动物行为学方法
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动物行为学方法范文第1篇
【关键词】 灯盏花素 再灌注损伤 行为
［ABSTRACT］Objective To investigate the effect of breviscapine on the ethological index after cerebral ischemia/reperfusion in gerbils. Methods A cerebralischemiareperfusion model of gerbils was established， ischemia time being 10 minutes. Gerbils were randomised to shamgroup， control group and breviscapine group. They were further pided into four subgroups， eight in each group. Reperfusion was carried out in the latter two groups， which lasted for 1， 2， 4， and 7 d， respectively. The ethological index of gerbils was counted by the open field method after reperfusion. The brain temperature in all gerbils was kept at(37.2±0.2) ℃ during the experiment. Results After different time of reperfusion， the score of ethological index in control group was higher than that in shamgroup， that in breviscapine group was higher than shamgroup， but was lower than control group. Conclusion Breviscapine could reduce cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils by attenuating the changes of the behavioral marks.
［KEY WORDS］ Breriscapine; Reperfusion injury; Behavior
脑缺血再灌注损伤及其防治的研究一直为国内外学者所关注，至今未获得重大进展。低温具有确切的脑保护作用，但其本身存在诸如增加血黏度、干扰微循环、引起心律失常等副作用。灯盏花素注射液是一种中成药，具有蛋白激酶C（PKC）抑制作用，同时具有降低血黏度、改善微循环之功效。有研究表明，灯盏花素可减轻脑缺血再灌注损伤。本研究就灯盏花素对沙土鼠脑缺血再灌注后相关行为学指标的影响做进一步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作
沙土鼠24只，体质量(50～70)g，雌雄不拘。戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，将动物俯卧于手术台上，自头顶部切开皮肤，于矢状缝外2 mm、前囟后2 mm处，用细钻钻洞（不钻透脑膜），置入自制电极，用牙托粉固定。电极接多功能脑电监护仪监测脑电图，以判断是否造成沙土鼠前脑缺血。然后将动物仰卧于实验台上，切开颈部正中皮肤，仔细分离双侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断颈总动脉造成前脑缺血，松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注[1，2]。脑缺血时间10 min。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。各组动物在脑缺血再灌注期间均将其放入恒温箱中，以使脑温控制在（37.2±0.2）℃。
1.2 动物分组
将动物随机分为假手术组、对照组和灯盏花素组，每组8只动物，后两组再根据再灌注时间分为再灌注1、2、4、7 d等4个亚组。灯盏花素组于脑缺血前30 min和再灌注后6 h时腹腔注射灯盏花素注射液90 mg/kg（云南省生物制药厂），假手术组和对照组动物在相同时间点注射等容量的生理盐水。
1.3 相关行为学指标检查
沙土鼠脑缺血再灌注后1、2、4和7 d应用开阔法观察其行为学变化，开阔法检查所用的迷宫尺寸为76 cm×72 cm×57 cm，划分为25个方格。检查时将沙土鼠放于正中格中，记数其10 min内爬过的格子数。每次检查时保持房间安静和室内灯光强度一致。
1.4 统计学处理
数据均以±s表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
沙土鼠脑缺血再灌注后1、2、4和7 d，假手术组行为学评分为244±51，对照组行为学评分明显高于假手术组（t=5.399～11.372，P
3 讨 论
沙土鼠因缺乏Willis动脉环，阻断双侧颈总动脉可造成前脑缺血，故被广泛应用于脑缺血的实验研究。但近来的研究发现，部分沙土鼠存在解剖学变异，阻断双侧颈总动脉不易造成前脑缺血[3]。
灯盏花素注射液是从云南灯盏花全草中分离所得，其主要成分是黄芩素甙。有研究表明，灯盏花素具有PKC抑制作用[3]，同时其还可降低血黏度、改善微循环。另有研究表明，灯盏花素可减小大脑中动脉阻断后皮质梗死灶的体积，减轻脑缺血再灌注损伤[4～6]。
开阔法是检查沙土鼠脑缺血后神经功能障碍的常用方法之一。海马在维持动物的学习、记忆和空间定位能力等方面发挥着重要作用，当海马功能受损时，表现为探索活动活跃。海马对脑缺血特别敏感，短暂的脑缺血即可造成海马神经元死亡。本实验结果显示，沙土鼠脑缺血10 min再灌注1、2、4和7 d后，对照组的行为学评分明显高于假手术组，提示脑缺血引起海马神经元功能受损，导致沙土鼠探索活动次数增加。而缺血前应用灯盏花素沙土鼠行为学评分尽管高于假手术组，但明显低于对照组，证实灯盏花素可减轻脑缺血再灌注损伤。
【参考文献】
[1]陈群，曾因明，顾卫东，等. 浅低温对沙土鼠脑缺血再灌注后能量代谢和羟自由基产生的影响[J]. 中国病理生理杂志， 2001，17：134138.
[2]董瑞剑，赵仁亮，沈若武. 大鼠实验性脑缺血耐受模型的建立与评价[J]. 齐鲁医学杂志， 2007，22：320322.
[3]余国平，方敏，陈慧珍，等. 蒙古沙土鼠完全性脑缺血模型的研究[J]. 微循环杂志， 1997，7：2122.
[4]徐光，张礼萍，沈慧芬，等. 野黄芩甙元及其类似物对蛋白激酶C的抑制作用[J]. 上海医科大学学报， 1993，20：187191.
[5]帅杰，董为伟. PKC抑制剂灯盏花素对脑缺血再灌注损害的作用研究[J]. 中国药理学通报， 1998，14：7577.
动物行为学方法范文第2篇
【关键词】神经病理性疼痛；脊髓背角；P物质
The increase of substance P expression in dorsal horn of spinal cord in rats with chronic constriction nerve injury
ZHANG Rui,WANG Qing-xiu,GUO Hui-qing，et al.Department of Anesthesiology,affiliatedDongfeng Hospital of Shiyan YunYang Medical College,Hubei，442008,China
【Abstract】 Objective To observe the expressive variety of substance P in the dorsal horn of spinal cord on neuropathic pain by chronic constriction injury(CCI).Methods Sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups:CCI group,control group.Record the responsiveness to mechanical and thermal stimuli before and after sciatic nerve constriction injury.Immuno-histochemistry technique was used to measure the expression of substance P in the dorsal horn of spinal cord at 3th,7th,14th,28th days following sciatic nerve constriction injury.Results The rats’ responsiveness to mechanical and thermal stimuli and pain behavior were significantly increased on postoperative days after sciatic nerve ligation compared with preoperative(P
【Key words】Neuropathic pain；Dorsal horn of spinal cord；Substance P
疼痛性疾患是困扰人类健康的严重问题，其中慢性疼痛是常见的病理痛之一,在慢性疼痛中，神经源性痛(neuropathic pain)的治疗至今仍缺乏有效的治疗手段，其机制也未能完全阐明，是临床面临的一大难题[1] 。P物质(substance P,SP)是速激肽家族中重要一员，广泛分布于中枢神经系统和外周组织中。在脊髓，P物质是公认的与伤害性信息传导密切相关的神经活性物质[2]，本实验旨在观察坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)后大鼠痛行为学改变和脊髓背角SP 含量变化,探讨SP 在CCI后可能的作用。
1 材料与方法
1．1 对象 本实验在郧阳医学院实验中心及动物中心完成。成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(郧阳医学院实验动物中心提供)，体质量150~200 g。
1．2 CCI［坐骨神经慢性压迫性损伤］模型的建立 按Bennett 等的方法,SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉(30~40 mg/kg)后,常规消毒右下肢,找到坐骨神经主干,用4-0铬制羊肠线松扎四处,间距为1 mm,结扎线以不影响神经外膜的血运为度。术毕立即腹腔注射青霉素20万U。
1．3 动物分组及观察指标 SD雄性大鼠60只,随机分为:A组：CCI组(30只)； B组：对照组(30只)，对照组除坐骨神经不结扎外，其他操作同CCI动物。
观察指标：于术前、术后3、7、14、28 d 测定大鼠热痛阈、机械痛阈值及行为学评分。于术后3、7、14、28 d 每组取3只，麻醉后麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定，取L4-6段脊髓，以备免疫组化，测定SP的变化。
1．4 动物疼痛行为学测定
1．4．1 整体行为学评分 参照Attal等的评分方法,通过观察动物行为及损伤侧爪部姿势判断自发性疼痛程度。
1．4．2 机械痛阈的测定 采用YLS-3E 电子压痛仪(正华公司,中国)测定双后肢机械痛阈。设定增量压力10 g/s。大鼠放在有机玻璃框架中,待鼠安静,探针对准大鼠后足掌心，启动开始键，至大鼠嘶叫，记录该刻值，即为机械痛阈阈值。术侧与健侧各测量5次,每次间隔5 min，取平均值。
1．4．3 热痛阈的测定 采用ZH-LUO/B辐射光热测痛仪(正华公司,中国)测定大鼠足底热痛阈。设定辐射热强度：49 I.R；实际照度：180 mW。记录辐射照射开始到抬足的时间，该时间即为热痛阈。单次光照射时间不超过30 s，间隔5 min，术侧与健侧各测定5次，取平均值。
1．5 脊髓背角SP的免疫组织化学测定及分析
①石蜡冠状切片，脱蜡入水，3％H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗3 min×3次；
②微波炉(中档)修复3 min，室温冷却60 min，蒸馏水洗3 min×3次，0．01 mol/L,pH 7．4 PBS漂洗3 min×3次 ；
③滴加 3％H2O2 水溶液，室温15 min，蒸馏水洗3 min×3次，0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次 ；
④滴加30 μl正常羊血清，室温孵育15 min；
⑤甩掉血清，滴加30 μl 1:100 SP抗体，空白对照片加30 μl抗体缓冲稀释夜,湿盒内4℃过夜；
⑥0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次；
⑦滴加链霉卵白素-辣根过氧化物酶(HRP-Streptavidin)，室温孵育15 min；
⑧0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次；
⑨DAB溶液(用前现配)染色3~5 min；
⑩自来水充分冲洗；
B11苏木素复染1~2 min；
B12自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；
B13应用Geica QwinV3图像分析系统进行计算机图像分析处理，选用免疫阳性反应物的累积光密度值进行统计分析。
1．6 统计学方法 用Excel和SPSSv13．0软件进行统计学分析，实验结果以均数±标准差”(x±s)表示。组间比较采用成组t检验，组内比较用配对t检验进行分析，P
2 结果
2．1 疼痛整体行为学评分 A组大鼠从术后第3天起,行为学评分明显高于对照B组，第7天最明显，组间差异具有统计学意义(P
2．2 机械痛阈值与热痛阈值变化 机械痛阈值与热痛阈值术后各时间点A组均显著低于对照B组(P
2．3 脊髓背角SP的表达免疫组织化学结果表明，手术侧脊髓后角，A组术后术侧明显高于B组(P
3 讨论
在脊髓，P物质(substance P,SP)是公认的与伤害性信息传导密切相关的神经活性物质[2]，含有它们的初级神经纤维及末梢主要终止于脊髓背角浅层，并与接受伤害性刺激的投射神经元形成直接或间接的联系[3]。SP不仅传递伤害性信息,而且在脊髓痛觉调制中具有重要作用[4]，它与兴奋性氨基酸一起介导伤害性初级传入向脊髓背角的传递[5]，近年来体微电极技术可精确定位刺激引起的SP在脊髓背角释放[6]。Yezierski [7]等证明SP与脊髓损伤后的中枢性疼痛有关。在活体，激活了C纤维后，许多神经肽类物质释放，如SP、CGRP、血管活性肠肽VIP、生长抑素和谷氨酸[8]，这些递质递质作用于受体后，改变疼痛行为。SP作用于突触后膜NK1受体，加强伤害性信号传递。神经激肽NK1与NK2受体是伤害感受中最重要的受体[9],当脊髓内同时注射SP和谷氨酸时，产生显著的，相互增强的致痛反应[10]。神经损伤后，C纤维兴奋性增加，SP大量释放，作用于脊髓背角的NK1受体，NK1受体激活后，激活磷脂酶C，使细胞内的三磷酸肌醇IP3和二酰基甘油DAG的浓度增加。IP3动员内质网内的Ca2+储库，使细胞内游离Ca2+的浓度增加,使NMDA受体激活。在L5、L6脊神经结扎前、后损伤NK1受体表达神经元，能减轻神经源性痛，说明NK1受体神经元参与背角神经元的敏化[11]。
外周神经损伤常引起慢性神经病理性疼痛，表现为持续自发性疼痛和痛觉过敏，外周和中枢的敏化是其病理基础。本研究显示CCI大鼠于术后3 d出现疼痛行为学变化和热刺激痛觉过敏、机械性痛敏，7 d达高峰，在后续较长的时间内维持稳定，表明形成了较为典型的神经病理性痛；在疼痛产生的不同时间点，观察SP的表达变化，本研究发现CCI后术侧脊髓背角SP与对照组比均明显升高，术侧明显高于健侧(P
参考文献
［1］ BridgesD,ThompsonSWN,RiceASC.Mechanisms of neuropathic pain.BritishJ Anaesthesia,2001,87:12-26.
［2］ Kuraishi Y,Hirota N,Soto Y,et al.Evidence that substance P and somatostatin transmit separate information related to pain in the spinal dorsal horn.Brain Res,1985,325:294-298.
［3］ Ruan HZ,LiXC,Cai WQ,et al.Participation of substance P in noxious stimulus-evoked c-fos expression in spinal cord.Chin Sci Bull,1994,39:1725-1729.
［4］ Ruan HZ,Li XC.Effect ofand monoamine neurotransmitters on pain modulation of substance P in spinal cord.Chin Sci Bull,1991,36:682-686.
［5］ Millan MJ.The induction of pain:an integrative review.Prog Neurobiol,1999,57:121461.
［6］ Zhao ZQ,Yang HQ,Zhang KW,et al.Release and dep letion of substance P by cap saicin in substantia gelationosa studeide with the antibody icrop robe technique and immunohistochemistry.Neuropeptides,1992,23:161-1671.
［7］ Yezierski RP,Yu CG,Mantyh PW,et al．Spinal neurous involved in the generation of at-level pain following spinal injury in the rat.Neurosci Lett,2004,361(1-3):232-261.
［8］ Morton CR,Hutchinson WD.Morphine does not reduce the intraspinal release of calcitonin gene-related peptide in the cat.Neuroscience Letters,1990,117:319-324.
［9］ Fleetwood-Walker SM,Hope PJ,Mitchell R,et al.The influence of opioid receptor subtypes on the processing of nociceptive inputs in the spinal dorsal horn of the cat.Brain Research,1988,451:213-226.
动物行为学方法范文第3篇
关键词：针灸疗法 抑郁症
抑郁症是一种常见的情绪障碍性疾病，表现为一种持久的抑郁状态，以心境低落、躯体不适和睡眠障碍等为主要症状［1］。是危害全人类身心健康的常见病，其终生患病率为6.1%～9.5%［2］。据专家预测，到2020年，精神疾病在人们的疾病负担中将列首位，而抑郁症则占精神科疾病的47%［3］。抑郁症及其治疗引起内外广大学者的广泛重视。本研究旨在通过观察针刺对抑郁模型大鼠行为学的影响，评定针刺抗抑郁疗效。
1 器材
1.1 药品多虑平：南京白敬宇制药厂产品，批号：20040912。
1.2 动物（200±20）g Wistar雄性大鼠，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字：20040816。
1.3 器材“华佗”牌32号1.0寸针灸针，苏州医疗用品厂产品；穿梭箱：山东中医药大学中西医结合基础研究室提供，根据文献介绍制备［4］，大鼠穿梭箱有两室，每室30 cm×30 cm× 20 cm，可人为开闭，箱底为不锈钢栅条，条间距离为1 cm，两室栅条可错时通电，一室与刺激器接通时，另一室为安全室；敞箱：根据文献介绍，自行制备［5］，标准为40 cm×80 cm×80 cm，周壁、底面为黑色，底面以白线划分为面积相等的25块。
2 方法
2.1 模拟临床建立大鼠学习无助模型将大鼠放入穿梭箱，中间通道关闭，通过底部的金属栅条给予220V，0.8 mA的方波刺激，刺激15 s，间隔45 s/次，共60次，总刺激时间15 min，进行不可逃避的电休克即前休克动物（pre-shocked animals）制作［1］。
2.2 分组及给药(200±20)g Wistar雄性大鼠40只，按体重均衡随机分为空白对照组、模型对照组、阳性药多虑平组、针刺组，每组10只。空白组及模型对照组分别给予凉开水1 ml/100 g，ig；多虑平对照组给予多虑平3 mg/kg，生理盐水配成30%水溶液1 ml/100g·ig ；空白对照组大鼠只放入穿梭箱内而不进行电刺激，时间相同。第2天除重复进行前一天实验并开始给药，连续给药14 d。最后一次给药后24 h，采用Open-Field法进行动物行为学敞箱实验及条件回避实验，记录并统计实验数据。
2.3 针刺取穴及操作方法针刺组根据《实验针灸学》［6］大鼠穴位定位方法，选择百会、内关、神庭、三阴交穴，并参照人和动物的穴位解剖结构特点，在动物针灸穴位图谱的基础上，于大鼠前正中线上，额顶骨缝交界线前方处定位神庭穴。其他穴位仿人取穴。针刺方法: 穴位常规消毒，百会穴向前斜刺，神庭穴向上斜刺，进针深度约为0.2 cm。内关直刺0.3 cm，三阴交直刺0.2 cm。每穴行均匀捻转刺激30 s，留针10 min,每日治疗1次,连续14 d。最后一次治疗后24 h，采用Open-Field法进行动物行为学敞箱实验及条件回避实验，记录并统计实验数据。
2.4 敞箱实验将各组大鼠依次放入自制敞箱，以动物穿越底面块数为水平运动（crossing）得分，直立次数为垂直运动（rearing）得分，记录其水平运动、垂直运动次数，每只动物测定1次，测定时间为3 min/次，记录水平运动得分和垂直运动得分情况。
2.5 条件回避实验（conditioned avoidance testing）继敞箱实验后，大鼠放入穿梭箱后适应5 s，进行铃声刺激，非条件刺激为足电休克0.8 mA，在铃声响起3 s后开始方波输出电刺激，当动物逃到安全室后停止铃声和刺激，如未能逃避时刺激达30 s时停止。1次/min，共进行30次，刺激间隔为27 s。测定回避成功次数和逃避潜伏期。 动物在铃声开始3 s内逃到安全室，记录回避成功一次，逃避潜伏期为0；刺激后才逃避的，其潜伏期记录是从刺激开始到逃避完成的时间；到最后未能逃避的，则潜伏期为30 s。
2.6 统计学处理所有实验数据用 ±s表示，计量资料采用t检验、q检验进行差异显著性检验；计数资料采用四格表的确切概率法检验。
3 结果
3.1 针刺对学习无助模型大鼠敞箱实验的影响
3.1.1 水平运动针刺组、多虑平组、空白组均优于模型组。结果见表1。
表1 对大鼠水平运动的影响（略）
为避免统计学上第2类错误，出现假阳性结果，本组数据采用q检验。结果见表2。
表2 q检验结果（略）
由此可见，空白组与模型组有显著性差异，说明此造模方法成功；针刺组及多虑平组与模型组有显著性差异，其差异具有统计学意义；而前两组与空白组的差异及前两组间的差异不具有统计学意义，说明针刺与多虑平均有改善抑郁模型大鼠水平运动状态的作用，且二者作用相似。
3.1.2 垂直运动各处理因素对实验动物垂直运动的影响无显著差异。结果见表3。
表3 对大鼠垂直运动的影响（略）
为避免统计学上第2类错误，出现假阳性结果，本组数据采用q检验。结果见表4。
表4 q检验结果（略）
由此可见，各处理因素对大鼠的垂直运动的影响无统计学意义。
3.2 针刺对学习无助模型大鼠条件回避实验（conditioned avoidance testing）的影响
3.2.1 回避成功空白组、多虑平对照组、针刺组大鼠，回避成功次数较多。结果见表5。
表5 回避成功次数（略）
本组数据采用q检验。结果见表6。
表6 q检验结果（略）
动物行为学方法范文第4篇
[关键词] 嗅觉; 嗅觉障碍; 评估方法; 动物实验; 文献综述
[中图分类号] R339.12 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562(2010)04-0434-04
doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.04.041
嗅觉是人体原始的感觉功能之一,它同视觉、听觉一样,是人体捕获外界信息的特殊装置。嗅觉还可以通过中枢神经系统影响人的情绪、调节生命周期。嗅觉障碍患者对周围的事物不感兴趣,反应平淡,生活质量下降,更可以造成精神上的压抑或忧郁。王鸿等[1]报道用T&T测试法测试了1 035例慢性鼻窦炎鼻息肉患者,86.3%的患者有嗅觉功能障碍,与患者的主诉有极显著的差异,说明嗅觉功能改变没有受到患者的注意。近几年随着人们对生活质量要求的提高,对嗅觉障碍的关注程度有了很大的提高。
嗅觉评估不仅仅是要判断嗅觉功能是否正常,还需要进一步判断嗅觉障碍的程度、性质、部位等因素,如果能提示病因以及预后则更有临床、实验应用的价值。在动物实验中关于嗅觉功能的研究已经有了较长的历史,出现了多种实验方法,但是目前为止还没有一个全面、客观、高特异性的金标准方法出现,本文就目前动物实验中的常见的嗅觉评估方法进行一个概括性的介绍。
1 行为学方法
动物实验和临床试验的最大区别在于动物无法准确地和实验者交流,所以行为学方法在动物实验中就显得极为重要。嗅敏动物的学习记忆能力、寻食能力等与嗅觉有很高的相关性,可以观察、记录其行为学的改变,从而判断其嗅觉功能的变化。目前报道较多的可以评估嗅觉功能的行为学方法有以下几种。
1.1 埋藏食物小球实验(buried food pellet test,BFPT)
BFPT是目前最常用于检测动物嗅觉功能的行为学检测方法[2]。目前比较通用的方法由Nathan等[3]于2004年报道,他的实验中使用找寻食物小球等待时间作为数据进行统计分析,即从小鼠被随机放置于盒子中开始,到小鼠揭开食物小球并用它的前爪或牙齿抓住食物小球的时间,如果5 min(300 s)内小鼠未找到食物小球,即被移走。林静等[4]以300 s(5次测试的平均值)内未找到食物小球作为判定小鼠存在嗅觉功能障碍的标准,并认为以300 s作为分组标准是合理的。
1.2 嗅觉测量仪
Slotnick等[5]利用行为学原理设计出一种用于动物实验的嗅觉测量仪,可以通过改变气味的浓度后观察动物的行为学变化来评价其嗅觉。该系统经众多实验验证其对动物嗅觉的检测是有效的[6],因操作方便且可进行多种设计,此方法被广泛应用于动物嗅觉功能的评估。
1.3 双瓶实验
有研究证实小鼠、大鼠在分辨某些物质的时候主要是依赖于嗅觉而非味觉,例如盐酸、盐酸奎宁(quinine HCl, QHCl)等有一定挥发性的物质 [7]。因嗅觉障碍时动物分辨饮用水和实验溶液的能力下降,通过两种溶液被动物饮用的程度可以评估动物嗅觉障碍的程度。
1.4 幼鼠超声发声实验
新生小鼠嗅觉的产生比其他的感觉要早。新生小鼠嗅到成年鼠窝的气味时可发出一种超声作为回应,检测这种超声的出现与否可以判断其嗅觉功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3-甲基吲哚来破坏新生小鼠的嗅上皮,结果成功地证实了该检测方法的可行性。而且在该实验中发现由于被破坏嗅觉的小鼠无法正确识别,其生存率大大降低,证明了嗅觉对新生小鼠有极其重要的作用。
行为学方法在动物实验的嗅觉评估中有很重要的作用,历史悠久、技术成熟,实验方法较为简单,实验装置花费较少,对嗅觉功能的初步评估价值较为肯定(尤其是埋藏食物小球实验和Slotnick的嗅觉测量仪),可行性及可重复性较高。需要注意的是本类实验受个体差异影响较大,实验前应经预评估剔除先天差异比较大的个体,而且样本量不宜过小,有时候还需对动物进行预先的训练。为保证实验的客观性,需要很好地进行实验设计与控制,有时连昼夜节律等变化的影响都需要考虑在内。行为学测试结果对嗅觉功能评估只是一个综合的结果,对嗅觉障碍程度、部位等的判断较差,如果能结合嗅觉诱发电位等客观检查可以做到更加客观、可信。在过去的实验中行为学测试往往与组织学检查相结合,既增加了实验的客观性,又为进一步研究嗅觉产生机制或嗅觉障碍的原因提供了基础。
2 客观评估方法
嗅觉的感受、传导是个比较复杂的过程,气味分子通过鼻腔到达嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附,进而在黏膜层中扩散,到达嗅细胞。达到阈浓度的气味分子可刺激嗅细胞产生嗅觉电位,这是其感受过程。产生的嗅觉电位通过嗅神经穿过筛骨筛板,到达嗅球,其内有第2级神经元,再通过嗅束传导至初级嗅皮质及皮质内侧核,而后至海马回的内嗅皮层即次级嗅皮层,神经冲动引起大脑皮层的激活才能最后引发嗅觉。嗅觉功能的客观评估方法包括了对嗅觉感受、传导通路上各种指标,例如影像学、电生理学、组织学等的测量。目前动物实验中使用较多的及可能有较大发展前景的客观评估方法包括以下几类。
2.1 组织学方法
这里的组织学是泛指解剖取组织后进行的所有检查,包括大体解剖学、病理学、免疫学、分子生物学等诸多学科的检查方法。嗅觉系统的改变既可以由病变本身引起也可以是因为嗅觉障碍后的退行性变引起。组织检查比结构影像检查更有评估价值,因其可以更好地提示病因,也利于更好地研究嗅觉通路和嗅觉障碍产生的机制。目前组织学方法在动物实验中有很广泛的应用,从部位选择上看整个嗅觉传导通路包括从嗅黏膜直到海马回的内嗅皮层都有报道,从实验方法上看更是复杂多样,最常用的几种方法有如下几种。
2.1.1 病理学检查
这是早期免疫学技术及分子生物学技术还不是很发达时常用的检查手段,在早期嗅觉研究中有较多的应用,在嗅觉障碍的动物标本上可以看到细胞凋亡、空泡等变化,虽然特异性较差,但是也能提供宏观的信息,现在常常和其他检查方法一起使用,例如在陈志宏等的实验中在进行其他检查之前使用了HE染色方法检查了模型小鼠的嗅上皮,发现其嗅上皮变薄,其中的感觉神经元的细胞核层数变少[9]。
2.1.2 蛋白及核酸表达的检查
对相应组织中某些标志性蛋白及核酸的检查可以间接地反映嗅觉功能及提示嗅觉障碍的原因。例如用免疫组化方法检查嗅觉通路中嗅标记蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羟(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、c-Fos蛋白等标记物在许多文献中都有记载。Buron等[10]在丙酮吸入诱导的嗅觉障碍实验中使用了嗅上皮组织的OMP及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为观察指标,发现丙酮对于嗅上皮的损伤是有选择性的。有学者使用多巴胺及细小白蛋白作为标记物进行免疫组化检查,发现失嗅动物模型的嗅球中含多巴胺及细小白蛋白的神经元细胞数量明显减少,认为通过该失嗅动物模型可以对嗅球萎缩进行定量描述,提示多巴胺及细小白蛋白在嗅球中的表达对于失嗅的作用[11]。c-Fos蛋白可反映大脑组织活动程度,对c-Fos蛋白的观察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。
2.2 电生理学方法
2.2.1 嗅电图
将电极直接置于嗅区黏膜,当其接受嗅素刺激时记录到的一种慢相负性电位变化称为嗅电图,目前普遍认为它是单个嗅细胞电位变化的总和,嗅电图已经在动物实验中得到证实[13]。嗅电图最大的缺陷在于虽然其对嗅黏膜损伤引起的嗅觉障碍有较大的意义,但是对于黏膜后传导通路以及嗅球、海马回等中枢病变导致的嗅觉障碍没有什么评估价值。
2.2.2 嗅觉脑电图
嗅觉诱发脑电图是指在给予嗅刺激时,实验对象的脑电图可发生变化,Hirano等[14]用狗做实验时成功地获得了该变化,在他的实验中发现脑电图的快波对嗅觉功能的意义较大。嗅觉诱发脑电图又相继在大鼠等其他动物身上得到了验证[15]。嗅觉脑电图产生的机制还不是很明确,而且其特异性不是很高,故目前在动物实验中研究、应用的较少。
2.2.3 嗅觉诱发电位
又称为嗅觉事件相关电位(olfactory event-related potentials,OERP),最早是用电刺激动物嗅黏膜时在头皮特定部位记录到稳定的脑电位的变化,该方法经过一段时间的发展后认为其和自然嗅觉之间有一定的差距,故逐渐被化学气味诱导的嗅觉诱发电位所取代,目前使用的已经比较少。早期化学气味刺激除了有嗅觉刺激外还常常伴有物理刺激及对三叉神经的化学刺激,这些非嗅刺激干扰了正常嗅觉诱发电位的获得。随着仅能兴奋嗅觉系统而不兴奋三叉神经系统的化学物质如香草醛等,以及Kobal式嗅觉刺激器的出现,嗅觉诱发电位研究成为嗅觉研究领域的热点。嗅觉诱发电位仪至少包括嗅觉刺激器及脑电采集系统,测量时需要在电声屏蔽室进行,且需要给予一定的白噪声掩蔽刺激探头释放刺激时产生的干扰噪声。目前动物嗅觉诱发电位各波的具体来源以及与疾病间的相互关系还不清楚,嗅觉诱发电位的出现是否意味着动物确实产生了嗅觉还不能肯定,所以用来证明嗅觉传导通路是否畅通比较可行[16],而暂不能用于嗅性疾病的定位、定性诊断。嗅觉诱发电位应该是最可能成为动物嗅觉评估客观标准的检查方法。
3 影像学方法
3.1 嗅觉系统结构影像检查
有研究证明嗅球及嗅束等神经结构的生长与周围神经冲动的输入有关[17],所以嗅觉障碍后嗅觉系统各部位可有一定的不依赖于年龄的结构改变,通过磁共振影像检查可以发现这些改变,例如嗅球体积变小、嗅沟缺失或变浅、嗅束缺失等现象,从而间接评价嗅觉功能。
3.2 嗅觉系统功能影像检查
这是目前嗅觉研究的热点方向之一,主要技术有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和脑信号的光学成像等。
3.2.1 功能磁共振检查
功能磁共振检查技术有很多,用于嗅觉系统功能的fMRI技术主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI),当氧合血红蛋白的比例增加时或去氧血红蛋白含量减少时,T2信号缩短效应减弱,表现为MR信号增强。嗅觉功能成像既能反映血流的变化,也能反映神经元活动的代谢变化,近些年在研究神经功能方面发挥着巨大的作用,特别是fMRI无放射暴露,可反复测试,且时间、空间分辨率要优于PET成像,故是目前嗅觉功能成像的主要方法。在大鼠实验中已经证实,7 T的fMRI能够显示气味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空间分辨率很高,对于研究嗅觉相关皮层的定位、嗅觉功能障碍情况下嗅觉相关皮层反应的变化等有极大的应用价值。有学者拟通过信息技术将啮齿类动物嗅球的激活图像编成二维的气味图(OdorMap,OM)及气味图数据库(OdorMap Database,OMDB)以利于嗅觉工作者对嗅觉系统的研究[18]。功能磁共振应用在动物实验的嗅觉评估中需要注意的是:首先动物是不能配合磁共振检查的,故需要在麻醉下进行;其次磁共振是强磁场环境,故嗅觉刺激装置不能由金属制成。
3.2.2 脑功能光学成像
脑功能光学成像是近年来神经外科的热点研究方向,目前主要的实验技术有激光散斑衬比成像和内源信号光学成像。而应用于嗅觉功能检查的主要是内源信号光学成像,这里所指的内源信号,并不是神经元所表现出来的电信号,而是指由神经元活动所引起的有关物质组分、运动状态的改变而导致其光学特性的变化,在与某些特定波长的光量子相互作用后,得到的包含了这些特性的光信号,包括:血红蛋白信号、氧合血红蛋白信号、光散射特征信号等[19-20]。许多生理性过程如血红蛋白氧合度、细胞色素的氧合状态、神经胶质和神经元肿胀、功能性血流量改变等变化,都会影响到组织光反射特性的改变。通过探测反射光的变化量,就可以获得这种特异性的内源光学信号。内源光学信号成像在动物实验中已用于多种脑功能皮层功能的检查,比如视觉(猫、小鼠等)、躯体感觉皮层(大鼠、猫、松鼠猴等)、听觉皮层(南美栗鼠、猫、雪貂等)。Bathellier等[21]在实验中使用了内源光学信号原理和突触素荧光标记两种方法分别获得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情况,在内源光学信号成像下,激活的嗅小球反光率下降,呈相对的冷色调,而在荧光标记实验中激活区域荧光反应较强。虽然内源光学信号成像的时空分辨率都较高,但是其穿透脑皮层的能力受限(大约数百微米),所以对于深层脑组织的观察就没有什么效果了。由于内源光学信号的确切生理来源至今没有定论,所以为了阐述内源光信号对应的生理意义及其与神经元电活动的关系,还需要与其他方法进行对比研究。
从其他感觉的评估方法来看,功能磁共振和诱发电位是研究的发展方向,但目前嗅觉产生、传导机制尚未完全明了,相关检查技术尚处于起步阶段,还需要进行大量的研究。目前的嗅觉研究可以根据不同的实验要求及实验条件选择不同的实验方法及实验方法的组合。嗅觉诱发电位及功能磁共振检查由于其初期投入较大,对硬件及技术条件要求较高,开展难度较大,在国内只有少数医院在从事这方面的实验。行为学方法操作简单,技术成熟,效果肯定,有很强的实用价值。组织学方法对于机理的研究十分重要,并且随着对嗅觉认知的加深,越来越多的标记物被发现,评估方法也越来越丰富。如果可以出现一种简单易行的嗅觉评估方法,那么可以极大地促进嗅觉的研究。
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动物行为学方法范文第5篇
1鸟类脑大小对觅食创新的影响
很多动物行为学家都认为，在动物前脑大小与觅食创新之间存在着神经生物学联系［3］，因为前脑与动物行为的可塑性密切相关。通常是前脑越大，觅食创新能力越强。根据这一基本原理，Lefebvre等人（2004）［4］研究了北美洲和大不列颠群岛上各种鸟的前脑大小与觅食创新之间的关系。所谓觅食创新是指能取食和利用新的食物种类或采用新的觅食技巧。为此，研究人员利用了9种鸟类学杂志所提供的资料，收集了322种觅食创新（或觅食新技能），其中126种觅食新技能属于大不列颠群岛上的鸟类，192种属于北美洲的鸟类（表1）。这些觅食创新包括银鸥捕到小啮齿动物后将它们扔到岩石上摔死或沉入水中淹死；也包括普通乌鸦利用过路的小汽车把坚果压碎，这相当于把小汽车当钳子使用［5］Lefebvre等人曾计算过这些创新行为在不同类群（目鸟类中的分布情况，同时还分析过不同类群鸟类在大不列颠和北美洲的常见程度或稀有程度。在掌握各种鸟类觅食创新行为的同时，研究人员还获得了这些鸟类前脑相对大小的资料［6］。无论是在大不列颠群岛还是北美洲，鸟类前脑的大小都与觅食创新密切相关。凡是前脑比较大的鸟类，其觅食创新行为也更为常见。虽然有很多觅食创新都是在一次观察中发现的，但对多达322例觅食创新行为的大规模分析中，发现在前脑大小与觅食创新之间确实存在着直接的关系，这表明，这是动物行为学中一个重要而有意义的研究新领域。Sol等人（2006，2007）［7－8］曾研究过鸟类脑子较大是否对其生存和生殖有利的问题。长期以来人们一直未经验证地认为，脑相对较大有助于提高动物的适合度（fitness），特别是当种群进入一个新的陌生环境的时候，这时觅食创新对动物的生存和生殖就特别重要［9－10］。Sol等人曾研究了646例物种被引入新环境的实验（涉及196种鸟），其中大多是研究人员将一种鸟引入一个岛屿或原分布区以外的地方［11－12］。研究人员还收集了196种鸟有关脑大小的资料，并根据鸟大脑就大，鸟小脑就小的基本事实作了相应的校正，最终发现，在鸟的脑大小和能在新环境中成功定居之间存在着正相关关系，这是因为脑子较大的鸟类具有更强的觅食创新能力，这种能力可大大提高鸟类的食物摄取率，从而能提高鸟类的生存机会和生殖机会。
2动物有计划未来的能力吗？
学习是动物借助于个体生活经历和经验使自身行为发生适应性变化的过程，从这一学习的定义可以看出，任何当前发生的行为都是与此前的生活经历和经验相关联的。如果动物也能像我们人类那样能够根据先前的经历和经验预测和计划未来的话，那一定会大大增加自身的存活机会和适合度。目前属于这方面的研究还很少，因为长期以来人们一直认为计划未来是人类独有的能力，这也是人类与所有其他动物存在的一个主要差异［13］。然而随着时间的推移已变得越来越清楚的是，动物也具有一些一度被认为是人类所独有的行为，例如使用工具和纯粹是有利于未来生存的行为，这促使动物行为学家开始对动物有没有计划未来的能力产生兴趣并进行研究。动物行为学家认为，要想确认计划未来的行为必须满足两个条件：首先该行为必须是创新的或新颖的，它不是某些本能行为的表现，例如：迁飞行为有很多本能成分，虽然显示有一定的“计划性”，但不是我们要求的那样；其次，计划未来的行为不一定与动物当前的动机状态相关，而必定会涉及到未来某一时刻的动机状态。下面介绍一个最新的关于动物计划未来的研究实例，这就是松鸦为了计划未来而改变其觅食行为的现象［14］。松鸦是进行这类研究的一个极好的物种，因为它具有令人难以置信的记忆力，它生活在高海拔地区，常常要为未来贮藏大量的食物，每个个体每年大约要贮藏3万多粒种子，冬季和春季几乎完全依赖秋季贮藏的种子为生。松鸦不仅能记住它们贮藏食物的地点，而且还十分注意当它们在贮藏食物时谁在观察它们。在这种情况下，它们此后会把食物重新挖出来并进行深埋，以防这些食物被偷食［15］。Raby等人（2007）［16］利用一个简单而巧妙的实验检验了松鸦是否具有计划未来的能力。研究人员为松鸦提供两个隔室，其中一个隔室中含有食物松子，另一个隔室中没有食物，每天早晨松鸦只能见到和进入一个隔室，在连续6天的实验期间，两个隔室是交替出现的，各出现3次。每天实验的前一天晚上，不为松鸦提供任何食物，因此它们在见到隔室期间是处于饥饿状态。6天实验结束后，每天天黑前两小时，只为松鸦提供一点点食物，使它们得不到可供贮藏的种子。此后再为它们提供一个备有大量松子的场所，并提供两个以前曾多次拜访过的隔室，但现在每个隔室内又安装了一个能贮藏食物的“贮食杯”，使鸟类在天黑前可以把食物贮藏起来，如果它们愿意这样做的话。实验结果发现，在两个隔室中它们总是在其中的一个隔室中贮藏更多的食物（松子），而这个隔室是它们以前拜访过的那个不含有食物的隔室，这说明在越是缺乏食物的环境中，它们贮藏食物的行为就表现得越明显，这对于保障未来的生存是很重要的，这实际上是“为未来着想的一种行为适应性”。接下来Raby等人又安排了一个更加有趣的实验，他们训练松鸦使其知道在一个隔室中可以吃到花生，而在另一个隔室中可以吃到谷粒，松鸦对这两种食物都很爱吃。当按照上述同样的方法进行实验时，发现松鸦在含有花生的隔室中贮藏的食物是谷粒，而在含有谷粒的隔室中贮藏的是花生，这表明松鸦很注意并喜欢使它们的食物多样化，在它们为未来准备食物时也是遵循这一使食谱多样化的原则。除鸦科鸟类（如松鸦和星鸦）外，其他动物是否也有“为未来着想”和计划未来的行为，目前还研究得很少，尚有待于扩展研究范围。
3脑海马大小与贮食行为的关系
为了了解鸟类觅食行为与空间记忆力的问题，Hea－ley和Krebs（1992）［17］曾研究了7种鸦科鸟类的脑海马大小与贮藏食物的能力之间的关系。他们之所以选择研究脑海马是因为已知鸟类大脑的这个区域与食物的回收（复得）有密切关系。同时，鸦科鸟类也是研究这一问题的最好对象，因为在鸦科鸟类的各个物种之间，贮食行为的表现各不相同，便于用比较研究法进行分析。有些鸦科鸟类根本就不贮藏食物，而另一些鸦科鸟类则 必须在长达9个月期间完全依赖贮藏的食物为生［18－19］。Healey和Krebs［17］研究了两种几乎不贮藏食物的鸦科鸟类，即寒鸦（Corrus monedula）和红嘴山鸦（Pyr－rhocorax graculus），还研究了4种贮藏食物的鸦科鸟类，它们是秃鼻乌鸦（Corvus frugilegus）、欧洲乌鸦（Corviscorone）、喜鹊（Pica pica）和红嘴蓝鹊（Cisia erythro－rhyncha），此外还研究了1种不仅贮藏食物，而且在长达9个月期间必须记住6 000～11 000粒种子埋藏地点的鸦科鸟类，即欧洲松鸦（Garrulus grandarius）。当检查贮食行为与脑海马大小之间关系的时候，发现这些鸟类都表现出明显的正相关关系，即海马体积越大，贮藏食物的行为就越发达，这表明：海马大小是鸦科鸟类空间记忆力和贮食行为进化的关键因素。此外，动物行为学家还研究了在一个物种内部个体之间海马大小与贮食能力之间的关系，例如：生活在食物短缺环境中的个体比生活在食物丰富环境中的个体具有更发达的贮食能力，脑海马的体积也比较大［20］。这就是说，当鸟类生活在严酷环境中的时候，自然选择有利于增强它贮存食物的能力和此后重新找回这些食物的能力，也有利于海马体积的增大和海马神经元数量的增加。Pravosudo及其同事用来自食物丰富的科罗拉多州和来自食物短缺的阿拉斯加州的两个黑冠山雀（Po－ecile atricapilla）种群检验和证实了这一观点。他们从阿拉斯加州的安克雷奇（Anchorage）捕捉15只活鸟，从科罗拉多州的温泽（Windsor）捕捉20只活鸟，然后将它们带回加利福尼亚大学的实验室，45天后测定这些鸟类贮藏种子之后再重新找到这些种子的能力。当为这些鸟提供可供贮藏的种子时，发现来自阿拉斯加（食物短缺）的山雀比来自科罗拉多（食物丰富）的山雀要贮藏更多的种子。同样重要的是，阿拉斯加山雀不仅比科罗拉多山雀贮藏更多的种子，而且它们重新找回这些种子的效率也更高，所犯错误也最少。从海马大小的角度进行比较，虽然阿拉斯加山雀比科罗拉多山雀的个体小体重轻，但其海马的体积却比后者大，而且海马所含有的神经元数量也更多。有趣的是，在不给予两地山雀贮藏食物的机会的情况下，它们之间海马大小的差异仍然存在，这表明：贮藏行为本身并不会使阿拉斯加山雀的海马变大，相反，两地山雀之间的差异应当是自然选择作用于海马大小的结果。目前，有关这一领域的大量工作正在进行之中。
