿茶素24个、儿茶素10个,单从作用层次上,提示表儿茶素在网络中贡献最大。在预测的靶点中,PTGS1(前列腺素G/H合酶1)、PTGS2(环氧合酶2)是花生四烯酸代谢通路中重要节点;ADRB1(β1肾上腺素能受体),ADRB2(β2肾上腺素能受体),ADRB3(β3肾上腺素能受体),DRD1(多巴胺D1b受体),DRD5(多巴胺D1a受体)等与钙离子通道有关;MAPK1(丝裂原活化蛋白激酶1),MAPK14(丝裂原活化蛋白激酶14),PIK3CG(磷脂酰肌醇激酶CG),PIK3R1(磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1),PIK3R2(磷脂酰肌醇3激酶调节亚基2),CDK2(细胞分裂蛋白激酶2)等与细胞生存和凋亡有关;PIK3CG,PTGS1,PTGS2,MAPK1,IFNG(干扰素γ)等与炎症反应有关;PIK3CG,PIK3R1,PIK3R2等与脂质代谢有关。由此推断,TFH治疗心肌缺血可能通过参与调节血小板聚集、脂质代谢、炎症反应等过程,增强心功能和保护血管内皮细胞等作用有关。
2.2 GO富集分析及通路分析 通过GO富集分析发现,见图1~3,预测靶点在生物过程中,蛋白偶联受体蛋白信号通路和信号传导排位靠前;在分子功能中,ATP结合、蛋白质结合、转移酶活性和核苷酸结合相关性最大;在细胞组分中,质膜和细胞核所占比例最大。通过KEGG通路分析共得到60条信号通路,23条直接或间接与心肌缺血有关,见表3。其中有2条与血小板聚集有关,分别是Fc epsilon RI和arachidonic acid metabolism信号通路;有3条与脂质代谢相关,分别是Fc epsilon RI,mTOR和Insulin信号通路;有8条与炎症相关,分别是Tolllike receptor,MAPK,JakSTAT,Arachidonic acid metabolism,Leukocyte transendothelial migration,TGFbeta,Proteasome和Focal adhesion信号通路;有6条与细胞凋亡相关,分别是VEGF,Apoptosis,Cell cycle,p53,Gap junction和ErbB信号通路;有3条与心脏功能和血管舒张有关,分别是Ca2+,Fc epsilon RI和Phosphatidylinositol signaling system信号通路;有3条与血管韧性和通透性有关,分别是Leukocyte transendothelial migration,Adherens junction和Tight junction信号通路。
2.3 网络构建 利用Cytoscape 3.3.0软件建立了TFH的“化合物靶点通路”网络图,见图4。直观地呈现了6个化合物(其中化合物AC1LDVZP无对应靶点)、31靶蛋白、23条作用通路与心肌缺血疾病之间的关系。分析结果表明, Calcium signaling pathway,VEGF signaling pathway和Gap junction 3条信号通路在网络中网络节点度排位靠前(作用于通路的靶点数均≥8),为网络中的枢纽节点,提示它们可能是TFH抗心肌缺血核心作用途径;化合物与靶点间存在着“一对多、多对一”的关系,体现了TFH其多成分、多靶点的抗心肌缺血作用机制;沙棘黄酮类成分在血小板聚集、脂质代谢、炎症反应、细胞凋亡和心血管功能等相关通路上具有协同作用。
3 讨论
网络药理学是在基于高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索构建 “药物基因靶点疾病”相互作用网络,进一步利用网络平衡的整体观来分析药物与机体相互作用的一门学科[14]。网络药理学的发展打破了“一个药物、一个靶标、一种疾病”的传统理念,将高选择性单一靶点的新药研究模式转化为针对机体网络调控的组合模式[15]。网络药理学这一研究策略为中药和民族药药理学研究提供了崭新的思路与方法,为中药和民族药多靶点、多途径效应提供了可量化数据,实现了对单味药多成分或者复方的作用机制研究的整体化、系统化[16]。
心肌缺血主要由于血液所含物质的变化和血管腔内产生病理改变的结果[1]。大多起因于膳食不合理、运动过少等生活因素导致的高脂血症、高胆固醇血症。久而久之导致动脉血管形成粥样斑块,而冠状动脉粥样硬化直接造成冠状动脉血管通道变得狭窄,甚至阻塞,这也是心肌缺血最主要和常见的原因之一[17]。藏医理论认为,心是脏腑之君,《四部医典》[18]对心脏病的病因描述为“愁悲烦乱心不安,腹肌失眠_粗暴生”。心肌缺血的症状属于藏医“心悸”“心刺痛”“心热症”等病的范畴[19],而冠状动脉粥样硬化所导致的心肌缺血,藏医认为,一些病因一方面会使隆行太过发生偏盛的病变,或隆乱血塞;另一方面作用于血使赤巴受害而打破三因平衡[20]。
本研究发现大量预测靶点与血管内皮细胞保护和心肌细胞保护有关,且各个靶点、通路相互协同作发挥作用,提示这可能是TFH抗心肌缺血的关键。心肌缺血/再灌注损伤引起炎症反应,大量炎症介质的表达,造成心肌细胞的进一步凋亡,从而加剧心肌缺血/再灌注损伤[21]。另一方面,血小板聚集、炎症反应、氧化应激反应会进一步损伤内皮细胞,促进血栓形成和加剧炎症反应,进而加速冠状动脉硬化和心肌缺血病理过程。花生四烯酸代谢信号通路在整个抗心肌缺血过程扮演着重要的角色,其代谢产物参与胆固醇代谢、内皮细胞单核细胞黏附、血小板聚集,调节血液黏度和血细胞功能等过程[22];而且Src酪氨酸激酶的激活能增加细胞内钙离子水平和激活磷脂A2(PLA2),进而激活花生四烯酸在质膜磷脂中的合成[4]。TFH对活性氧自由基(ROS)的清除作用[23]能减少心肌缺血造成的损伤。心肌缺血会导致心肌细胞产生大量ROS,再灌注也会进一步促使心肌细胞产生ROS[24],加剧心肌细胞和内皮细胞的凋亡。而TFH可能通过MAPK14,PIK3CG,PTK2B,PIK3R1和PIK3R2等靶点调控白细胞跨内皮迁移信号通路(Leukocyte transendothelial migration),抑制NADPH氧化酶表达,进而减少ROS的分泌,保护心肌细胞和内皮细胞受到氧化应激损伤。
本文通过预测得到的Calcium signaling pathway,VEGF signaling pathway和Gap junction 3个通路为网络中枢纽节点,与已有文献报道吻合,证实了预测实验的准确性。TFH对钙离子转运的影响,能增强心肌细胞的收缩力[25]和减少钙离子超载[26]造成的细胞损伤。TFH通过多个肾上腺素能受体和多巴胺受体对钙离子信号通路进行调控,提示这可能是总黄酮保护内皮细胞的机制之一。心肌和血管在缺血性缺氧环境下,机体会上调低氧诱导因子(HIF1α)的表达,诱导体内一些血管活性物质,如血管内皮生长因子(VEGF)和内皮素1(endothelin1,ET1)的表达[27]。VEGF在正常血管中无表达,但在动脉粥样硬化斑块中表达显著增加,这也是斑块形成的重要特征之一。而沙棘提取物能显著减少由缺氧诱导的促炎细胞因子和VEGF水平的增加[28],提示TFH能通过调节VEGF信号通路上游靶点(SRC,PIK3CG,PTGS2,MAPK14等)改善机体缺血缺氧状态,从而下调VEGF的表达。缝隙连接和心律失常及细胞损伤等有着密切的关系,在心肌缺血早期给予阻断缝隙连接细胞间通讯,发现可以明显降低随后发生的心肌坏死范围[29]。已有文献报道表明,槲皮素能显著抑制缝隙连接细胞间通讯,从而达到心肌保护的作用[3031]。
TFH其主要有效成分为槲皮素、异鼠李素、山柰素等。目前TFH运用于人体主要是通过口服吸收,故在分子库的准备阶段对沙棘所含化合物进行了口服生物利用度和类药性筛选,然后共得到7个满足条件的化合物,这些化合物良好的口服生物利用度和类药性决定了它们具有很好的成药性,从药物代谢角度上看可以很好代表了TFH的药效。最后以上述7个化合物为研究对象,通过网络药理学的手段分析了上述成分可能的作用靶点及信号通路,初步揭示了其多成分、多靶点、多途径的协同效应的作用特点。本文为下一步深入研究TFH抗心肌缺血药效基础研究及机制研究提供了一定的理论依据。
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