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实验动物学在本校是该专业的一门学科基础选修课,通过实验动物学的课程教学和实验教学,使学生掌握实验动物学的基本理论知识和基本实验技能,了解实验动物学对于生命科学发展的重要意义,了解国内外实验动物学科的发展状况及相应法律法规,培养学生的科研创新能力和解决实际问题的能力,使学生养成科学严谨的实验态度和良好习惯。要求学生能掌握实验动物学的基本理论知识,树立良好的伦理观念,熟悉动物实验的基本操作,对实验动物有深入的了解,能够正确地选择实验动物进行实验。
2实验动物学理论教学的改革
2.1贯彻实验动物标准化、实验动物伦理与福利、实验动物管理政策与法规的理念
随着实验动物管理的不断完善,课题申报、鉴定、文章发表都需要提供相关实验动物的伦理资料证明,对实验动物伦理福利与标准化的要求也日趋严格。因此,在授课过程中应加强实验动物伦理观念的灌输与标准化的介绍。不同国家对实验动物管理和立法有不同的尺度,但都是围绕保障动物福利和实验动物质量两个方面进行的[3-4]。自1988年我国先后了国家和地方法规100余项,《广东省实验动物管理条例》于2010年10月1日起正式实施,是指导本省实验动物管理具体做法的地方法规[5],因此在实验动物管理法规介绍中,不仅要让学生对国内外的实验动物立法有一定的认识,还要重点解读关于广东省实验动物管理法规与实施现状。
2.2在保证实验动物基本知识系统学习的前提下,侧重前沿知识的更新
实验动物技术正朝基因工程技术发展,国内多家大学与研究所都相继建立了先进的模式动物研究平台,如南京大学模式动物研究所的“国家遗传工程小鼠资源库”,北京大学的“转基因/胚胎冷冻平台”、“人类疾病实验动物平台”等。实验动物教学必须随着实验动物研究的发展趋势及时地调整、改革才跟上形势。新的实验动物教学应该使学生既要掌握基本概念和理论知识,熟悉实验动物的实验技术,还要进一步了解实验动物的发展方向、动态及在生命科学中的应用。讲授基因工程动物制作技术及应用,介绍基因工程动物的制做流程、最新的模型种类、相关单位在该研究方向的研究进展等,并鼓励学生多看实验动物方面的研究文献,让学生对基因工程动物的研究方向有一定的认识,并了解国内外相关的研究机构。
2.3科研案例教学培养学生的科研创新思维
实验动物学的理论知识广泛,学习起来容易感觉枯燥,而且很难将理论与实际应用联系在一起,导致教学效果不理想。通过科研案例,使抽象的理论变得生动、具体,既提高学生的积极性,又能培养学生的科研创新思维。科研案例教学应如何实施?授课教师通过收集有关实验动物的科研项目以及文献资料中具有代表性的科研案例给学生举例讲解;随后拟一个研究方向,组织学生动手设计科研课题,由学生自己制订研究的目的、内容与方案,若条件允许可进行方案实施;最后,学生将得到的结果进行总结论述,由授课教师进行打分评价。使学生在实验过程中加深对基本概念和理论知识的理解,从而提高其分析问题和解决问题的能力,将教学和科研有机地结合起来。
3实验教学的改革
3.1强化基本动物实验技术的操作在实验动物教学中,动物实验技术是教学内容的重点之一,所占课时的比重较大,在本校实验动物实验课的学时与理论课学时都为16学时。作为生物专业技术的人才,动物实验技术是必备的实验技术之一,因此动物实验课要求学生对基本的动物实验操作技术必须熟练,坚实的动物实验基础是一切高深动物实验的技术储备。实验动物的基本实验内容,包括正确的抓取、固定、处死方法,各种给药途径,体液的采集和手术方法,不同种属的动物麻醉方法及急救方法等。若经费足够的条件下,在实验动物的选择除了大小鼠、豚鼠、兔子外还应适当增加大动物的实验内容,如犬或猪,让学生熟悉不同动物的生理学、解剖学特性与正确的基本实验操作,该部分课程设置为12个学时。
3.2锻炼动物模型的制作能力,增加实验设计环节
为结合前沿学科的发展,培养学生的创新思维,最后4个学时让学生结合实际应用,自主设计和完成一个实验方案,做一些疾病模型,如肿瘤模型、中风模型、皮肤移植模型等,以培养学生的科研思维和操作能力。实验设计过程由学生查阅资料,拟定具体实验方案和步骤。实施过程中鼓励学生独立思考与团队交流,每一步实验都要求学生仔细观察记录,实验结束后在教师的指导下及时整理、统计实验数据,分析实验结果。通过这一实验环节,不仅能验证学生基本实验操作的熟练程度,还能培养学生的科研思维,解决与分析问题的综合能力。
3.3完善动物实验平台的建设
标准化的实验动物饲养条件和环境质量控制是保证实验动物质量合格的重要条件,也是保证动物实验条件稳定的前提。随着科学研究的发展,对实验动物的要求越来越高,重视实验动物的饲养和研究平台建设,不仅能提高实验教学质量,对于实验动物学科的发展及科研实力的提升更具有重要意义。由于本校没有专用的动物饲育室与动物实验设施,对实验动物的教学与科学研究的发展构成了较大的障碍。为了满足本专业学生的培养要求,应争取上级部门的资金投入,筹划实验动物标准化平台的建设项目,建立属于佛山科学技术学院的实验动物中心,为教学与科研供应高质量的实验动物与提供标准化的实验环境设施。
4结语
关键词:药物筛选 药物安全性评价 课程改革 改革与实践
中图分类号:G64 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2014)11(a)-0159-02
药物的筛选与早期安全性评价永远是新药研究不可缺少的重要环节,建设创新药物高通量筛选体系,建立一些快速、灵敏的早期安全性评价和检测方法,其目的是为了提高药物发现阶段的成功率、避免浪费时间与财力、降低药物开发阶段的风险和成本,促进整个创新药物研制尽早走向成功。国外最新发展趋势就是将以前在药物开发阶段的临床前研究时才进行的安全性评价研究提前到药物发现阶段,也就是在创新药物的早期的发现和选择阶段就进行安全性评价。近年来广东药学院生命科学与生物制药学院根据学校提出的“应用型创新性人才”培养目标,积极探索生物医药领域创新人才培养体系,建立了“国家级生物医药类专业创新人才培养实验区”,经教育部批准设立了“生物制药战略性新兴产业相关特设本科专业”,并在此专业下开设了“药物筛选与评价方向”专业方向,以适应生物医药产业的发展趋势和广东省区域经济对人才培养的需求。
1 药物筛选与评价专业方向的设立
作为我国独立建校的三所高等药科院校之一,广东药学院建立了一整套极具特色的药物研发创新体系,涵盖化学药、中药和生物药,拥有“广东省生物活性药物研究重点实验室”、“广东省生物技术候选药物研究重点实验室”、“广东省药物新剂型重点实验室”等研发平台,为广药特色的人才培养奠定了坚实的后盾。然而,从人才培养方面来看,广东药学院设立了药学、药物制剂、中药学等本科专业,目前还缺乏药物筛选与评价专业方向的人才培养。因此,根据学校以药学为特色和应用型创新性人才培养的思路,根据国家和广东省区域人才需求变化,适时设立生物制药专业药物筛选与评价方向可以与我校现有的药学相关专业人才培养形成有益互补,从而起到完善我校本科人才培养体系的作用。生命科学与生物制药学院在生物医药专业的人才培养方面经历了多年的探索和实践,最初在生物技术专业下开设了生物制药和生物技术安全评估等专业方向。经过近八年的教学实践,成功申报设立了“生物制药战略性新兴产业相关特设本科专业”,并在此专业下开设了“药物筛选与评价方向”。由于药物筛选与评价方向是生物医药领域一个新的专业方向,其人才培养体系没有什么经验可以借鉴,我们结合广东药学院的药学特色和生命科学与生物制药学院自身的教学科研实际情况,对生物药物筛选与安全性评价相关专业课程的理论与实验教学进行了改革,以切实提高人才培养质量。
2 药物筛选与安全性评价相关课程模块化建设
在“药物筛选与评价”专业方向的人才培养方案制定过程中,我们以应用型创新性生物制药专业人才为培养目标,根据教学实施效果和区域经济人才需求的变化不断优化和调整课程体系,对人才培养方案进行了多次论证和修订。通过人才培养方案的制定将本专业的核心课程分成三大模块:生物技术模块、药物筛选与评价模块和生物制药模块等三大模块,分别致力于培养学生具有扎实的生命科学理论与技术、药物筛选与早期安全性评价技术和生物药物研究与开发技术等专业技能,其中生物技术模块主要包括分子生物学、细胞生物学、基因工程等课程,生物制药模块主要包括生物技术药物学、药理学、药剂学等课程,药物筛选与评价模块主要包括模式生物与新药研究、实验动物学、毒理学、新药临床前安全性评价等课程。生物技术模块和生物制药模块经过多年的建设已经形成了比较成熟的理论和实验教学体系,而药物筛选与评价模块则是新设立的一个模块,且在三大专业课程模块中起到承前启后的作用,其相关课程的理论和实验教学方式方法都有待于深入研究,以探索切实可行的理论和实验教学模式。
3 以任务为导向的理论课程的交叉融合
“药物筛选与安全性评价”的知识体系贯穿于模式动物与新药研究、实验动物学、毒理学和新药临床前安全性评价等课程当中,而传统的教学方法习惯于将各门课程相对独立地隔离开来,从而给教师的教学和学生的学习带来困难。理论课程改革的首要问题是确定课程目标,以任务为导向打通各门课程界限,围绕“药物筛选与安全性评价”这一主线,加强课程内容的交叉融合,提升教师和学生对专业的理解和掌握。为了提高应用型创新人才培养的质量,在模式生物与新药研究、实验动物学、毒理学和新药临床前安全性评价等课程的教学过程中对每门课程的教学内容进行重新梳理,确立每门课程的教学目标。
模式生物与新药研究是“药物筛选与安全性评价”课程模块的基础课程,且没有相关的教材可以利用,课程内容主要结合当前药物研究的最新趋势介绍果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠等模式生物在药物早期筛选与评价中的应用。药物的安全性评价离不开实验动物,实验动物学的任务是介绍常用来进行药物安全性评价的实验动物的种类、实验动物的饲养、实验动物的基本操作技术。毒理学的教学主要教授药物在实验动物身上的毒性反应,特别是对不同靶器官的毒性作用,课程教学要求在了解生物药、化学药和中药的毒性机理的同时,突出对不同种类生物药物的毒性机制的掌握。新药临床前安全性评价发展很快,新的技术不断涌现,新的药物也层出不穷,根据该课程的特点采用案例教学法,课程内容主要集中在重组蛋白药物、治疗性单克隆抗体类药物、基因工程疫苗、基因治疗与核酸药物和细胞治疗药物等生物药物的安全性评价的讲授。
我们在前期的研究中积极探索如何创造性地根据每门课程性质采用不同的教学方法,设计最为合理而有效的手段和方法施教,从而提高教学质量。尝试通过集体教研活动等形式充分发挥教师团队合作精神,集思广益,取长补短,创造一个教师之间和教师与学生之间交流的平台,开展 “三段式”集体备课、让学生代表参与集体教研活动以及时听取学生的声音。具体的课堂教学中,根据药物筛选与早期评价课程模块应用性较强的特点,在教学大纲的指导下,及时追踪技术前沿、应用专题汇报、案例剖析等方式实施教学。
4 设计性与综合性实验的开设
药物的筛选与早期评价领域主要包括药物的有效性与安全性两个方面,其主要内容是利用秀丽线虫、斑马鱼等模型对药物的有效性、生物利用度和毒性等方面进行评价,包括应用分子生物学、细胞学、免疫学、器官与组织试验等技术手段开展候选药物的体内和体外的有效性检测分析,采用ELISA、HPLC、LC-MS/MS、生物测定等方法分析体内和体外实验中化合物早期生物利用度、代谢特征和组织分布,通过早期的遗传毒性试验、急性毒性试验、胚胎毒性试验、心脏毒性试验等毒性试验快速筛选出毒性较小的候选药物。
“药物筛选与安全性评价”课程模块的内容和性质决定了其实践性强的特点,为了让学生切实掌握生物药物的发现及安全性评价的具体方式、方法和步骤,实践教学具有不可替代的作用。在人才培养方案的修订过程中,我们特意加大了实验课时的比例,希望通过强化学生的实验动手能力来提高应用型人才的培养质量。通过前期的组织论证,我们决定在模式生物与新药研究课程的实验教学中结合学院教学科研实际情况,充分利用学院高通量药物筛选科研平台,开设模式生物与新药筛选设计性实验。同时,将实验动物学、毒理学和新药临床前安全性评价三门课程的实验进行整合,开设跨课程综合性和设计性实验。通过设计性和综合性实验的开设让学生系统地了解生物药物筛选与早期安全性评价的整个流程。
在模式生物与新药研究课程的实验教学中,我们利用学院已经建立起来的高通量药物筛选平台,鼓励学生在教师的指导下围绕新药筛选这一主题独立、创新设计研究方案和撰写计划书,结合相关课题组的研究方向和学生的研究兴趣自主分组设计实验,然后组织学生答辩从中挑选优秀的实验方案进行实施。通过设计性实验的开设加强学生对理论课知识的理解,锻炼了学生的团队协作精神,激发了学生的学习热情和创新性思维,而且提高了学生实验操作能力。
在实验动物学、毒理学、新药临床前安全性评价等课程的实验教学中围绕特定生物药物毒性检测这一主题,充分发挥我院学科特色和科研促进教学的教学模式,将学院的专利成果TCR基因药物的安全性评价引入到学生实验教学,开展“生物药物安全性评价”综合性实验。在实验设计与实施过程中加强分工合作,协调实验动物学、毒理学、新药临床前安全性评价等课程的任课教师,以及实验中心的老师,明确各位老师的职责,分别负责各专题预实验,责任到人。并就实验的内容安排、结果评价、课时分配、规范操作、操作重点、难点及注意事项、改进意见和建议等提交预实验报告,由课程负责人教研活动讨论并确定最终实验方案,分头编写实验指导、教学大纲、授课计划等。在每次任务完成后,对于学生的收获和不足进行积极的反馈,指导其发扬优点,改正缺点。通过问卷调查对实施效果进行分析总结,为实验的进一步改革提供参考。让学生能将理论课中掌握的基本知识在综合性实验的学习过程中融会贯通,其根本目标是突出应用理论与技能的系统训练,强调科研素质的塑造、创新思维和创业能力的培养。
通过生物药物筛选与安全性评价课程模块理论与实验的改革与实践,加强本专业方向内涵建设,初步建立了有利于培养学生创新创业能力的生物制药专业药物筛选与评价方向人才培养体系,为培养符合社会需求的多样化生物医药类专业创新人才提供了经验借鉴。
参考文献
关键词:固本健脑法;老年健忘模型;Na+-K+-ATP酶;SOD;MDA
中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1673-7717(2011)12-2702-03
Effect of Expression of Na+-K+-ATPase in Cortex And SOD And MDA in Blood serum
of The Forgetful Model in Aged Rat With Treatment of Consolidating Root And Nourishing Brain
MA Zuofng,JIANG Ruixue,ZHANG Liutong,WANG ping
(The College of Traditional Chinese Medicine of Hubei,Wuhan 430065,Hubei,Chikna)
Abstract:Intraperitoneal injection of D-galactose and NaNO2 was used for manufacturing forgetful old rats. Treat Animal Models with prescription on nourishing spleen and strengthening brain and prescription on nourishing kidney and strengthening brains and prescription on consolidating root and nourishing brains. Detect in all groups Cortex Na+-K+-ATPase, SOD and MDA in blood serum. Research the mechanism about treatment of consolidating root and nourishing brain to improve learning and memory function in rats.
Key words:Treatment of Consolidating Root and Nourishing Brain;The Forgetful Model in Aged Rat;Na+-K+-ATPase;SOD;MDA
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收稿日期:2011-08-21
基金项目:湖北省教育厅青年骨干教师资助项目(2007C360533)
作者简介:马作峰(1967-),男,河南南阳人,副教授,医学博士,研究方向:中医药延缓衰老、藏象学说应用及脑病防治。
通讯作者:王平(1962),男(土家族),湖北恩施人,教授,医学博士,研究方向:脑病的中医药防治、中医治则治法及病因病机研究。运用固本健脑法改善老年健忘的记忆功能是课题组长期坚持的研究方向,现已积累了大量的临床经验。前期的研究业已证明,固本健脑方可以通过调节海马神经递质水平、影响海马脑区c-fos基因表达等途径,提高模型动物的记忆功能。为了考察该方是否对大脑皮层的能量供应系统产生影响,固本健脑法是否具有抗氧化功能,课题组又开展了本次研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物及模型制作
清洁级健康雄性Wistar大鼠,雌雄各半,3月龄,体重(200±20)g,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,批号:0016152。适应性饲养1周后,用跳台法初筛,选成绩相似者,完全随机法分为正常对照组(15只)、模型组(60只)。参考文献\[1\]稍加改变。模型组大鼠腹腔注射D-半乳糖120mg·kg-1·d-1(生理盐水配制成240mg·mL-1)和NaNO290mg·kg-1·d-1(双蒸水配制成180mg·mL-1),连续40d,正常组大鼠腹腔注射2mL的生理盐水溶液。
造模结束后,分别用跳台法和Morroise水迷宫法比较正常对照组和模型对照组动物行为学指标,以正常对照组成绩明显优于模型对照组(P
1.2 给药方法\[2\]
各给药组大鼠在水迷宫检测造模效果以后,每天分别灌胃固本健脑方、补脾健脑方、补肾健脑方水煎液;正常对照组和模型对照组大鼠灌胃2mL的生理盐水溶液,连续20天。
固本健脑方由党参、杞果、何首乌、茯苓、山楂、石菖蒲等药物组成;补脾健脑方由党参、茯苓、山楂、石菖蒲等组成;补肾健脑方由杞果、何首乌、山楂、石菖蒲等组成。所有药物均购自南阳市医药公司,经中药鉴定专家鉴定,均为正品。按人与动物体表面积折算法,算得大鼠等效剂量分别为每公斤体重50g生药(固本健脑方)、40g生药(补脾健脑方、补肾健脑方),以用5倍于药材的冷水浸泡20min,然后用武火煎至水沸,改用文火煎煮40min,滤出药液加冷水适量,煎至水沸,改用文火煎煮30min,滤出药渣,将两次煎取药液混匀,浓缩成每毫升含生药2.5g(固本健脑方)和2g(补脾健脑方、补肾健脑方)的药液,3种药液均置冰箱0~4℃保存。每次灌胃2mL,每天灌胃1次。
1.3 主要仪器试剂
超微量ATP酶(Na+-K+)试剂盒,批号20100115,南京建成生物工程公司;SOD试剂盒,批号20101113,南京建成生物试剂公司;MDA试剂盒,批号20071017,南京建成生物试剂公司;SSW型微电脑电热恒温水槽,上海博迅实业公司生产;752型紫外光栅分光光度计,山东高密分析仪器厂;GL21M型高速冷冻离心机,长沙湘智离心机仪器有限公司;752型紫外光栅分光光度计,山东高密分析仪器厂;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机,宁波新芝生物科技股份有限公司;FC204型电子天平,上海精科实业公司。
1.4 实验方法\[3\]
给药结束后,各组动物均禁食12h,每组的1-10号动物断头取血后(11-15号动物做免疫组化切片),迅速于冰块上打开颅腔,取出全脑放在下面垫有冰盘的滤纸上,用生理盐水将脑上的血液冲洗干净。然后用刀片延大脑半球后端与小脑之间的横裂切掉小脑,延大脑纵裂切开,使大脑两个半球分开,再小心剥取大脑皮层,用生理盐水冲洗干净,精确称重后,在冰水浴中加入10倍量(W/V)的预冷生理盐水匀浆。以10000r/min离心20min,按试剂盒说明书提取细胞膜测Na+-K+-ATP酶活性。
ATP酶测定原理:ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷(Pi),测定Pi的量可判断ATP酶活性。ATP酶活性单位以每毫克组织蛋白(Pr)每小时新产生的Pi的量为酶活性单位μmolPi·mgPr-1·h-1。
断头取血,3000r·min-1离心10min,取血清按试剂盒说明书中方法,测定超氧化物岐化酶(SOD)的活力和丙二醛(MDA)的含量。
总SOD活力(μ/L)=3.33/0.03/50%×(对照-测定)/对照组=222×(对照-测定)/对照组。
MDA含量(nmol/mL)=10×(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)。
1.5 数据处理
实验结果均以±s表示,采用SPSS 15.0软件包进行数据处理,以P<0.05为显著性标准,采用单因素方差分析,LSD法组间两两比较。
2 实验结果
2.1 大脑皮层组织Na+-K+-ATP酶活性检测
结果见表1。
2.2 血清SOD活性检测
结果见表2。
2.3 血清MDA含量检测
结果见表3。
注:与模型组比较,#P<0.01;与固本组比较,P>0.05。
3 讨 论
Na+-K+-ATP酶是生物膜中最为重要的酶,它在维持膜通透性、维持膜内外离子成份平衡,以及维持细胞正常代谢等方面起着重要作用。它通过水解ATP逆化学梯度转运离子,是维持神经元兴奋传导、突触传导的物质基础。体内自由基可直接氧化酶蛋白氨基酸残基,使酶失活。进而造成神经元细胞内Na+及Ca2+的积聚,K+流失,使细胞内环境紊乱,加重细胞的损伤。
与正常组比较模型组动物大脑皮层Na+-K+-ATP酶活性极显著降低(P<0.01),说明运用D-半乳糖和亚硝酸钠,导致动物学习记忆能力明显减退的机制之一是抑制了大脑皮层Na+-K+-ATP酶活性。补脾组和固本组活性均高于模型组(P<0.01或P<0.05),但补肾组与模型组差异无显著性(P>0.05),说明在提高皮层Na+-K+-ATP酶活性方面,补脾疗效优于补肾。固本组活性与正常组比较差异无显著性(P>0.05),说明固本法可以使Na+-K+-ATP酶活性接近正常。
上述结果说明,固本法改善老年记忆的作用机制之一是调节大脑皮层Na+-K+-ATP酶活性,使脑部能量供应处于较高水平,进而达到增智健脑的作用。
自由基在衰老过程中起着重要的作用,机体进行新陈代谢时自由基不断生成,但又迅速清除,两者处于平衡状态。若此动态平衡受到破坏,自由基在体内生成过多或清除过慢,则过剩的自由基可对机体的生物大分子进行破坏,导致组织器官功能紊乱。自由基的毒性可表现为脂质过氧
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收稿日期:2011-07-18
基金项目:浙江省教育厅科研计划资助项目(Y 200906284)
作者简介:蒋剑平(1977-),男,浙江绍兴人,药学博士,主管中药师,研究方向:中草药活性物质研究。化,即发生在不饱和脂肪酸共价键上的一系列自由基反应,丙二醛(MDA)是不饱和脂肪酸过氧化作用终产物,它在血清中的含量,间接反映了自由基反应时组织的破坏程度。体内自由基清除有赖于灭活自由基有关的酶类,超氧化物歧化酶(SOD)是超氧化物自由基强有力的清除剂,为体内惟一能直接淬灭自由基的酶,在抗自由基损伤中起着重要作用。
本实验结果显示,模型组动物SOD活性明显低于正常组(P<001),说明其清除自由基能力降低,与衰老的表现一致。补脾组和补肾组SOD活性高于模型组,但无统计学意义,似与样本过少有关;固本组明显高于模型组(P<0.05),但不及正常组(P<0.01),说明补脾、补肾和固本法都有提高机体抗氧化能力的作用,尤以固本组疗效最好。
从表3结果可以看出,模型组动物血清MDA含量明显高于正常组(P<0.01),说明其体内不饱和脂肪酸的过氧化最为严重。各给药组MDA含量有不同程度降低,但3组之间的差异无意义,说明3种治法在阻断不饱和脂肪酸过氧化方面疗效相当。与SOD检测结果结合起来判断,补脾组和补肾组虽不能提高SOD活性(与模型组比较P>005),但却可以减低MDA含量,显示补脾肾抗氧化的途径并非只有提高SOD活性这一种途径。
上述实验结果说明,老年健忘动物的记忆功能与体内SOD活性成负相关,与MDA呈正相关,说明健忘的产生与机体抗氧化能力减退有关,而固本健脑方改善记忆的机制之一可能是提高了机体抗氧化能力。
参考文献
[1] 张丹,张建军.长苞凹舌兰提取物对亚急性衰老小鼠学习记忆和凋亡相关蛋白表达的影响\[J\].中国药理学与毒理学杂志,2005,19(4):259-262.
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关键词:白花丹参水提物; D-半乳糖学习记忆
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2011)04-0884-02
Effect of Aqueous Extract of Salvia Miltiorrhiza Bge. F. alba on the
Improvement of Learning and Memory Disturbance in Senile Mice
LI Ju-cang【sup】1【/sup】,ZHENG Hui【sup】2【/sup】,WANG De-cai【sup】1【/sup】,WANG Hao【sup】1【/sup】
(1.School of Pharmacy,Taishan Medical College,Taian 271016,Shandong,China,
2.School of Science,Zaozhuang Vocational College Science and technology, Tengzhou 277500,Shandong,China)
Abstract:Objective:To study the effects of aqueous extract of Salvia miltiorrhiza Bge. F.alba on the improvement of learning and memory disturbance in senile mice.Methods:The mice were ig aqueous extract of Salvia miltiorrhiza Bge. F. alba for six weeks continuously. The learning and memory ability of senile mice which was caused by D-galactose were determined with Y-maze test and step-down test,and autonomic activities test.Result:The aqueous extract of Salvia miltiorrhiza Bge. F. alba improved the learning and memory function of dysmnesia mice caused by D-galactose(P
Key words:salvia miltiorrhiza bge. F. alba;Aqueous extract;D-galactoselearning and memory
收稿日期:2010-11-22
作者简介:李聚仓(1984-),男,山东菏泽人,硕士研究生,研究方向:中药药理学。
通讯作者:王德才(1962-),男,教授,研究方向:中药药理学。
白花丹参(salvia miltiorrhiza bge. F.alba.C.Y.wu.et H・W・Li)是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的变种,主要分布于山东境内泰山山脉及其周边地区,已被列为“泰山珍稀濒危物种”【sup】[1]【/sup】。白花丹参味苦,微寒,归心、肝经,有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功能【sup】[2]【/sup】。研究表明,丹参及复方丹参注射液能明显提高实验动物的学习记忆能力,而丹参酮能改善阿尔茨海默病样大鼠学习记忆障碍【sup】[3-4]【/sup】。
白花丹参具有丹参的作用和用途,故白花丹参也应该有提高实验动物的学习记忆能力。通过本实验中观察白花丹参水提物对正常及半乳糖导致学习记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的影响,并对其机制进行初步探讨,以期为白花丹参的应用提供科学依据。
1 材 料
1.1 实验动物 昆明种小鼠,体质量28~33g,全雄性,购于山东中医药大学,生产许可证号:scxk(鲁)20050015。
1.2 仪器与试药 Y迷宫刺激器(安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司产品);ZIL-2小鼠自主活动实验自动控制仪(由中国医学科学院药物研究所研制);白花丹参水提物(白花丹参于秋季采自泰山东麓,经泰山医学院苏延友教授鉴定。将白花丹参根清洗干净晾干,用粉碎机粉碎,取适量粉末置于煎煮容器内,加入10倍药材量的冷纯化水浸泡24h,强火煮沸,再以文火煎煮30min,过滤虑渣加5倍量纯化水继续煎煮,强火煮沸后改文火再煎煮20min,过滤。合并两次滤液,经旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩而成。临用时以纯化水配成所需浓度)D-半乳糖(上海试剂二厂生产,批号:20080927);
2 方 法
2.1 实验动物分组与给药 将50只昆明种小鼠随机分为空白对照组、模型组及高、中、低剂量治疗组,每组各10只。除空白对照组外,其余各组均皮下注射D-半乳糖0.12g/(kg・d)。同时高、中、低剂量组分别予白花丹参水提液40、20、10g/(kg・d)灌胃,模型组和空白对照组给予0.1L/(kg・d)蒸馏水灌胃,连续42d。
2.2 Y型迷宫测试【sup】[5]【/sup】 实验在3等分的Y型迷宫进行,迷宫3个末端小区可分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。当Ⅰ作为起步区时Ⅲ作为安全区,当Ⅱ作为起步区时Ⅰ作为安全区,当Ⅲ作为起步区时Ⅱ作为安全区依次轮换。小鼠受到电击后,直接由起步区逃至安全区为正确反应,否则均属错误反应。以1个实验日内完成10次反应中错误次数作为学习成绩,24 h后重复测验,记录错误次数为记忆成绩。
2.3 跳台测试【sup】[6]【/sup】 将小鼠放入跳台箱内安全台上,先适应环境3min,然后通电,小鼠受到电击后会自动跳上安全台,逃避电击。以小鼠跳下安全台为错误反应,受到电击后小鼠会跳回安全台。以小鼠第1次跳下时间作为反应期,并记录5min错误次数,此成绩作为学习成绩。24h后直接将小鼠置于平台上,记录小鼠潜伏期及每只小鼠5min的错误次数,此成绩作为小鼠记忆成绩。
2.4 自动活动测试【sup】[7]【/sup】 将小鼠放入自主活动程序测定仪活动箱中,每个活动箱中1只,放入后先适应2min,自动记录小鼠3min内的活动次数。
2.5 统计学方法 采用SPSS 11. 0统计软件处理。数据均以±s表示,分别进行单因素方差分析。
3 结 果
3.1 Y型迷宫测试结果 与生理盐水对照组相比,模型组的学习和记忆出现的错误明显增加,差异具有统计学意义。说明模型成功。与模型组相比较,白花丹参高、中剂量组均能明显减少学习时的错误次数,有统计学意义3个剂量组均能明显减少小鼠记忆时的错误次数,有统计学意义。提示白花丹参具有改善D-半乳糖衰老小鼠所致的学习和记忆障碍的作用。详见表1。
表1 Y型迷宫测试结果(n10,±s)
注:与生理盐水组相比,*P
3.2 跳台测试结果 与生理盐水组相比,模型组学习的反应期和记忆的潜伏期明显延长,学习和记忆测试时出现的错误次数明显增多,差异均具有统计学意义。说明造模成功。与模型组相比较,白花丹参在剂量为10、20g・kg【sup】-1【/sup】时均可明显延长学习的反应期和记忆的潜伏期,学习和记忆测试时出现的错误次数也明显增多,均具有统计学意义。提示白花丹参具有改善D-半乳糖所致衰老小鼠的学习和记忆障碍的作用。相见表2。
表2 各组小鼠跳台测试成绩(n10,±s)
注:与生理盐水组相比,*P
表3 小鼠自主活动测试结果(n10,±s)
注:与生理盐水组相比,*P
3.3 小鼠自主活动测试结果 与生理盐水组相比,模型组小鼠自主活动数明显降低(P
4 讨 论
D-半乳糖所致学习、记忆障碍衰老模型是最常用的模型之一。D-半乳糖是机体正常的营养成分,在一定时间内,连续给动物注射大剂量的D-半乳糖,机体细胞内的半乳糖浓度就会过多,这些半乳糖可由半乳糖氧化酶催化生成醛糖和过氧化氢,产生超氧阴离子。醛糖在醛糖还原酶的催化下,还原成不能被细胞进一步代谢的半乳糖醇,从而堆积在细胞内,影响正常渗透压,导致细胞肿胀重要器官代谢障碍,最终出现衰老。另一方面过量的氧自由基使细胞膜脂质受损,导致脑神经元退行性变,神经元数目减少、脑组织中过氧化物歧化酶(SOD)活性下降及丙二醛(MDA)、脂褐素升高等,造成动物学习记忆能力下降及机体衰老【sup】[8-9]【/sup】。白花丹参具有祛瘀镇痛、活血通经、凉血消肿、清心除烦等功能,是中医传统使用的活血化瘀药,被广泛用于防治心脑血管病。有研究表明丹参酮能改善阿尔茨海默病样大鼠学习记忆障碍【sup】[3-4]【/sup】。
本实验通过D-半乳糖所致学习、记忆障碍衰老模型,观察白花丹参水提物对小鼠学习、记忆障碍的影响。本实验通过Y迷宫测试,白花丹参高、中剂量组均能明显减少学习时的错误次数;3个剂量组均能明显减少小鼠记忆时的错误次数。跳台实验发现白花丹参在剂量为10、20g/kg【sup】-1【/sup】时均可明显延长学习的反应期和记忆的潜伏期,学习和记忆测试时出现的错误次数也明显增多;自主活动显示白花丹参三个剂量组均可明显增加小鼠自主活动数。三种方法均表明白花丹参能明显改善记忆障碍的衰老小鼠的学习和记忆能力。
综上所述,白花丹参水提物具有明显的保护D-半乳糖所致小鼠衰老的作用,具有提高衰老小鼠的学习记忆能力,在抗衰老方面,有着可观的发展和开发前景。
参考文献
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[5] 王浩,高允生,张庆乐,等.白花丹参水提物促进小鼠学习记忆作用研究[J].医药导报.2009,28(2):173-175.
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