生物细胞的培养

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生物细胞的培养范文第1篇

【摘要】 为进一步提高脐血造血细胞的扩增倍数并达到临床规模，本研究中利用自主开发的有溶氧和pH控制的搅拌式生物反应器进行了脐血造血细胞的换液培养。结果表明，培养中总细胞、CD34+细胞、各系集落形成细胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的扩增倍数均高于方瓶培养，而且由于控制了较低的溶氧，所培养细胞中干/祖细胞含量显著高于方瓶培养。该反应器中培养的脐血造血细胞达到了临床应用的规模。结论：反应器中培养环境更有利于干/祖细胞的维持和扩增，而且可达到成人造血干细胞移植所需细胞量。

【关键词】 脐血

Ex vivo Culture of Umbilical Cord Blood Hematopoietic Cells in Stirred Tank Bioreactor with feeding protocol

Abstract To increase the expansion multiple of cord blood (CB) hematopoietic cells and to reach a scale for clinical application，the mononuclear cells from CB were cultured in a autonomously developed stirred tank bioreactor with dissolved oxygen (DO) and pH controlling. The result showed that the expansion multiple of total cells，CD34+ cells，and progenitors cells (CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，and CFU-Mk) in bioreactor were greater than that in T-flasks. The rate of progenitors to total cells in bioreactor culture was also greater than that in T-flasks. The good results in bioreactor should be attributed to the controlled，optimized DO. Clinical-scale culture was realized from one sample of CB in this bioreactor. These results suggested that the culture environment in bioreactor with optimal DO and pH controlling is more favorable for stem/progenitor cell maintenance and expansion，and the expanded cells from one sample of CB is enough to transplant for an adult patient.

Key words cord blood；hematopoietic cell；bioreactor；stirred culture

脐血细胞中富含造血干细胞，从而成为除骨髓和外周血之外一个重要造血干细胞来源，在临床上有着广泛应用，但脐血中造血干细胞的绝对数量少，无法满足成人的移植要求，而通过体外培养和扩增有望克服这一矛盾。体外扩增骨髓细胞、外周血细胞、脐血细胞的临床实验都已有所报道［1，2］，证明了体外扩增后细胞用于临床的安全性和可行性。目前开发的体外扩增造血干细胞的培养系统主要有平板灌注腔反应器、固定床和流化床反应器、搅拌式反应器等［3］。其中搅拌式生物反应器能提供均一的培养环境，而且取样和数据采集简单，易于实现自动控制，因此，在造血细胞临床规模培养中有较好的应用前景［3，4］。本研究应用自主开发的搅拌式生物反应器系统，进行脐血造血细胞的换液培养研究。

材料和方法

脐血(CB)和单个核细胞(MNC)的分离

脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求是身体健康、发育良好的非高龄产妇。脐血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养液洗涤2次。

培养基和细胞因子

体外培养液用IMDM（Gibco公司），使用时添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50 ng/ml）、IL-3（5 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml）、G-CSF（2.0 ng/ml）和GM-CSF（2.0 ng/ml），其中SCF、IL-6购于北京宝赛生物技术公司，IL-3购于Pepro-Tech公司，G-CSF购于上海三维制药厂，GM-CSF购于上海海济生物技术有限公司。

造血细胞的反应器换液培养

将分离得到的脐血单个核细胞以2×106 cells/ml的密度在 T-175方瓶中培养4天后，再接种到反应器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中进行培养，进行的2次实验中接种密度均为0.8×106 cells/ml。反应器为自主开发产品，其中反应器中所用材料经过造血细胞的生物相容性检验，反应器工作体积为300-500 ml，搅拌系统为磁力搅拌，转速控制为30 r/min。反应器的温度控制为37℃，溶氧和pH通过调节空气、氮气、氧气和二氧化碳的流量来控制，通气方式为表面通气。pH控制在7.15，溶氧控制为饱和溶解空气的25％。细胞接种到反应器后，待细胞密度生长至2.0×106 cells/ml后进行换液，即取出50％的细胞液，并加入相同体积含有相同细胞因子的新鲜培养液。实验中以T-25方瓶作对照，每瓶装液7 ml，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度的培养箱中进行细胞培养，方瓶与反应器中换液比例和频率相同。

细胞计数及活性分析

台盼蓝染色后利用血球计数器进行活细胞和总细胞的计数，由于实验中很少能见到被染成蓝色的细胞（死细胞），因此，未进一步计算细胞活性。

造血细胞的集落检测

集落的检测体系为IMDM培养液，添加20％胎牛血清（FBS），4 mmol/ml谷氨酰胺（Sigma），含0.9％甲基纤维素(4 000cp，Sigma)，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、 EPO，其浓度分别为50、20、20、20、20 ng/ml和2 U/ml，并添加1％牛血清白蛋白（BSA）。取(1-3)×104培养或没培养的单个核细胞加入0.5 ml集落培养液中，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养12天后，进行CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix计数，其中CFU-Mix为至少含有粒细胞和红细胞的集落。

CFU-Mk的检测采用血浆块法，细胞以1×105 cells/ml的接种密度接种于24孔板中，每孔加50 μl脐血浆，50 μl 3.4 g/L的CaCl2溶液，另加入含有TPO （20 ng/ml）、IL-3（10 ng/ml）、IL-6（10 ng/ml）的α培养基（Gibco公司），混匀后静置凝固。培养10-12天后，用1∶3的甲醇/丙酮溶液原位脱水，并固定30分钟，然后按次序加入1% BSA、鼠抗人CD41抗体、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体、抗生物素蛋白-碱性磷酸酯酶复合物（加入后都要作用一定时间，然后用0.05 mol/L Mtris/NaCl缓冲液淋洗3遍，再加入其它试剂），染色后在40×目镜下观测呈红色的集落。

细胞表型分析

流式细胞仪分析中所用抗体为PharMingen公司产品。取1.0×106未扩增或扩增后的细胞加入1.5 ml离心管中，用PBS洗2遍，离心后倒掉上清液，加PE偶联的小鼠抗人CD34单克隆抗体和FITC偶联的小鼠抗人CD45单克隆抗体各10 μl，4℃孵育30分钟。PBS洗2遍，离心后，每管加1 ml FACS保存液；标记抗体后的细胞用流式细胞仪（Becton Dickinson公司）分析，结果用Lysis II软件处理。

结

果

总细胞的扩增

由图1可见，换液培养时，总细胞在18天的培养中一直维持扩增，在开始的14天中反应器和方瓶中总细胞扩增倍数相差不大，14天后开始有所差别，说明培养到后期方瓶中细胞增殖潜力不如反应器。扩增到18天时，两批实验反应器中总细胞分别扩增37.2倍和26.3倍，方瓶低于反应器中扩增倍数。

干/祖细胞的扩增

CFU-Mix由于具有多向分化潜能，代表了较原始的干/祖细胞，换液培养中CFU-Mix扩增情况如图2所示，两次实验反应器中CFU-Mix的扩增分别在第10天和第9天达到最大，扩增倍数分别为7.7和8.9，方瓶中第7-8天达到最大，而后逐渐下降，其扩增倍数明显低于反应器中。反应器中培养至14天仍可检测到CFU-Mix，而方瓶中10天后仅能检测到很少的CFU-Mix。

CFU-GM的扩增在14天左右达到最大，而后维持数天，或有所下降，而方瓶中扩增倍数在第10天达到最大，而后开始较快下降，而反应器中CFU-GM扩增倍数一直高于方瓶，最大扩增倍数分别为27.4和23.6，显著高于方瓶（图2）。

BFU-E达到最大扩增倍数的时间较早，在7天左右，由于本实验中没有添加EPO，所以BFU-E的扩增倍数不高，由图2可以看出，反应器中扩增倍数一直高于方瓶。

反应器中CFU-Mk的扩增倍数在10天时达到最大，而后逐渐下降，14天后基本检测不到CFU-Mk，而方瓶中第7-9天达到最大后就开始较快地下降。扩增最大时，两次实验反应器中分别扩增10.3倍和14.4倍（图2）。

培养中CD34+细胞的扩增如图3所示，反应器扩增倍数一直上升，至14天时达到最大，方瓶培养到第7天时与反应器相差不大，第10天开始有较大差异，第14天的扩增倍数比第10天时提高不大。由图看见最终反应器中CD34+细胞的扩增倍数高于方瓶培养。

反应器培养的规模

附表显示了2次实验中反应器培养的规模，由附表可见，如果不取出细胞而采用流加方式培养细胞，则培养到12天时，第1次实验中可得到2.44×109总细胞、4.88×106 CFU-Mix、11.9×106 CFU-GM和59.5×106 CD34+细胞，第2次实验可得到2.03×109总细胞、3.53×106 CFU-Mix、9.0×106 CFU-GM、和36.7×106 CD34+细胞。

造血干细胞移植中细胞需要达到的理想量是总细胞3.7×107 cells/kg，和CFU-GM 2.0×105 cells/kg，CD34+细胞2.5×106 cells/kg。按此计算，对于1个50公斤体重的病人总细胞、CFU-GM、CD34+细胞必须分别达到1.85×109、 10×106、和125×106 个。我们的检测中是作同一集落分析而分别计数CFU-GM 和CFU-Mix，而CFU-Mix是比CFU-GM更原始的细胞，因此，这两个数字应该相加再与文献中所述的CFU-GM量相比才是科学的，从总细胞和集落形成细胞数来说，反应器培养所得细胞可达到理想量的要求。CD34+细胞数虽然小于理想量，但也可满足最低量25×106细胞的要求。因此，如果利用该反应器一直补料培养，可以从一份脐血培养得到足够用于临床的细胞量。

讨 论

造血干/祖细胞移植目前在临床中主要用于造血干/祖细胞缺陷性血液病、先天性免疫病、各类自身免疫病、及实体瘤的治疗，是一种重要的细胞治疗手段。脐血造血干/祖细胞作为一种造血干/祖细胞来源，

由于数量较少，在临床上只能用于儿童患者，要应用于成人患者则必须通过体外扩增增加其数量，其中培养环境中的溶氧、pH、细胞因子、培养方式等对扩增效果有重要影响。因此，要实现造血干细胞体外扩增技术在临床上应用，需要开发出足够大规模、标准化的培养系统以及相应的扩增工艺。本研究采用搅拌式生物反应器在临床规模扩增了脐血单个核细胞，扩增得到的细胞中代表造血干/祖细胞的CD34+细胞、CFU-GM、CFU-Mk等细胞的含量均较常规的静态培养高，更适于临床应用。而且，其培养规模达到了临床应用中所需移植细胞量的要求。

溶氧是造血细胞发育的重要调控因子，很多报道都表明，低氧分压（1％-5％）比正常氧分压（20％）有利于造血干/祖细胞的维持和扩增［6］，因此，我们在生物反应器中控制的溶氧为饱和空气的25%，这与5％氧分压相当。实验表明，反应器培养中不但细胞扩增倍数高，所得细胞中CFU-GM、CFU-Mix、CFU-Mk，CD34+细胞的含量都高于方瓶培养的结果，而且维持时间比方瓶中长，这应该与反应器中所维持的低溶氧有关。

值得注意的是，在本系统中虽然在一定程度上可以减缓造血干/祖细胞的分化速度，但并不能从根本上解决培养过程中造血干/祖细胞的分化问题。另外，本实验中所检测的各类集落形成细胞及CD34+细胞都仅能代表造血祖细胞，因此其扩增情况只能代表祖细胞的扩增，如果要确定造血干细胞是否真正实现了扩增，则需要进行SCID小鼠体内造血重建实验才能够确定。

Collins等［3］也用400 ml的有pH和溶氧控制的反应器进行了脐血造血细胞的培养，其2次实验中总细胞分别扩增了约35倍和200倍，而CFU-GM分别扩增了约23倍和30倍，我们的结果与之相比相差不大。Kim等［7］在不控制pH和溶氧的转瓶中进行了骨髓造血细胞的培养，培养中只添加细胞因子组合IL-3、SCF、GM-CSF和EPO，结果总细胞和CFU-GM只扩增了8倍和5倍。在此基础上添加基质细胞条件培养基显著提高了总细胞的扩增，CFU-GM扩增也提高到了17倍，CFU-GM含量大大增加。我们的实验中所添加的细胞因子为IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF和G-CSF，其中促分化的IL-3、GM-CSF和G-CSF添加量都较小，分别为5 ng/ml、2 ng/ml、2 ng/ml，这对防止细胞过早分化有一定作用。如果在此基础上进一步优化培养基，如添加基质细胞条件培养基或FL和TPO等能促进干细胞增殖的细胞因子等，有望进一步提高造血干/祖细胞的增殖。

除造血干/祖细胞外，为缩短粒细胞和血小板的恢复期，以及为放疗和化疗提供辅助治疗，临床中对粒细胞、巨核细胞、红细胞等成熟细胞的需求也很大，因此，培养成熟细胞也是造血细胞体外扩增的重要内容之一。Neildez-Nguyen等［8］在体外培养红细胞前体细胞的实验中所培养的总细胞数达1010个，这些前体细胞在输入小鼠体内后可分化为成熟的红细胞，对于如此大规模的成熟细胞培养，应用搅拌式生物反应器将更有优势。

【参考文献】

1Jaroscak J，Goltry K，Smith A，et al. Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation with ex vivo-expanded UCB cells: results of a phase I trial using the AastromReplicell System. Blood，2003；101: 5061-5067

2McNience I，Briddell R. Ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells and mature cells. Exp Hematol，2001；29: 3-11

3Cabral J M S. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells in bioreactors (review). Biotechnology Letters，2001；23: 741-751

4Collins PC，Miller WM，Papoutsakis ET. Stirred culture of peripheral and cord blood heatopoietic cells offers advantages over traditional static systems for clinically relevant applications. Biotechnol Bioeng，1998；59: 534-543

5Collins PC，Nielsen LK，Patel SD et al. Characterization of hematopoietic cell expansion，oxygen uptake，and glycolysis in a controlled，stirred-tank bioreactor system. Biotechnol Prog，1998；14: 466-472

6Hevehan DL，Papoutsakis ET，Miller WM. Physiologically significant effects of pH and oxygen tension on granulopoiesis. Exp Hematol，2000；28: 267-275

生物细胞的培养范文第2篇

关键词：医学细胞生物学实验；创新能力；培养方法

中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）32-0123-02

近年来，人类在医学细胞生物学取得的成就对现代医学的发展起到巨大的推动作用，它为人们从细胞和分子水平认识人类疾病的发生和发展提供了理论依据和重要的技术手段。医学细胞生物学同时作为生理学、免疫学、组织胚胎学、药理学等重要基础理论课程的基础，医学细胞生物学又与临床医学的其他各个学科紧密相连，为医学生进一步学习其他医学课程奠定基础[1]。医学细胞生物学实验是医学细胞生物学教学的重要组成部分，提高医学细胞生物学实验的教学水平对于提高整体的医学教育水平有重要的推动作用。在实验教学过程中如何提高学生分析问题和解决问题的能力、培养学生的实践能力和创新能力成为十分重要的任务。为此笔者根据我院医学细胞生物学实验的教学实际情况，就在医学细胞生物学实验教学中培养学生的创新能力提出自己的几点建议，以供探讨。

一、实验教学与理论教学将结合，正确引导和激发学生的实验欲望

孔子说：知之者不如好知者，好知者不如乐知者。兴趣是最好的老师。很多学生在高中就接触过一些生物学实验，但是比较简单，而且动手的机会并不多。大多数学生直接动手做实验的兴趣很强，但是此时学生的实验兴趣都停留在对实验本身的好奇心上，对于“为什么会这样设计实验”和“这样设计实验会出现几种结果”等问题缺乏深层次的思考。教师要学会合理利用学生的好奇心，认真加以引导，把学生的好奇心转化为理性思考支配下的求知欲。细胞生物学的概念、原理和规律都是通过大量的实验发现，经过一系列缜密的推理论证得到的，每一个重要的原理和规律的背后都有一系列经典的实验去证明它。比如：在理论课讲授细胞分化的本质特征是基因选择性表达的时候，我们重点讲解如何证明这一结论的实验——通过采用Northern和Southern的方法来检测三种组织来源不同的细胞（红细胞、胰岛细胞、输卵管上皮细胞）中三种特异表达基因的DNA和mRNA的情况。通过对实验背景、实验方法以及实验过程的详细讲解，引导学生在自己的头脑中“进行实验”，进而让学生了解科学家们是怎么针对研究目标设计实验的，在学生进行“头脑实验”的同时又是与科学家进行科学思想上的“对话”，增强学生的兴趣和求知欲。最后，让同学们思考，为了揭示细胞分化的本质，我们自己能否设计出新的实验来阐明这一科学问题。我们通过在理论课上讲授一些经典的实验，激发学生的实验兴趣和探索未知世界的欲望，探索未知世界的欲望越大，成功的欲望也就越大，创新思维也就越活跃。

二、在实验教学过程中，培养学生的创新能力

医学细胞生物学实验教学过程作为培养学生实验创新能力的主要环节，在这一过程中，通过学生通过自己亲自操作进行创新能力的锻炼与培养[2]。在理论课上，通过教师对实验的正确引导，学生除了对实验有了正确的认识，同时对实验的积极性还大大增强，在渴望实验成功的欲望驱使下，每个学生都想在实验中“一展身手”。根据已有经验，我们认为在实验教学过程中，以下几点是培养学生创新能力的关键：①培养严谨的实验态度，严格规范实验操作。严谨的实验态度是进行创新能力培养的基础，规范严格的实验操作是进行创新能力培养的关键，如果学生缺乏严谨的态度，那么他就不可能有规范的实验操作，更谈不上学生的实验能力与创新能力的培养[3]。②培养观察能力，认真做好实验记录。为了避免学生只重视实验结果，我们要求学生认真记录下整个实验过程，让学生明白每一步实验的目的是什么的，会出现什么样的结果，省略此步骤，对实验结果有什么影响，比如细胞内遗传物质的观察，我们要向学生提出为什么要在细胞染色之后都要经过一步清洗，清洗的目的是什么，让同学多做一组省略清洗步奏的装片，让学生通过观察得出清洗步骤的作用，这样学生观察能力得到提高，分析思维的空间也得到了相应的拓展。③鼓励学生进行多种尝试，启发学生的思维。比如我们在洋葱细胞核观察的实验过程中，实验步骤要求采集洋葱内表皮细胞进行染色观察，我们鼓励学生，让学生同时采集洋葱外表皮的细胞进行观察，看看能否观察到细胞核，细胞核的形态有没有变化，从而启发学生对细胞核的功能进行深入思考，开阔了思路，激发创新意识。

此外，在实验过程中，如果有学生实验失败，很容易产生挫败感。教师要善于抓住这个“良机”，学生实验的失败是激发学生进行深入思考和创造性解决问题的重要时机。告诉学生，很多重要的发现都是通过一次次的实验失败得来的，爱迪生每失败一千次实验才能成功一次。接下来，根据实验记录，和学生一起寻找失败的原因，但这不是直接告诉学生实验失败的原因，而是通过一步步的进行引导，让学生自己找到实验失败的原因。在学生自己找出实验失败的原因的过程中，激发学生的思维，培养学生的创新能力。

三、邀请专家讲座，拓展学生知识面

拓展学生的知识面有利于学生创新能力的培养。医学细胞生物学属于实验性学科，细胞生物学知识的获得均是通过千百次的实验获得的知识的总结和升华，细胞生物学实验过程本身需要丰富的创新性。因此我们定期邀请工作在细胞生物学科研第一线的相关专家进行做报告，通过专家们通俗易懂的报告，向同学介绍他们是怎么设计实验的，他们采用此种方式设计实验的目的是什么？同学通过了解专家们的思维活动，进而激发他们的思维，激励他们在医学细胞生物学实验中主动进行创新，进而培养他们的创新能力。

四、定期举办学术沙龙

定期举办学术沙龙，通过学生间的自由讨论，激发学生思想的火花。我们医学院每年培养五十名左右的研究生，我们充分利用这一资源优势，每学期举办三次学术沙龙，每次时间大概两个小时左右，邀请细胞生物学方向的研究生与本科生一起参加，教研室的教师充当引导作用的角色，让本科生与研究生之间进行充分的交流。为了提高学术沙龙的效率，我们每次沙龙活动设定几个议题，让学生围绕设定的议题进行充分的讨论，另外，我们还专门留出时间，让每个学生自由提出他们感兴趣的问题，之后师生共同解决。学术沙龙我们已经举办过六期了，学生的反响和评价都很好。

五、改革考核评价机制，检验创新成果

以往医学细胞生物学实验的考核方式以学生提交实验报告，教师打分的形式进行。学生只注重完成实验报告，看不到他们的实际操作情况，学生只会把主要精力放在完成实验报告的上来，此外，这种考核形式造成学生之间相互抄袭的现象存在，教学效果大打折扣。针对此类现实情况，我们采用多元化的考核方式，考试内容包括设计的能力、实验操作能力和实验报告，通过三方面结合来考核学生创新能力的培养成果。设计实验的能力运用已经学习的实验原理、技术和方法设计实验，来达到预期的目的，学生通过实验能力的测试，提高自身对已有实验的掌握和应用能力。通过实验操作能反映学生的科学态度、科学精神，全面养成学生良好的科研习惯，从而促进学生综合素质的全面提高。实验报告侧重对学生操作步骤、数据处理、结果分析能力进行考察，能够反映学生的科学思维及逻辑推理能力。尽管我们的医学细胞生物学的实验教学改革刚刚起步，但是通过实验教学的各个环节以提高学生创新思维为指导，学生的创新能力得到不同程度的提高，比如在学校进行的大学生科技创新大赛中，医学细胞生物学的相关实验研究受到了学院的好评。同时与未进行实验改革的前几届学生相比，学生们的基本操作、动手能力和运用知识的能力得到显著的提高。

参考文献：

[1]黄元河，潘乔丹，冯治，等.医学细胞生物学教学改革的探索与实践[J].右江民族医学院学报，2011，33（2）：231-232.

[2]何志颖，朱海英，陈元晓，等.医学细胞生物学实验教学改革的探索与实践[J].山西医科大学学报（基础医学教育版），2010，12（1）：49-52.

[3]殷祥超.改革专业实验教学培养学生的综合素质[J].实验室研究与探索，2003，2：31-33.

生物细胞的培养范文第3篇

[关键词]细胞微环境；无血清培养体系；再生医学领域

中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）21-0308-01

1 无血清培养体系简介

无血清培养体系是在合成培养体系的基础上发展而来的，主要是寻找替代血清的各种可能性，使无血清培养既能进行细胞培养，又可以避免血清带来的不利影响。与含血清培养相比，具有很多的优点，无血清培养技术的发展是从上世纪七十年代开始的，其中基于生产安全性的重组药物而开发的无血清培养基，不用动物做为蛋白来源，降低了成本也加快了报批的速度，后来逐渐发展成为培养基的组成成分全部为化学已知物，更易进行目标蛋白的分离纯化，要求培养的细胞要具有较高的特异性。

一般无血清培养体系由基础培养和替代血清补充因子两部分组成，其中基础培养是零添加血清的合成培养基，按照细胞的生长要求将各种微量元素和营养物质进行合成为基础培养基。补充因子是代替血清的各种因子，包括激素、生长因子、结合蛋白等，在所有的补充因子中，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠是细胞在无血清培养基中生长所必须的，是必须具备的补充因子。

2 无血清培养体系在再生医学领域的应用

2.1 无血清培养基研制配方的应用

研究人员研究发现在无血清合成输卵管液培养基中加入胰岛素、转铁蛋白和硒，可以提高动物胚胎的发育质量，再加入牛血清白蛋白后，可以促进囊胚的发展，可以促进细胞的增殖实验。CHO、Vero等工程细胞是单克隆抗体和基因工程药物的表达载体，在对无血清培养基的研制时，要满足增殖的需要，同时也要表达目的产物。例如CS-NS0细胞是抗-CD25单克隆抗体的表达体，无血清低蛋白培养基可以满足大规模培养和抗体表达的要求，批培养最大活细胞密度和最大抗体浓度都达到很高。基于人胚肾细胞培养的无蛋白培养基，可以用于对抗聚乙烯介导转染慢病毒，具有较高的滴度，成本也较低。针对Vero细胞源乙型脑炎疫苗而研制的无血清培养基，没有任何动物源性成分，疫苗只要添加稳定剂，就可以在常温下保存。

2.2 无血清培养体系在细胞增殖方面的应用

雌二醇是无血清培养基中经常添加的激素，如果其浓度较高，会抑制毛囊的生长；PDGF、TGF-β、FGF是三种信号通路，可以促进间质干细胞的生长分化，如果其中之一受到抑制作用会影响间质干细胞的生长，如果三种信号通路结合好，则会使间质干细胞在培养基中传到五代。如果无血清培养基钙浓度较低，下调Smad蛋白介导会维持角膜基质细胞的表型，角膜的上皮细胞也可以长期进行传代培养。中草药是我国的传统医学代表，细胞无血清培养技术也影响到中草药的作用机制，研究显示黄芪可以增加人皮肤表皮干细胞将粒酶转化为录酶，并增强其活性。

2.3 无血清培养基在细胞和组织移植中的应用

无血清培养体系安全性较高，所以广泛应用于基于生物细胞培养的细胞或组织移植治疗中。在无血清培养基中培养骨髓基质干细胞，可以获得与含血清培养基相同的增殖效果，如果患者属于特殊贫血类型并且体重较轻，可以诱导人体成骨，并可以抑制异位骨，这方面比含血清培养更具有优势。采用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞，可以在无血清培养的条件下抑制细胞的凋亡，使骨髓间充质干细胞可以存活于下肢缺血性疾病的治疗中。

如果某些细胞和组织具移植的可能性，如果研制的培养基可以长久的维持细胞特性，这将会促进移植的成功率。新鲜刚分离的肝细胞具有特有的分化属性，此属性如果存在于含血清培养基中就会丧失掉，如果在无血清培养基中添加地塞米松、表皮生长因子、垂体提取物等，肝细胞就会保持3-4周的分化属性，这对于需要肝部移植的患者来说，是一大福音。对由幼年牛软骨外植体组成的无血清培养基进行观察后发现，外植体的力学性能和生物含量得到了有效的加强，其性能一直比较稳定，细胞充满活力。含血清基外植体的力学则有所下降，并且损失了一定的聚糖并发。这充分说明了无血清培养基可以延长成熟细胞的特性，在组织互作无血清培养体系中，需要添加特定的材料来介导才能促进上皮间质的互作。

2.4 无血清培养基在肿瘤治疗方面的应用

无血清培养基具有许多优点，包括可以使细胞生存所需的营养物质得到保证，除掉了血清中的促分化剂，对于肿瘤的发现和治疗具有重要的应用价值。无血清培养可以增加SP2/0细胞中的瘤细胞，这些瘤细胞都具有干细胞特性，可以将SP2/0中的肿瘤干细胞进行富集。细胞外基质可以影响肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，无血清培养基中加入纤维连接蛋白后来培养人乳腺癌细胞，可以上调基质 金属蛋白酶的活性。单克隆抗体可以阻断整合素，可以抑制基质金属蛋白酶的活化反应。在进行肿瘤治疗时，对体外诱导扩增CIK细胞及抗肿瘤活性进行研究，分别采用无血清培养和含血清培养基，结果显示无血清培养基可以代替含血清培养基，某些方面还有含血清培养没有的优势。研究人员研究了适合于B16黑色毒瘤细胞培养的无血清培养基，对树突状细胞进行预防。这说明无血清培养的免疫活性细胞可以用于肿瘤的生物免疫治疗。

2.5 无血清培养基在外周血淋巴细胞抑制中的应用

抑制外周血淋巴细胞的无血清培养基是一种生物制剂，主要成分是凝集素、基础培养基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重组人胰岛素、柠檬酸铁和氨基酸母液，外周血淋巴细胞培养基不用动物或者人的血清，不仅降低了培养基成本，还可以降低疾病的传播，此淋巴细胞培养基可以增强淋巴细胞的转换率，促进淋巴细胞的分裂，抑制效果显著，可以广泛用于染色体核型的临床诊断，是康复率低的淋巴疾病的福音。

3 小结

无血清培养体系具有含血清培养体系无法达到的优势，但需要在培养通用性、生产高效性以及成本和安全方面进行改进，未来随着对细胞营养、细胞代谢 、细胞凋亡以及外源蛋白表达等的不断研究，采用更多的科学实验方法，可以使无血清培养基的开发更加快捷，使模拟细胞微环境的无血清培养体系可以广泛应用于生物科学领域，特别是再生医学领域，为更多的疑难杂症以及再生性疾病提供更多的服务。

参考文献

[1] 董书伟，冯秀亮等. 昆明小鼠原始生殖细胞无血清培养基的筛选，西北农林科技大学出版社，2008，36（4）：27-31.

生物细胞的培养范文第4篇

[关键词]涉外警务专业学生 出入境管理工作 情报信息应用能力 培养

伴随着21世纪的到来， 世界范围内的科技革命突飞猛进，数字化、智能化、网络化等各种高新技术正向各个领域全方位渗透，警务方式也发生了革命性的变革，情报主导警务模式便成为当前警务工作方式的主流。面对新型警务模式的建立，出入境管理部门必须主动适应信息化社会的客观要求，牢固树立情报信息主导警务的观念，切实增强出入境情报信息管理工作的针对性、有效性和预见性，推动出入境管理工作的全面和可持续发展。

一、加强涉外警务专业学生情报信息应用能力的培养是为从事出入境管理工作垫定基础。

（一）情报信息的应用是出入境管理工作中的中端业务。

出入境管理部门作为一个涉外的、公开实施行政管理的部门， 主要是代表国家行使出入境管理职能， 不仅其自身业务的发展和提高离不开情报信息工作， 而且出入境管理部门还必须通过开展和加强情报信息工作，为建设公安信息化队伍的整体工作服务。

（二）当前出入境管理工作中情报信息应用存在的问题。

1.出入境管理部门中公安民警的情报素质相对较低具体表现在以下几个方面：（1）公安民警对出入境情报信息收集工作的认识不够， 在思想上还停留在单纯以上报数量或获取名次来衡量工作成绩的倾向。（2）公安民警发现情报信息的敏感性不足，缺乏一名合格情报人员对情报信息所应具有的职业敏感性。（3）公安民警收集情报信息的方法不得当，对于情报信息的收集仅仅停留在直接获取的层次，而对于间接收集情报信息的方法没有做深入研究。

2.情报信息在出入境管理工作中没有得到全面发挥。由于出入境管理部门中公安民警的情报素质相对较低，对于公安情报信息系统的使用也不够熟悉，一些建立得较为完善的信息系统，大多还停留在资料库、数据库的利用上，只发挥出有限的查询功能，系统更高级的功能没有得到发挥。这是致使情报信息在出入境管理工作中没有得到全面发挥的主要原因。

3.出入境管理部门的公安民警在情报信息应用方面的培训与实战脱轨。出入境管理部门十分重视情报信息在其工作的重要作用，也经常给内部民警做业务培训。问题的关键是培训的内容针对性不强，只是围绕公安系统的大框架介绍情报信息的应用，而没有针对出入境管理工作中情报信息的应用展开分析。导致公安民警所学知识与实战脱轨，无法适应实战。

（三）加强涉外警务专业学生情报信息应用能力的重要性。

当前，出入境管理部门情报信息工作面临的严峻形势要求公安院校必须加强涉外警务专业学生情报信息工作能力的培养。作为涉外警务专业学生，我们肩负着维护祖国出入境管理秩序，保卫祖国边防安宁的神圣使命，因此必须要树立正确的世界观、价值观、人生观，努力提升自己，以适应社会的需求，适应出入境管理工作对出入境人才的需求。

二、涉外警务专业学生在出入境管理工作中情报信息应用能力的培养目标。

（一）培养学生学习情报信息的积极兴趣。

1.大力给学生贯彻情报主导警务的理念，让学生认识到情报信息应用能力在出入境管理工作中的重要意义。教师在平日的教学中要让学生认识到情报信息是出入境管理工作的生命线，是科学决策的基础，及时、准确、适用的情报信息是出入境管理部门克敌制胜的法宝。当情报主导警务的理念深入学生心中时，他们学习情报信息的兴趣也会有很大的提高。“良好的开端是成功的一半”，只要激发出了学生学习情报信息的兴趣，就能将他们培养出他们在出入境管理工作中情报信息应用能力。

2.促成学生研究情报信息知识的主观能动性，让学生形成主动在出入境管理工作中应用情报信息的潜意识。学习情报信息知识的特点在于易学难精，所以对学生而言，只有学习情报信息知识的一腔热血是远远不够的，最重要的是要有研究情报信息知识的主观能动性。自觉地在情报信息知识的领域内钻研，领会情报信息知识的精华所在，自如的将情报信息应用到出入境管理中去，形成一种在出入境管理工作中应用情报信息的潜意识，提升自身在出入境管理工作中情报信息应用的能力。

（二）培养学生在出入境管理工作中情报信息的收集能力和判断能力。

1.提醒学生多留意出入境管理各方面的信息资源，让学生养成积极捕捉情报信息的好习惯。“凡事预则立，不预则废”，情报信息工作能力的形成是一个漫长而艰巨的过程，在这期间需要大量的情报信息的积累。因此教师在平日的学习生活中要提醒学生多留意出入境管理各方面的信息资源，让学生养成积极捕捉情报信息的好习惯。“世事洞明介学问，人情练达介文章”，通过大量信息情报的积累，学生的思维无意识就会向情报信息方面靠拢。当这种思维过程已经成为习惯性模式嵌入意识深处，变为一种自觉心理倾向，情报意识也就形成了。

2.增强学生对出入境情报信息的职业敏感性，让学生形成敏锐的情报判断能力。出入境情报信息工作做为一项特殊行业的工作，欲将其做好，必须增强对情报信息的职业敏感性，形成敏锐的情报判断能力。对于情报判断能力的提高需从两个方面着手：一是对相关信息进行初步的分析研判， 防止大量信息垃圾的污染， 提高情报的收集效率。二是对情报进行系统的分析， 各方面信息综合考虑， 相互比对、印证， 这样能够保证情报分析研判工作的准确性， 实现情报的优势。

（三）培养学生出入境管理工作中情报信息应用的创造性。

1.丰富学生在出入境情报信息方面的知识，让学生在出入境情报信息方面的思维得到扩展。情报信息方面的知识不是一成不变的，是不断更新的，其更新周期的不断缩短就要求我们不断更新知识。教师应着力丰富学生在出入境情报信息方面的知识，增强学生出入境情报信息知识需求意识，提高他们的检索技能，通过大量的出入境情报信息知识的积累，使学生在出入境情报信息方面的思维得到扩展。

2.肯定学生在出入境情报信息领域内的想象力，让学生在出入境情报信息应用之中添加自己的创新之处。出入境情报领域是一个没有边界的领域，在没有边界的学科研究中就不能否认学生独到的见解之处。就出入境情报信息应用而言，学生往往会想出很多新的方法将情报信息更好的衔接在出入境管理工作之中。此时，作为教师就应该肯定学生在出入境情报信息领域的想象力，让其在以后的工作中发挥更大的创造力。

三、涉外警务专业学生在出入境管理工作中情报信息应用能力的培养途径。

（一）加强涉外警务系教师情报主导警务的理念，激发学生学习情报信息的兴趣。

出入境情报信息工作是一项实践性很强的工作，学生欲想了解其中的技巧性，仅仅通过聆听缺乏实战经验的教师讲述理论知识是远远不够的。因此公安院校必须邀请长期从事出入境情报信息工作的民警来学校给教师和学生授课、作讲座，介绍出入境管理中情报信息工作的经验与做法。同时选派涉外警务系的教师到出入境管理部门挂职锻炼，增强出入境情报信息工作实践经验，提升教师队伍的素质和授课水平。教师要积极关注国内外有关出入境情报信息工作的最新动态，了解出入境管理工作中情报信息应用的最新方法，及时传递给学生，活跃学生思维，激发他们学习情报信息的兴趣，培养他们出入境情报信息应用意识，提高他们在出入境管理工作中情报信息应用的能力。

（二）加强学生在出入境管理工作中情报信息实际应用能力，让其在实践工作之中提升自身情报信息的收集能力和判断能力。

出入境信息工作极具实践性的特性要求学生必须具有实际应用能力。教育与实践相结合是提高情报信息应用能力的根本方法，因此校方应该加强学生在出入境管理工作中情报信息实际应用能力，尽可能多的让学生到出入境管理部门进行实习工作，更多的接触出入境管理工作中情报信息方面的知识。学生要积极利用见习和实习的机会，把在学校所学的有关出入境情报信息工作的理论运用到实际出入境管理工作中，在实践工作中提升自身情报信息的收集能力和判断能力。

（三）拓宽学生在出入境情报信息领域之中的知识面，努力开发其在出入境情报信息应用之中的创新潜能。

出入境情报信息领域所涉及的知识十分广阔，并且知识的更新周期也日渐缩短。因此教师应该尽可能多收集国内外有关情报信息的书籍，开拓情报信息工作的思路。同时应该通过讲座、培训的形式给学生讲授与出入境情报信息有关联的学科的基础知识，特别要重点讲授手工检索、国际联机检索等知识，使学生尽早掌握常用的中外检索工具的使用方法，接触到出入境情报信息领域内的更多更新的知识。学生通过研究出入境情报信息方面的知识，得出自己在出入境情报信息工作上的独到见解，努力开发自身在出入境情报信息应用中的创新潜能。

四、结语

总而言之， 在情报主导出入境管理工作的体系下公安教育也应与时俱进， 注重涉外警务专业学生在出入境管理工作中情报信息应用能力的培养，使学生毕业后适应情报主导出入境管理体系下的工作要求，推进出入境管理工作信息化的建设。

参考文献：

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[3]靳慧云.大情报信息体系下公安院校学生信息应用意识与能力及培养[J].河北公安警察职业学院学报，2010.

生物细胞的培养范文第5篇

关键词：半夏；悬浮细胞；生物碱；茉莉酸甲酯；水杨酸

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.021

中图分类号：R282.6 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）01-0087-04

Effects of Abiotic Elicitors MeJA and SA on Alkaloids Accumulation and Related Enzymes Metabolism in Pinellia ternata Suspension Cell Cultures DUAN Yong-bo， LU Fang， CUI Ting-ting， ZHAO Feng-lan， TENG Jing-tong， SHENG Wei， ZHANG Ai-min， XUE Jian-ping （Key Laboratory of Resource Plant Biology of Anhui Province， College of Life Sciences， Huaibei Normal University， Huaibei 235000， China）

Abstract： Objective To study the effects of abiotic elicitors methyl jasmonate （MeJA） and salicylic acid （SA） on the alkaloids accumulation and related enzymes metabolism in Pinellia ternata suspension cell cultures. Methods Using the leaf petioles-derived suspension cell cultures as the study object， the culture duration， concentrations of MeJA and SA were determined to get the optimal alkaloids accumulation， and the activities of metabolic enzymes IMP dehydrogenase and sAMP synthase were also measured. Results A 9-fold of dried biomass and a 3-fold of alkaloids accumulation were observed in P. ternata suspension cell cultures after culture for 21 d. Both MeJA and SA could significantly promote the accumulation of alkaloids in P. ternata suspension cells. 150 ?mol/L MeJA enhanced alkaloids content （4.7 mg/g DW） by 3.6 folds in comparison with control group， whereas 50 ?mol/L SA showed a 2.5-fold increase. Meanwhile， 100 ?mol/L MeJA and 50 ?mol/L SA promoted the increase in IMP dehydrogenase activity by 3.0 and 3.7 fold respectively， and 150 ?mol/L MeJA and 100 ?mol/L SA showed the increase by 2.6 and 4.4 fold respectively. Conclusion Proper adding exogenous MeJA and SA can promote the accumulation of alkaloids in Pinellia ternata suspension cell cultures.

Key words： Pinellia ternata； suspension cell cultures； alkaloids； methyl jasmonate； salicylic acid

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.为天南星科

基金项目：国家自然科学基金（31501368、81573518）；安徽省自然科学基金（1408085MC58、1608085MC52）；安徽高校省级自然科学研究项目（KJ2016B016、KJ2015ZD35）

通讯作者：薛建平，E-mail：

多年生草本植物，其药用功效最早记载于《神农本草经》。半夏以块茎入药，具有燥湿化痰、止咳镇痛的作用，已成为我国最常用的十大中药之一[1]。半夏富含生物碱、β-谷甾醇、多糖、挥发性油等，其中生物碱被视为其主要活性成分[2]。在半夏生物碱中，胡芦巴碱含量常被作为半夏质量控制指示，肌苷则用作半夏的鉴别性成分[3-4]。

作为大宗中药材，半夏年需求量达500～600万kg，而野生和人工栽培产量仅能满足1/3，市场缺口很大[5]。自然状态下，半夏极少进行有性生殖，主要通过珠芽或块茎进行营养繁殖，繁殖系数低[6]。长期过度采伐导致野生半夏资源濒于枯竭，而人工栽培依然面临高温、干旱、病虫害以及人工成本等多方面因素的影响，难以满足半夏药材的市场需求。

悬浮细胞可在人为控制条件下实现活成分的生产，为解决药用植物资源不足和成本控制提供了新途径[7]。茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）为重要的信号分子[8]，常被用于植物次生代谢途径研究。本研究以半夏悬浮细胞系为研究对象，考察外源MeJA和SA对生物碱合成和相关代谢酶活性的影响，以期为利用半夏悬浮细胞系生产生物碱提供依据。

1 仪器与试药

YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；HJH-C2112C超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；QHZ-98B全温度光照震荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；KQ-500超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.4）、氯仿及溴麝草酚蓝标准溶液，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）及盐酸麻黄碱等试剂均为Sigma-Aldrich产品。试验所用半夏植株采自淮北市龙脊山自然风景区（E-116°23′，N-34°14′），经薛建平教授鉴定为宿半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit。

2 方法与结果

2.1 半夏悬浮细胞体系构建

半夏愈伤组织诱导培养基为MS+3%蔗糖+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L KT+0.65%琼脂，pH 5.8；细胞悬浮培养基为MS+3%蔗糖+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D，pH 5.8[9]。愈伤组织诱导培养条件为25 ℃黑暗培养；悬浮细胞培养条件为（23±1）℃，光照周期为14 h/10 h光暗交替，光照强度为3000 lx。

取半夏叶柄置于0.1%氯化汞浸泡6 min，无菌水润洗5次后剪成约1.0 cm长段，接种至愈伤诱导培养基，于25 ℃黑暗培养。3周后获得愈伤组织，将所获愈伤组织继代培养3～5次。选取质地松脆的颗粒状愈伤接种至液体培养基进行悬浮培养（100 r/min），每15 d更换新培养基，直至获得稳定细胞系。将所获细胞系在8 ℃低温处理24 h，然后于25 ℃恢复培养36 h使细胞周期同步。之后在23 ℃培养9 d使同步化细胞进入对数生长期，获得半夏悬浮细胞系。

2.2 盐酸麻黄碱标准曲线的绘制

精密称取10 mg盐酸麻黄碱对照品溶解于氯仿中，定容至50 mL，摇匀，得0.20 mg/mL盐酸麻黄碱对照品溶液。精密吸取0、1、2、3、4、5 mL至分液漏斗内，添加蒸馏水补至5 mL，分别精密加入5 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.4）、10 mL氯仿及1 mL溴麝草酚蓝标准溶液，充分振摇后静置1 h，分取氯仿层，水层再用氯仿重复萃取2次，每次10 mL。合并氯仿层，60 ℃水浴回收至干，用氯仿溶解，定容至10 mL[10]。于414 nm波长处分别测定其吸光度。以盐酸麻黄碱浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标，求得标准曲线为A=0.062C-0.076 8，r2=0.996 0（n=5）。

2.3 生物碱含量测定

整个培养周期持续28 d，每隔7 d取样，所获样品立即保存于-70 ℃冰箱供测试分析。将所收集悬浮细胞样品于50 ℃干燥后研磨成粉。准确称取0.1 g样品粉末置于25 mL具塞试管中，加浓氨水0.5 mL润湿，加氯仿10 mL后于4 ℃冷浸3 h；冰浴超声提取1 h后过滤，残渣以10 mL氯仿分3次（4、3、3 mL）洗涤；将滤液与洗液合并，回收氯仿至干，加入10 mL氯仿使其溶解并转移至50 mL分液漏斗中，精密加入5 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 5.4）和1 mL溴麝香草酚蓝标准溶液，充分振摇后，静置1 h。分取氯仿层，水层再用氯仿同法萃取2次，每次10 mL。合并氯仿层，回收至干，残留物用氯仿溶解，置于10 mL容量瓶中，并用氯仿定容、摇匀，即得处理组溶液[11]。取待测溶液2.0 mL，用DU730 Beckman Coulter核酸蛋白分析仪测其吸光度，代入盐酸麻黄碱标准曲线中，计算生物碱的含量。

2.4 培养时间对悬浮细胞系生物量和生物碱含量的影响

以半夏叶柄为外植体诱导愈伤组织，进行液体悬浮培养，获得半夏悬浮细胞系。随着培养时间延长，悬浮细胞干重总体呈现增长趋势，在21 d时细胞干重为培养前9倍，之后有所下降（见图1）；生物碱含量在培养7 d内含量较低，到14 d时显著增加，21 d时最高，达到1.56 mg/g DW，之后生物碱含量开始降低（见图2）。当培养时间超过28 d后，悬浮细胞会逐渐变为褐色，开始坏死。根据细胞生物量和生物碱含量测定结果，选择21 d作为悬浮细胞培养时间。

2.5 茉莉酸甲酯和水杨酸对生物碱含量的影响

试验用MeJA和SA浓度均为0、50、100、150、200 ?mol/L。MeJA处理对半夏悬浮细胞系生物碱含量有显著影响。除50 ?mol/L处理外，所试其他MeJA浓度均显著促进半夏生物碱合成。以150 ?mol/L MeJA处理组最高，达到4.7 mg/g DW。150 ?mol/L MeJA处理组的生物碱含量为对照组的3.6倍。在SA处理中，50和100 ?mol/L可显著提高半夏悬浮细胞系中生物碱的合成，更高浓度的SA则能促进生物碱的累积。50 ?mol/L SA处理组生物碱含量最高，为对照组的2.5倍。结果见图3。

2.6 茉莉酸甲酯和水杨酸对IMP脱氢酶和sAMP合成酶活性的影响

在添加不同浓度MeJA或SA培养21 d后，测定半夏悬浮细胞中IMP脱氢酶和sAMP合成酶活性。取不同浓度外源激素的半夏悬浮培养细胞各1.0 g置于预冷的研钵中，加提取介质在冰浴中研磨匀浆，4 ℃、1000 r/min离心15 min，上清液为酶粗提取液。将上述酶提取液加入相应的酶反应液，每隔30 s读取吸光度值。酶活性以比活力表示，定义为1 min内1 mg蛋白所能引起的吸光度值变化的1000倍[5]。

添加MeJA或SA均对IMP脱氢酶活性有显著影响。50～150 ?mol/L MeJA为对照组IMP脱氢酶活性2.6～3.1倍，当MeJA浓度增加至200 ?mol/L时，酶活性有所下降；50 ?mol/L SA处理对IMP脱氢酶活性影响最大，酶活性为对照组3.7倍，随浓度增加酶活性逐渐下降。结果见图4。

对于sAMP合成酶，50 ?mol/L MeJA对酶活性无显著影响（P>0.05），而较高浓度的MeJA显著提高酶活性（P

3 讨论

生物碱为重要的次生代谢物，是许多药用植物的主要活性成分。目前多种药用植物细胞内生物碱合成及代谢规律逐步得以揭示，对于研究这些植物的药用成分意义重大[12]。在诸多研究模式中，悬浮细胞系的应用极为广泛[13-14]，因其可为药用成分的生产提供另一途径，有助于解决药用植物产量的缺口，获得更高质量的产品，同时保护野生资源。

本研究以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细胞系，考察不同培养时间、MeJA和SA浓度对细胞中生物碱含量的影响，并分析生物碱合成相关酶活性。

在悬浮培养21 d时，半夏悬浮细胞干重增加了9倍，悬浮细胞中生物碱总量为培养0 d时的3倍，与Zhao J等[15]报道长春花悬浮细胞培养增殖结果接近。生物碱作为一种重要的次生代谢产物，其合成通常在细胞培养后期进行。添加较低浓度MeJA或SA不会影响半夏悬浮细胞的增殖，这在麻花艽悬浮细胞培养中同样得到验证[16]。同时，培养3周左右通常需要更换新鲜培养基，以补充营养成分并减少坏死细胞对培养的影响。因此，确定悬浮细胞系培养时间为21 d用于不同诱导子对生物碱累积影响的研究。

MeJA或SA作为重要的诱导子已用于萜类化合物等生物碱的代谢研究[17]。本研究表明，MeJA或SA处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中累积。培养21 d后，150 ?mol/L MeJA处理组生物碱含量为对照组3.6倍，50 ?mol/L SA处理组悬浮细胞生物碱含量达到对照组的2.5倍。同时测定了生物碱中嘌呤核苷酸生物合成途径中的关键酶IMP脱氢酶和sAMP合成酶活性的变化情况。添加MeJA或SA均能显著提高二者的酶活性。100 ?mol/L MeJA、50 ?mol/L SA处理使IMP脱氢酶活性分别为对照组3.0、3.7倍，150 ?mol/L MeJA、100 ?mol/L SA处理使sAMP合成酶活性分别为对照组2.6、4.4倍。比较生物碱累积量及所测代谢酶活性变化情况发现，生物碱累积与所测代谢酶活性变化趋势较一致，说明IMP脱氢酶及sAMP合成酶在半夏生物碱代谢中具有较为重要的作用。

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