非转基因检测报告

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇非转基因检测报告范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

非转基因检测报告范文第1篇

【关键词】宫颈细胞学;TBS报告系统;发展探讨

【中图分类号】R711 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)09-0238-01

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,居女性恶性肿瘤第二位。据慕世界卫生组织资料统计,每年约有50万宫颈癌新发病例,占癌症新发病例的5%,其中近八成发生在发展中国家。我国宫颈癌每年新发病例约为13万左右,约占世界宫颈癌新发病例总数28%左右,发病年龄有年轻化趋势。研究表明,宫颈癌及癌前病变与HPV感染,尤其是高危型HPV密切有关。在过去大半个世纪中,国内宫颈癌筛查的主要手段仍为宫颈脱落细胞学检查,而以巴氏涂片为主,并采用巴氏五级分类进行报告,使得宫颈癌的发生率与死亡率下降近70%。巴氏的贡献是巨大的,巴氏涂片已成为宫颈细胞学的代名词。自1988年国际上提出TBS报告方式,并由美国癌症中心细胞室于1994年向中国同行介绍以来,TBS报告方式逐步在我国各大医院所采纳。随着液基薄层细胞技术(TCT/LCT/LPT)的应用,也促进了TBS的推广,使得细胞学发展迎来了更大的机遇。宫颈细胞学检查技术应用于临床,半个世纪以来得到了不断发展,特别是近几十年来有了很大改进,由传统的巴氏涂片、染色、分类法逐渐发展到了液基细胞(TCT),自动涂片,染色和Bethesda报告系统

TBS分类系统是目前世界上公认的最科学、最先进的分类系统,它不仅弥补了传统巴氏分类的不足,实现细胞病理学术语与组织病理学术语的基本统一,而且通过计算机辅助阅片发放图文报告,能够为临床医师提供更多、更丰富、详细的诊断信息。此宫颈细胞学检验技术是一种既科学实用,且成本较低。“细胞刷”宫颈取材及液基细胞学,它能制备出高质量的宫颈细胞涂片,使细胞形态结构更加清晰,大大提高了宫颈癌的检出率(鳞癌),降低了漏诊率,使诊断水平逐步提高。

1 取材工具

“细胞刷”是公认的采集宫颈细胞效果最佳的工具,可获得丰富的宫颈细胞,CIN-Ⅲ级检出率高,并有助于检出来自宫颈柱状上皮的腺癌癌前病变。可获得较多的移行带细胞,包括化生细胞及宫颈管细胞。许多高龄妇女的鳞状――柱状上皮交界区大范围地被鳞状上皮化生取代,此时涂片上化生细胞比例可高于宫颈管细胞。因此,涂片中化生细胞和宫颈管细胞的多寡是衡量取材质量的指标之一。

1.1 采集方法:将“细胞刷”置于宫颈管内,达宫颈外口上方10cm左右,在宫颈内旋转360°,继而取出(最好转数周)。插入细胞稀释液管内,反复旋转冲洗数遍,将刷上细胞成分尽可能地洗入稀释液中,然后检测。

1.2 仪器:试剂、检测方法严格按鸿润生物技术有限公司提供的实验室使用说明书操作。

2 应用

TBS报告方式必然代替巴氏五级报告方式。巴氏五级报告主要集中在对细胞核异型性的描述,较抽象。 CIN-Ⅰ为轻度非典型增生是一种十分不稳定的状态,很容易逆转至正常,对这些病例应采取随诊观察,不必要进行任何治疗,要求半年复查一次即可。CIN-Ⅱ为中度非典型增生也是一种十分不稳定病变,可以逆转。有文献报告,有25%以上病例可逆转至正常。为此对细胞学诊断为CIN-Ⅱ的患者,不必立即进行手术治疗,而应强调随诊或进一步检查,如做DNA检测,活检等。CIN-Ⅲ为重度非典型增生,应进一步活检确诊证实,进行必要的治疗。

20世纪90年代,我国引进了液基细胞学制片技术,并逐步被国内各大医院所采用,尤其在北京、广州、上海及成都等地。由于液基细胞技术对宫颈癌及癌前病变敏感性高,漏诊率低且无创伤性,因些可作为癌前病变的筛查,对宫颈癌早防早治起到积极作用。液基细胞学制片技术(LIQUID-BASEDCYTOLOGYTEST)是以液基膜式薄层细胞学技术、液基离心沉淀式薄层细胞学为基础的制片技术,较有代表性。此外还有其他液基细胞制片系统及时性装置等技术。近年来,我国国产液基细胞学技术也得到了较大的发展,自液基细胞学问世以来,其液基细胞学制片检查结果与传统巴氏制片诊断结果的对比报道屡见不鲜,多数文献报道提示液基细胞学制片诊断可提高LSIL及HSIL的检出率,各类病变阳性检出率也明显高于传统巴氏方法检测结果。

3 对应用宫颈细胞学的建议

①取材要规范化,不断提高制片质量,以保证镜下诊断需要。

②重视细胞病理学科的建设和人才的培养。

③推广应用TBS报告方式。

④结合实际选择合适的细胞学制片方法及设备。

⑤客观评价细胞学在诊断中的价值,切勿以细胞学诊断代替组织学诊断。

4 讨论

TBS的基本内容是“子宫颈细胞学Bethesda报告系统”采用描述性诊断替代巴氏的数码分级式诊断。它包括:①无上皮内病变或恶性病变,包括多种微生物菌落、炎症、宫内节育器及放疗后的反应性和修复性改变;②鳞状细胞异常;③腺细胞异常;④来源于子宫外的各种肿瘤。其中鳞状细胞异常又分为:①非典型鳞状细胞,包括ASC-US及ASC-H两类;②低级别鳞状上皮内病变(LSIL),包括HPV感染及CIN-Ⅰ的细胞学改变;③高级别鳞状上皮内病变(HSIL),相当于CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ或中、重度异型增生及原位癌的细胞学改变;④鳞状细胞癌。腺上皮异常包括:①非典型腺细胞,性质未定,但非炎症所致,应标明来自宫颈或子宫内膜;②非典型腺细胞,倾向于肿瘤,应明确是否来自宫颈管,其余则不能确定来源;③腺癌,分为子宫颈管型及子宫内膜型。

非典型增生的病变(CIN)和原位癌乃是同一疾病的连续不同程度的组织学改变,二者具有相同的病因学、生物学特性和自然病程,为恶性肿瘤的前驱病变,具有在将来的某一时间演变为癌的可能。同一宫颈常同时出现不同程度的CIN当然最主要的是最重要的病变。CIN是一个以轻度发育不良到重度异型性伴上皮全层层次消失的组织学图像。

TBS报告系统的特点是除各种细胞判读结果外,还包括了相应处理的建议,须知细胞学检查结果是对病人作进一步检查的依据,而不是进一步治疗的凭证。不同的宫颈判读结果需要采用不同方法进一步检查,以明确病变性质。如有的需要定期复查,有的需要作阴道镜及宫颈活组织检查,有的需要检测HPV的类型等。

非转基因检测报告范文第2篇

让世界了解中国消费者。“我愤怒是因为雀巢的不诚实，这是对中国消费者的不尊重！”

上海消费者朱燕翎女士曾留学瑞士。在留学期间她曾参观过雀巢公司总部，该国际大食品公司严格的管理和高超的工艺给她留下深刻的印象，所以3年来她就一直给自己的宝宝食用雀巢产品。

2003年3月，她同往常一样，在上海家乐福购买了一袋价值六元八角人民币的“雀巢巧伴伴”。后来她偶然从网络上获知在国内销售的“雀巢巧伴伴”食品中含有转基因成分。她即查看自己在上海家乐福购买的那一袋“雀巢巧伴伴”，发现没有标注含转基因成分。原以为不标的雀巢产品就是不含转基因的，却没想到其含有转基因成分。朱燕翎认为此行为是故意隐瞒，属欺诈行为。

2003年12月14日，朱燕翎以一名中国普通消费者的身份飞赴瑞士苏黎世；16日，她赶赴雀巢公司总部，递交公开信。在这封英文信函中，朱燕翎表示：“三年前我有了自己的小孩，我毫不犹豫地为他选择了雀巢食品。源于我对雀巢产品的热爱和信赖。我也一直很关注雀巢在中国的发展。”

“然而有一天，我非常震惊地在网上发现雀巢‘巧伴伴’食品含有转基因成分！当我确定雀巢‘巧伴伴’的确含有转基因成分并且没有在包装上明确标注时，震惊变为了愤怒。我在不知情的情况下竟然给我的孩子食用了转基因食品！

“ 愤怒是因为雀巢的不诚实。这是对中国消费者的不尊重。我决定对雀巢提起法律诉讼。我要求的损害赔偿额是很小的。但是我坚信中国消费者有权利知道他们为自己的家庭购买的是什么样的产品。”

朱燕翎在接受采访时说，据我所知，雀巢在欧洲公开表示停止销售含有转基因成分的产品，尤其是在婴儿食品市场；但是在后来我的律师与其沟通过程中，雀巢始终未能就它的“双重标准”作出合理解释。我不明白，为什么一家全球驰名的婴儿食品企业会在世界不同地区采用不同的政策？为什么雀巢不明确标注它的转基因食品，置消费者的知情权于不顾？

在雀巢瑞士总部，朱女士及其律师与雀巢公司的代表进行了一个小时的会面。朱女士提出两项要求：在中国采取与欧洲相同的转基因食品政策，停止使用转基因原料。暂时必须使用转基因原料的，应在转基因产品上清楚标识。

但是，对于中国消费者远赴瑞士雀巢总部提出抗议的行为，雀巢公司当时不愿表态。

据称雀巢公司的答复是，由于欧洲消费者不愿意吃转基因食品，因此他们在欧洲停止使用转基因原料。除了在欧洲以外，雀巢公司在全球都使用转基因原料。雀巢公司认为中国消费者并不排斥基因食品。他们会在全球继续使用转基因原料，并会根据各地的法律要求进行标识。事后雀巢公司还发表一份声明，表明支持转基因技术的立场。

朱女士说，我对雀巢的傲慢态度感到吃惊，一般的公司都十分重视顾客的感受及意见，但雀巢却对中国消费者的行动视若无睹。我会继续坚持对雀巢的，因为它一步不让，漠视一年来在中国发生的诸多事实和中国消费者的声音。我要呼吁更多的人支持消费者的维权行动，因为雀巢的态度表明，中国消费者需要更大的声音和更强烈的行动才能引起这家全球最大的食品商重视。

据吴律师介绍，3天里他们先是召集当地媒体开了一个新闻会，又接受了许多媒体的采访，取得了当地媒体和老百姓的支持。瑞士当地最大的法语、德语报纸都对此事进行追踪，当地电视台对此进行了专访，还把朱女士的照片刊登在当地报纸的醒目位置上。瑞士商报也专门在上海采访了朱女士，世界经理人杂志更是将雀巢事件评为中国2003年十大商业丑闻第二位（周正毅案例第三）。他们看到中国消费者越来越懂得用法律，而不是仅靠政府来保障自己的合法权益，他们感到中国的消费者维权意识以及法律法规的完善程度都比他们想像中要好出许多。吴律师认为，虽然雀巢公司没有给予任何答复，但是自己能在国际上表达中国消费者的意愿，让世界了解中国消费者的意愿，让世界了解中国消费者，这个意义更大。

：标的仅13.6元

检测：一波三折无结果

标准：各执一词难统一

2003年4月，朱女士以雀巢公司违反了《消费者权益保护法》和《产品质量法》，向法院正式，提出了“退一赔一”、要求雀巢公司在其产品上标注含转基因成分和承担诉讼费的诉讼请求。诉讼标的仅13.6元。

朱女士在中称，被告明知“雀巢巧伴伴”含有转基因成分，应该作出明确的警示，但是被告不仅未在产品外包装上加以标注和说明，而且在中国媒体所做的任何广告也未表明该产品含有转基因成分，导致原告因轻信而权益受损。根据《消法》、《产品质量法》的相关规定，要求退一赔一。

朱女士还认为，《消法》第9条规定：“消费者在自主选择商品或者接受服务时，有权进行比较、鉴别和挑选。”被告生产和销售的“雀巢巧伴伴”内含有转基因成分却不告知消费者，侵犯了消费者的知情权，同时致使消费者无法与其他不含转基因的产品进行比较、鉴别，也由此侵犯了消费者的选择权，故原告要求被告停止侵害，在“雀巢巧伴伴”上标明含有转基因，以维护消费者的合法权益。

朱女士表示，她个人非常赞成转基因技术尝试，但是把这种技术用在食品上还是应该谨慎，特别是婴幼儿食品。应该让消费者知晓从而自主选择是否接受这类食品。

审理中，上海第二中级人民法院委托上海市农业学院生物技术研究中心，对原告提交的一袋生产日期为2003年2月15日的“雀巢巧伴伴”样品进行检测，结果含有转基因大豆成分，据原告律师介绍，选择上海这家检测机构，经过了法院和原告、被告三方的同意。然而被告雀巢公司方面一直认为自己的产品不含有转基因成分，检测结果出来后，他们向法院提出按照国家标准进行复检的要求。复检报告显示：送检的两例产品未检出转基因成分。去年10月，雀巢公司又将“雀巢巧伴伴”样品送到中国农业大学食品安全技术中心，在严格按照国家有关规定进行检测后，也没有检测出转基因成分。据称，该中心是获得双认证的转基因检测机构，也是农业部筹建中的12家转基因检测机构之一。而上海这家中心也是按照国家标准进行检测的，并没有自行设计引物。

虽然检测的方式不同结果也不一样，但记者在这些检测机构出具的结论中都发现有“仅对来样负责”这样一段文字。意思很清楚：这袋雀巢巧伴伴检测不含转基因成分，并不是说其在中国销售的所有产品都不含转基因成分；同样道理，这袋雀巢巧伴伴检测含转基因成分，并不是说其在中国销售的所有产品都含有转基因成分。

于是，朱女士又将去年8月1日在上海联华超市股份有限公司另外购买的一袋“雀巢巧伴伴”送检，经检测仍含有转基因成分。由此，朱女士第二次将上海雀巢公司和上海联华超市公司告上法庭，去年12月29日上海市虹口区人民法院正式受理此案。

前案尚未结束，后案诉讼又起，雀巢转基因事件由此变得更加扑朔迷离。

与“雀巢巧伴伴”是否含有转基因成分一样，双方对于“雀巢巧伴伴”产品外包装上是否应加以标注也各执一词。雀巢表示会根据各地的法例要求进行标识。同时认为中国的标识法例只要求对某些转基因原料进行标识，而雀巢的加工产品所使用转基因原料，大部分并不需要进行标识。

记者查阅了相关的法规。2001年5月23日，国务院公布了《农业转基因生物安全管理条例》，2002年1月5日，农业部又公布了《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》、《农业转基因生物标识管理办法》三个配套文件。2002年4月8日卫生部公布了《转基因食品卫生管理办法》，对标注都有规定。

卫生部文件第16条规定，食品产品中（包括原料及其加工的食品）含有基因修饰有机体或表达产物的，要标注“转基因××食品”或“以转基因××食品为原料；转基因食品来自潜在致敏食物的，还要标注“本品转××食物基因，对××食物过敏者注意”。农业部《农业转基因生物标识管理办法》规定第六条，标识的标注方法：用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成分的产品加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测不出转基因成分的产品，标注为“本产品为转基因××加工制成，但本产品中已不再含有转基因成分”或者标注为“本产品加工原料中有转基因××，但本产品中已不再含有转基因成分”。同时公布了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，是包括大豆在内的5类17种农业转基因生物。

据有关专家分析认为，雀巢未做转基因标识，一是可能雀巢使用的转基因材料不在我国规定的5类17种农作物及制品范围内；另一种可能就是雀巢隐匿实情。雀巢公司对此的解释是：我国规定转基因食品贴标签针对的是进口农产品，而雀巢食品都是加工好的“终端食品”，并不在此列。

鉴定标准成为焦点，中国消费者需加强维权和自我保护意识，社会对公益诉讼应大力支持

2004年1月18日上海市第二中级法院如期开庭，原告朱女士未出庭，由人吴冬出庭，被告一上海分公司及被告二超市公司也是人出庭，鉴定人出庭陈述鉴定意见。双方意见分歧，一是，是否有转基因成分；二是，未加标识是否构成欺诈；另外，对鉴定使用标准和结论双方各执一词。法庭未作判决，将另择时宣判。

庭审时，上海农科院生物技术中心转基因检测实验室张主任出庭作证表示，根据农业部标准，检测结果为“雀巢巧伴伴”不含转基因，但根据上海农科院自己的巢式PCR方法检验出了转基因成分。最后，依照国家农业部的标准进行复检，其内不含转基因成分。由于鉴定人使用了不同的鉴定方式，因而产生了不同的结论。

朱女士的律师吴冬对鉴定结果表示，目前我国转基因检测没有国家强制性标准的鉴定方式。应该采用更为科学的方式，而且也不应该参考农业部推荐的鉴定标准，因为系争的产品是食品，食品转基因检测可用质检总局的食品转基因检测标准方式，而非农业部推荐的鉴定标准针对的大豆及制品。

雀巢的律师则表示，鉴定结果显示“雀巢巧伴伴”内不含转基因成分，他们也曾经在国际国内多家鉴定机构进行鉴定，结果也都是如此。对消费者未弄清事实情况，滥用诉权，表示遗憾。本公司产品没有转基因成分，无需标识，也不构成欺诈。

在采访中，已经被诉讼搞得十分疲劳的吴律师感慨地说，这讼标的虽然仅为13元6角的案件，牵涉到的方方面面是非常多的，虽然社会的关注已经给了很多支持，他们在取证、检测、索取资料等方面，不少部门出于“道义”，为他们提供了方便，但是他们当事人一方还是投入了很大的精力，整个汇业律师所包括主任杨国胜律师在内，几乎都在为此工作，他们感到本案牵涉到侵害社会消费者知情权和选择权等公众利益问题。然而仅靠个体的力量与强大的跨国公司打官司还是困难重重，力量也不对等，就是打赢了，经济上也不值一提，如果雀巢公司能在食品上标明，受益的是社会公众，所以迫切希望有一个强有力的社会机构来支持。

2月2日，记者电话采访了上海市汇业律师事务所主任杨国胜律师，对于雀巢销售转基因食品，侵犯消费者知情权一案，汇业律师事务所予以高度重视。杨国胜律师、陈庆海律师、吴冬律师等高级合伙人还邀请了多位上海法学界的知名专家专门进行研讨。杨国胜律师认为：本案是我国首例与转基因标注有关的消费者权益纠纷案件，对于消费者权益的保护具有重要意义；目前世界各国科学家对于转基因食品的安全性都没有定论，因此应当由消费者对是否选用转基因食品进行选择。

正在进行公益诉讼方面调研的上海市检察一分院民事行政检察处潘漪处长，对此案也十分关注，她告诉记者，他们不仅关注此案的结果，而且关注诉讼过程中的执法理念，更关注此案引出的法律问题。她认为，为了解决有侵害行为、可能引起危害公众利益结果、但个体力量诉讼有困难的诉讼案件，公益诉讼应提到日程上来。虽然这起案件与那些破坏环境、自然资源等案件相比，并非十分典型的危害公共利益，仅侵害了不特定的消费者的知情权和选择权，但他反映出对消费者的知情权和选择权的保护力度不够。我国现行三大诉讼法的规定，只有刑事诉讼中规定了公益诉讼，即检察机关代表国家向法院提起追究犯罪嫌疑人刑事责任的诉讼。而我国民事诉讼法和行政诉讼法对原告人的要求，均是自己的权益受到不法民事行政行为的侵害，才能诉至法院寻求司法救济。这反映了我国民事行政诉讼制度上的缺陷――对社会公共利益保护不力。她认为作为国家法律监督机关的检察机关，若能承担起民事行政公诉职责，加强国家对社会公共利益的保护，必将推动依法治国的进程。

上海师范大学法政学院孙育玮教授则认为，当前，在我国社会生活中，国有资产流失、垄断、限制竞争行为及不正当竞争行为屡见不鲜；破坏环境、自然资源的行为屡禁不止；侵犯消费者、用户的合法利益的案件时有发生。现有的民事、行政诉讼法中虽然有集团诉讼程序，但并不能解决问题，涉及到有关利害关系人、诉讼代表人主体资格和诉权等问题无法解决，即使案件有直接利害关系人，但在诉讼过程中要求其对诉求全面取证、举证等也是非常困难的，比如此案在检测、鉴定所发生的麻烦，因此完善公益诉讼制度很有必要。

非转基因检测报告范文第3篇

关键词： 工程质量检测；现状；行业自律；政府监管

0 前言

检测市场也从当初由各地政府质量监督机构下设的检测部门区域性垄断，转变成只需具备相应检测资质就可以跨区域参与竞争的开放型市场。在这个计划经济向市场经济转轨过程中，由于建筑市场和检测市场出现了僧多粥少、市场竞争过度，施工企业(工程承包商)和检测机构为获取工程业务采取了许多不正当的竞争手段。工程承包商在采取压价、垫资、带资等手段获取施工项目之后，为了追求最大的经济效益，就会在节约成本(建材的采购、检测费用等)方面做文章。检测机构为了获取检测任务，也采取压价甚至违规操作等方式迎合施工单位的一些不正当要求。在检测市场放开的过程中，由于公开、公平、公正的市场竞争机制还未完善，确保检测管理工作的法律、法规还未健全，造成目前检测市场无序竞争的状况，严重损害了检测工作的公正性、科学性和权威性。

1 目前工程质量检测中存在的一些问题

1．1 检测机构弄虚作假，出具虚假报告

有些检测机构为了占有检测份额，在通过低价竞争获取检测业务后，采用偷工减料、减少检测内容、缩短检测时间、降低检测标准等手段来提效增利，甚至不做检测，只卖假报告。也有些检测机构为了经济和其他利益屈从于委托方的不正当要求，随意编造数据，出具虚假报告，由其提供的检测报告，从未有不合格情况出现，这与目前建材市场的质量状况及工程施工实际管理水平是不相符的。

1．2 检测机构内部管理混乱，检测行为不规范

检测机构规范、严谨的自身管理和检测人员资格是检测工作质量的基本保证，但是，还有部分检测单位在经济利益的驱动下，违法违规操作。如有的检测单位检测数据随意涂改，报告与原始数据不符，检测资料不全，归档混乱；有的检测单位还存在无证人员上岗检测，冒充有证人员在检测报告上签字的现象；有些检测机构的设备仪器计量校正有漏检、超期、自校无制度、记录等问题；甚至有些检测机构默许那些社会人员承接到检测业务后给予挂靠，并为其出具报告，从中谋利。

1．3 施工单位(工程承包商)行为不规范

有些施工单位在采用低价竞标方式获取工程项目之后，为了降低工程“成本”，就采购那些便宜的伪劣产品，在送样检测时却用优质品代替，这样的检测也就失去了根本意义。也有的施工单位为了节省一些检测费，未按有关规范标准取样送检，出现漏检、少检的情况。有些施工单位甚至要求检测机构为其出具的报告必须是“合格”的，否则就中断检测业务，出现了一旦在原有的检测单位有不合格报告之后，施工单位就换检测机构的怪现象。

2 造成工程质量检测中存在这些问题的主要原因

2．1 检测市场机构过度饱和

近年来随着检测市场的放开，检测机构纷纷成立，造成检测市场机构正日趋饱和。以上海为例，目前从事工程材料检测的机构有7O家，桩基检测的有42家，混凝土非破损检测的有23家，建筑物沉降检测的有26家，钢机构检测的有19家，室内环境质量检测的有43家，检测市场可以说是僧多粥少。在这个过度饱和的市场中，有些检测机构在经济利益的驱动下，为了生存竞争，在采用一些不正当手段承揽到检测业务后，降低检测质量标准进行违规检测，甚至不检测，出假报告，严重扰乱了检测市场。

2．2 现有的检测委托机制不利于保证检测工作的质量

现有的检测委托机制是施工单位可以自主选择检测机构，所有的检测业务由施工单位委托检测并支付检测费用。作为施工单位(工程承包商)出于自身利益角度出发，他不会过多考虑对方的检测质量，而是会计较检测费用的多少，甚至为了避免检测不合格而造成麻烦以及复检的费用，要求检测机构为其提供的检测报告必须是“合格”的。供需双方利益权衡的结果，使得检测机构必须在公正和生存之间作出抉择，检测工作的质量无法保证。

2．3 检测结果难以复查、追溯和客观的评价

对于材料检测来说，基本上是采用破坏性试验，被检样品无法恢复原状进行复测。对于工程检测，如桩基检测，检测对象检后基本上很快被上部结构永久性覆盖，也不存在被复测的可能。那些经工程现场实物抽检发现有不合格而检测报告却是合格的，也不能由此判定检测工作质量是否有问题。拿混凝土(砂浆)来说，影响试块报告强度的因素除了检测的准确性外，还有其自身质量、现场取样、试块制作及养护等环节。拿钢筋来说，检测机构也可以质疑见证取样这个环节是不是存在漏洞。由此可见，即使是由于检测工作质量出偏差，引起检测报告的不准确性，却也没办法追究检测机构的责任。这样很难打击某些检测机构为了某种目的而出具虚假报告的行为，在一定程度上可视为纵容了那些检测机构的违法行为。

2．4 存在对跨区域承揽业务的检测机构如何监管的问题

相关法律、法规中规定，当地政府建设主管部门负责对本行政区域内的质量检测活动的监督管理，但在实际操作中会遇到一些具体的问题。例如，现在检测机构跨区域承揽检测业务很普遍，那么就会出现作为当地行业监督机构对这些非注册在本行政区域却在本区域承接业务的检测机构的工作质量如何进行监管的问题。因为在日常监管过程中，仅检查其为工程提供的检测报告是根本不够的，还得通过检查检测机构内部的原始检测数据、人员资格、设备状况、环境条件、管理体系等情况的综合，才能恰当地判定它的检测工作质量。但是，在现有的法律、法规中没明确地方行业监督机构是否可以跨行政区域检查检测机构内部工作质量的权力，从而造成地方政府对这些内容的监管缺乏措施和力度。

3 解决目前工程检测中存在的问题的应对措施

3．1 充分发挥行业自律作用

为创造一个公平竞争的检测市场，确保工程检测质量，除了要完善行政执法监管体系外，行业自律也是一个非常关键的要素。作为鉴证类行业的建设工程检测行业协会，除履行服务、协调等职能外，更重要的是充实行业管理的职能，制订行规行约，加强自律管理，以维护行业的整体形象，协助政府保持行业的健康有序。建设工程咨询行业协会应该要求监理单位切实提高监理人员责任心，使其切实履行好见证取样方面的职责，把好建筑材料的进场验收关及使用前的检测关。

3．2 改变现有检测委托机制

工程质量的检测业务应由工程项目建设单位委托具有相应资格的检测机构进行检测，建设单位与检测单位签订书面合同之后报当地政府监督机构备案。解决由于施工单位可以自主选择检测机构，而检测机构为了生存或者为了盈利，而不得不屈从于施工单位的一些不正当要求的问题。

3．3 加大对检测机构工作质量的监管力度

政府行业主管部门通过对检测机构的资质管理、技术比对、专项检查、业绩考核等方式进行监管，使大部分检测单位能遵守国家有关建设工程检测的法律、法规，按规范和标准的要求开展检测业务。但是，由于检测机构跨区域承揽检测业务的现象很普遍，政府监督机构是否可以或者如何跨行政区域对检测机构的检测工作质量进行监管就成了一个很现实的问题，由此造成政府监督部门对检测机构的日常监督、动态抽查方面不是很有力。同时，又由于对检测结果存在难以复查、追溯和客观评价的问题，造成部分检测机构心存侥幸，放松管理要求，降低了检测工作质量。为解决以上问题，本人认为，作为政府监督机构可以采取以下办法作为应对措施：一是采用备案制，当检测单位承揽到某工程的检测业务后，需到该工程受监的政府监督部门进行备案，接受监督部门对其针对该工程检测质量的监管。监督部门可以通过暗中送样、飞行检查等形式考核其检测工作质量，一旦发现检测机构在该工程项目的检测工作中存在违规行为，就可以对其查处，情节严重者可报有关主管部门建议注销检测资格。二是在工地上设置留样室，要求施工单位需将送检的试样在工地留样室备份。监督部门在对工程日常监督到位过程中，可以从中抽取留存的试样进行比对试验，以此考核相关检测机构的工作质量。

3．4 加强对工地现场的监管

政府监督部门在对工地进行日常监督抽查时，应加强对工地原材料与内业资料的核对工作，检查有无漏检、少检的情况，防止未经检测合格的材料用到工程上。同时，应对工地所用原材料(特别是那些外观质量有明显问题的)作必要的抽检，防止个别施工单位为了降低工程“成本”，将那些价格便宜的伪劣产品使用到工程上去，给工程结构质量安全埋下隐患。一旦发现有类似违规行为的，就要对相关责任单位进行严肃查处，提高其违法成本。对于那些没有切实履行见证取

样职责的相关责任人也要追究其违规行为，直至吊销其个人执业资格。

3.5 加大对监理见证人员的监管力度

监理见证人员是见证取样检测中样品真实性的见证保证，在实际过程中，由于见证人员的素质（见证人员好多都是招聘，简单培训就上岗，对监理单位的依附不强）和被施工单位收买等原因，见证人员对自己的工作落实不到位。材料取样由施工单位自行取样制作，见证人员基本不参与，而有些检测机构为迎合施工单位的需要，直接去工地接收样品，这种做法是明显不合规范的，见证员是有理由拒绝签字或送样，但都没做到。所以本人以为政府也应加强对监理单位和其人员的管理。对人员加强素质教育和加大处罚力度，一经发现见证人员失职，要吊销其证书和不良记录不准几年内再考证。

4 结语

检测工作是保证工程质量安全的基础，检测数据是评判工程内在质量好坏的依据，一旦在这个环节上出现了偏差，其危害是无法估量的。对目前检测市场不很规范，检测工作还存有弄虚作假，试样做假、漏检、少检的行为时有发生的情况下，如何加强工程质量检测管理已经成为政府监督部门当务之急的一项重要工

作。我们应该通过多种方式、多种渠道加强这方面的监管工作，确保检测工作的公正性、科学性和权威性，使检测数据能真正反映现场实物的实际状况，发挥其

非转基因检测报告范文第4篇

【摘要】

目的：对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法：应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段，并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3Basic（pGLB）中， 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRLTK共转染EC109细胞，48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度，并结合生物信息学分析，以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果：用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明，与对照组相比，上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现，在启动子区(-436～+1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论：在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.

【关键词】 fascin基因； 食管肿瘤； 启动子； 荧光素酶类； 报告基因

【Abstract】 AIM: To clone and identify the promoter region of fascin gene in esophageal carcinoma cells. METHODS: Five different length fragments of 5′ flanking region of fascin gene were amplified from the genomic DNA of EC109 (an esophageal cancer cell line) by using PCR and cloned into luciferase reporter gene vector pGL3Basic （pGLB）， which aids in verification of functional promoter elements. Then the relative luciferase activities of the report genes in the EC109 cells transfected with these recombinant plasmids were analyzed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay System (DLR). Bioinformatic analysis was also performed to determine the position of fascin gene promoter. RESULTS: Five serial deletion recombinant luciferase report gene expression vectors pBF-2900- -436 were successfully constructed by using DNA recombination technique. 48 h after cotransfection of these recombinant plasmids with control pGLB， pRLTK vector into EC109 cells， the relative luciferase activities of the cells transfected with these recombinant plasmids were all higher， as compared with controls. Bioinformatic analysis unveiled a TATA box (-34- -29)， which was the marked regulatory element， in this promoter region (-436- +1). CONCLUSION: The promoter region of fascin gene is likely located in the region of 436 bp upstream of the transcriptional initiation site in esophageal carcinoma cells.

【Keywords】 fascin; esophageal neoplasms; promoter; Luciferase; Reporter Gene Assay

0 引言

研究表明，癌细胞侵袭转移的恶性行为是由于肌动蛋白结合蛋白等因素引起的细胞骨架异常重组所致［1］. 成束蛋白（fascin）是肌动蛋白结合蛋白中与癌细胞运动时丝状伪足、微棘异常形成有关的主要分子，在食管癌及许多上皮来源的肿瘤细胞系中高表达，与癌侵袭转移密切相关，被认为是癌早期转移诊断的重要生物标志［2-3］. 但目前该基因在肿瘤细胞中上调表达的分子机制尚不清楚. 我们拟从fascin基因上游调控区入手，采用系列缺失结合双荧光素酶报告基因检测分析法，初步鉴定其启动子区的所在位置，为鉴定食管癌细胞中与其启动子结合的转录因子、阐明其表达调控机制奠定基础，也为以其转录因子为靶分子进行肿瘤生物治疗提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料

E.coli JM109菌株，萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3Basic（pGLB），内参照荧光素酶报告基因表达载体pRLTK，PCR mix，LigaFast Rapid DNA Ligation System， 双荧光素酶报告基因分析系统(DualLuciferase Reporter Assay System)及限制性内切酶（KpnI， Mlu I， Hind III）(美国Promega公司)；质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit（美国QIAGEN 公司）；转染试剂Fugene6（Roche公司）； pMD18T Vector及LA PCR kit（日本TaKaRa公司）；食管癌细胞系EC109 由中国医学科学院肿瘤研究所林晨研究员惠赠；萤光发光计TD20/20 luminometer（Turner Designs）.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将食管癌细胞系EC109培养于含100 mL/L小牛血清，1×105 U/L青霉素，100 mg/L链霉素的199培养基中，50 mL/L CO2，37℃. 用含2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA的消化液消化传代.

1.2.2 PCR引物设计与合成

根据GenBank中报道的fascin基因上游调控区序列（Accession No. AY044229），运用Primer Premier 5软件，设计5对针对其上游调控区的系列缺失引物，由上海基康公司合成. 其中，5对引物中的下游引物相同（FasnR），上游分别针对不同的缺失部位，各引物的序列及目的片段的大小见表1.表1从食管癌细胞系EC109扩增 fascin基因5′侧翼区的引物（略）

1.2.3 PCR扩增

以食管癌细胞EC109基因组DNA为模板，以F2900和FasnR为引物，应用PCR mix 扩增fascin基因5′侧翼区约3000 bp片段，产物命名为3022. PCR条件为：94℃， 5 min预变性； 然后按照98℃ 20 s，63℃ 5 min， 共30个循环； 最后72℃延伸10 min. 再以pTF2900为模板，分别以F1848，F1435，F825，F436和FasnR为上、下游引物，应用PCR mix及与上述相同的反应条件扩增系列相差约500 bp的片段，产物命名为1970，1547，947，558. 各PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相.

1.2.4 PCR产物的克隆及重组

质粒pTF-2900～-436的构建以食管癌细胞EC109基因组DNA为模板扩增的PCR产物直接克隆到pMD18T或pGEMT easy vector载体中，按试剂盒操作说明书进行. 用与扩增片段时的引物及相同的反应条件进行PCR来鉴定重组子，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，最后测序确认，5个质粒分别命名为pTF2900， pTF1848， pTF1435， pTF825， pTF436.

1.2.5 系列缺失表达载体的构建与鉴定

以Kpn I/Hind III双酶切pGLB， pTF2900，以Mlu I/Hind III分别双酶切pGLB和pTF1848， pTF1435， pTF825， pTF436. 分别回收线性化的pGLB及不同大小的目的片段，用T4 DNA连接酶分别在4℃过夜连接，转化JM109感受态细胞，试剂盒提取质粒，Kpn I/Hind III或Mlu I/Hind III双酶切鉴定重组子，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. 各重组子分别命名为pBF2900， pBF1848， pBF1435， pBF825， pBF436.

1.2.6 转染和双荧光素酶活性检测

用QIAprep Spin Miniprep质粒提取试剂盒分别提取pBF2900， pBF1848， pBF1435， pBF825， pBF436， 空载体质粒pGLB以及内参照质粒pRLTK，紫外分光光度法分别测定质粒浓度. 用Buffer EB将上述各质粒稀释至100 mg/L，内参照质粒pRLTK稀释至20 mg/L.将各种质粒分别与pRLTK 质粒按10∶1（V/V）混合. 将处于对数生长期的EC109细胞在转染前24 h接种于24 孔培养板中，待细胞密度达到60%～80 %融合时进行转染［4］. 48 h后收获细胞，进行双荧光素酶活性检测. 每种质粒设3个平行孔，不同批次的质粒转染实验重复3次，并分别记录相应的荧光素酶活性.

1.2.7 生物信息学分析

应用转录因子数据库（generegulation.com）中的软件AliBaba 2.1分析预测fascin基因5′侧翼-436~+1区段潜在的转录因子结合位点. 相关参数分别为：Pairsim to known sites为64，Match width in bp设为10，Min num of sites为5，Min match conservation设为80％.

统计学处理: 根据TD20/20型照度计配置的软件包计算各组相对光强度x±s. 以SSPS 11.0 for Windows软件包对各组实验数据之间是否有显著性差别进行F检验.

2 结果

2.1 fascin基因5′侧翼区的克隆与pBF2900表达载体的构建

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物3022，所扩增的片段大小与预期长度一致（图1A）. 将PCR产物克隆至中间载体pMD18T vector中，用PCR方法鉴定所构建重组子pTF2900，对pTF2900进行双向测序及BLAST分析，所扩增的约3000 bp DNA片段为人fascin基因5′侧翼区，与GenBank数据库中的fascin基因上游序列的一致性为99.9%. 双酶切法鉴定重组表达载体pBF2900，切出的目的片段大小与原PCR片段大小相同（图1B）.

2.2 fascin基因5′侧翼区的分段克隆及系列缺失表达

载体的构建PCR产物1970，1547，947，558的琼脂糖凝胶电泳结果见图2A. PCR产物克隆至中间载体pGEMTeasy vector中所构建的重组子pTF1848～pTF436用PCR方法鉴定后再分别进行测序确认. 双酶切方法鉴定所构建重组表达载体pBF1848，pBF1435，pBF825和pBF436，切出的目的片段大小与原PCR片段大小相同（图2B）.

2.3 细胞转染及相对荧光强度

将5个重组实验质粒分别与对照质粒pGLB、内参照质粒pRLTK共转染食管癌细胞EC109，利用双荧光素酶报告基因检测系统检测相对荧光强度（图3）.与pGLB空载体相比，从pBF2900到pBF436，各重组质粒的相对荧光强度均较高（P

2.4 生物信息学分析

在转录起始位点上游存在许多潜在的转录因子结合位点（图4），例如Sp1，C/EBPα，CREB等，在-34～-29位置也发现了启动子标志序列TATA盒(TATAAAA). 表明食管癌细胞中fascin基因的启动子位于其5′侧翼区-436区段.

转贴于

3 讨论

Fascin又名成束蛋白［1］. 人类fascin基因是20世纪90年代从人类畸胎瘤中克隆，定位于染色体7p22［5］，编码的蛋白产物约55 ku. 正常情况下，fascin在脑、卵巢及睾丸中高表达，在T淋巴细胞和部分上皮细胞系中低表达或不表达，在神经细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、成熟树突状细胞中高表达. 近来研究发现，fascin在多种上皮来源的肿瘤细胞系中上调表达，例如在乳腺癌细胞系MDAMB435中， fascin表达增加（mRNA及蛋白水平）［6］，在非小细胞肺癌中表达上调，并与肿瘤分期及增殖分数相关［7］，在胃癌中，fascin基因在正常胃黏膜上皮中不表达，而在肿瘤中表达上调，且与肿瘤浸润程度呈正相关［8］. 我们在研究食管癌细胞中发现，fascin基因高表达不仅与肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学行为密切，还与肿瘤细胞的分裂增殖相关，通过RNAi技术抑制fascin基因表达后，食管癌细胞的侵袭转移行为明显减弱［9］.提示fascin的表达具有明显的细胞/组织和时空特异性.

有研究发现当神经元前体细胞NT2中的一种转录激活因子cAMP反应元件结合蛋白被用RNAi技术沉默后，fascin基因的表达明显下降［10］；最近在黑腹果蝇的γ神经元也确认CREB结合蛋白是调控fascin基因表达的关键因子，而且fascin基因表达直接影响神经元的分化［11］. Bros等［12］报道在树突状细胞（DC）成熟过程中，fascin基因的表达明显增强，并且发现位于TATA box附近的CREB/AP1混合元件区是调控fascin基因在DC中表达的关键元件. 在乳腺癌肿瘤细胞中，cerbB2的过表达会导致fascin基因表达的上调，但尚未鉴定出调控这一途径的转录因子［6］. 这些研究结果提示在上皮类细胞中fascin基因的表达调控机制可能与非上皮类细胞如神经细胞和DC细胞不同. 我们在以往工作的基础上，首先从EC109食管癌细胞基因组DNA中扩增出了fascin基因5′侧翼转录调控区不同长度DNA片段，并分别插入pGL3Basic载体中，成功构建了一系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pBF-2900～-436. 然后通过转染食管癌细胞后检测报告基因活性发现fascin基因5′侧翼转录调控区存在较强的启动子活性，初步鉴定出fascin基因启动子区应位于转录起始位点上游-436 bp内，但若进一步确定其核心启动子区及主要的转录调控元件，尚需嵌套缺失和定点突变等技术来实现. 我们的实验结果为深入研究fascin基因在上皮起源的肿瘤中过表达的分子机制奠定了基础.致谢感谢汕头大学医学院肿瘤病理学研究室蔡唯佳老师在细胞培养中给予的帮助和支持.

参考文献

［1］Adams JC. Roles of fascin in cell adhesion and motility ［J］. Current Opinion Cell Biol， 2004， 16(5): 590-596.

［2］荣举， 许丽艳， 蔡唯佳， 等. Fascin1基因在永生化食管上皮细胞癌变中的表达［J］. 癌症， 2004， 23(3): 243-248.

［3］Zhang H， Xu L， Xiao D， et al. Fascin is a potential biomarker for earlystage esophageal squamous cell carcinoma［J］. J Clin Pathol， 2006， 59(9): 958-964.

［4］许丽艳， 李恩民， 蔡唯佳， 等. NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定［J］. 肿瘤防治杂志， 2004， 11(5): 449-453.

［5］Duh FM， Latif F， Weng Y， et al. cDNA cloning and expression of the human homolog of sea urchin fascin and Drosophila singed genes which encodes an actinbundling protein ［J］. DNA Cell Biol， 1994， 13(8): 821-827.

［6］Grothey A， Hashizume R， Ji H， et al. CerbB2/HER2 upregulates fascin， an actinbundling protein associated with cell motility， in human breast cancer cell lines ［J］. Oncogene， 2000， 19(42): 4864-4875.

［7］Pelosi G， Pastorino U， Pasini F， et al. Independent prognostic value of fascin immunoreactivity in stage I nonsmall cell lung cancer［J］. Br J Cancer， 2003， 88(4): 537-547.

［8］Hashimoto Y， Shimada Y， Kawamura J， et al. The prognostic relevance of fascin expression in human gastric carcinoma ［J］. Oncology， 2004， 67(34): 262-270.

［9］Xie JJ， Xu LY， Zhang HH， et al. Role of fascin in the proliferation and invasiveness of esophageal carcinoma cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 337(1): 355-362.

［10］Megiorni F， Indovina P， Mora B， et al. Minor expression of fascin1 gene (FSCN1) in NTera2 cells depleted of CREBbinding protein［J］. Neurosci Lett， 2005， 381(12): 169-174.

［11］Kraft R， Escobar MM， Narro ML， et al. Phenotypes of Drosophila brain neurons in primary culture reveal a role for fascin in neurite shape and trajectory［J］. J Neurosci， 2006， 26(34): 8734-8747.

非转基因检测报告范文第5篇

【关键词】 蛋白

Role of HCV core protein in yeast twohybrid system in reporter gene expression and activation

【Abstract】 AIM: To construct the bait vector of HCV core protein in yeast twohybrid system and then to study its effect on the growth of yeast cells and the activation of reporter genes. METHODS: cDNA fragments encoding HCV core region were amplified by PCR and subsequently cloned into pUC19. After verified by sequencing， they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system. These recombinant plasmids were transferred into AH109 and they activated the reporter genes. RESULTS: The fragments of HCV core protein were successfully obtained， which were not toxic to AH109 but could not activate the reporter genes. CONCLUSION: Yeast twohybrid GAL4 system 3 can be utilized to fish HCV core regioninteracting protein. HCV core protein does not have selfactivating function.

【Keywords】 hepatitis C virus core protein; yeast twohybrid system; reporter gene

【摘要】 目的： 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法： PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果： 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段，HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用. 结论： 利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白，证实了HCV核心蛋白无自激活功能.

【关键词】 HCV核心蛋白；酵母双杂交；报告基因

0引言

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus， HCV)核心蛋白位于病毒多肽的氨基末端，被宿主的信号肽酶切割后产生. HCV核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用［1］，其氨基酸序列高度保守，临床和实验研究显示HCV 核心蛋白具有广泛的反式激活作用［2-3］，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因. 酵母双杂交系统是一种分析真核细胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的基因分析方法. 蛋白质与蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础［4］. 酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点. 我们利用它来克隆与HCV核心蛋白相互作用蛋白的基因，以期为HCV 核心蛋白功能的研究提供新依据.

1材料和方法

1.1材料

克隆有HCV全长cDNA的质粒pCDNA3.0HCV由第四军医大学微生物学教研室尹文博士惠赠；表达载体pGBKT7，AH109酵母菌种（美国Clontech公司）；质粒pUC19菌种（本研究室保存）；PCR试剂盒、DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶（Gibco公司）；DNA电泳胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；酵母培养试剂（美国Clontech公司）.

1.2方法

1.2.1PCR扩增克隆编码核心蛋白的引物为①引物P1:5′GCCGAATTCATGAGCA CGAATCCTAAACCT3′；②引物P2: 5′GCGTCGACTTAGGCTGAAGCGGGCACAGT3′. PCR反应条件为：94℃ 30 s， 55℃ 60 s， 72℃ 60 s， 30个循环.

1.2.2PCR产物克隆及鉴定纯化的PCR产物用EcoRI和SalI双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选. 酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆命名为pUC19核心蛋白，进行序列分析.

1.2.3构建及鉴定诱饵载体用EcoRI， SalI酶切pUC19核心蛋白和表达载体pGBKT7， 回收核心蛋白及pGBKT7载体片段，载体片段与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α. 经限制性内切酶分析，含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7核心蛋白.

1.2.4转化酵母感受态细胞在1.5 mL微量离心管中，加入已构建好的诱饵载体0.1 μg，鲱鱼精DNA 0.1 mg和0.1 mL酵母感受态细胞. 混匀后加入0.6 mL PEG/LiAc溶液. 在30℃以200 r/min振荡培养30 min， 加入70 mL DMSO后混匀， 在42℃水浴15 min， 冰浴2 min， 5000 r/min离心5 s，去上清，以0.5 mL 1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp平板. 于30℃培养36 h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.

1.2.5蛋白表达的检测

1.2.5.1酵母全菌蛋白的抽提挑取几个已转化的酵母菌在5 mL SD/Trp培养液振荡培养过夜， 次日转接于50 mL SD/Trp培养液， 在30℃以230 r/min振荡培养至A600 nm=0.4～0.6. 在4℃，1000 r/min离心收菌. 将菌体置于液氮中冻存. 以60℃的裂解缓冲液200 μL融解菌体， 混匀后加入0.2 g玻璃珠， 70℃孵育10 min， 剧烈混旋1 min， 在4℃，5000 r/min离心5 min. 上清转移至新的Eppendorf管备用. 沉淀在100℃水浴5 min，再剧烈混旋1 min，在4℃，5000 r/min离心5 min后，上清转移至上述的Eppendorf管内， 100 g/L SDSPAGE电泳分析.

1.2.5.2Western Blot实验酵母全菌蛋白经100 g/L SDSPAGE电泳， 以100 V， 45 min将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜，放入0.5 g/L Tween20的PBST中，洗膜5 min，封入含有封闭液（5 g/L脱脂奶粉）的塑料袋中，37℃缓慢摇动1 h. PBST洗膜15 min×4. 稀释一抗（HCV核心蛋白mAb 1∶500）于PBST中. 将膜封入含适当稀释一抗的塑料袋中，4℃过夜. 次晨PBST洗膜15 min×3. 稀释二抗（羊抗鼠IgG）液于PBST中（1∶3000），将膜封入含适当稀释二抗的塑料袋中，37℃ 1 h. PBST洗膜15 min×3. 在暗室中用滤纸将膜上液体吸干，在ECL反应混合液中反应2 min后，压X光片2～20 min，显影、定影. X光片观察、照相.

1.2.6报告基因表达的检测

1.2.6.1HIS3报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有Trp， Ura， His， Leu营养缺陷的SD平板上，于30℃培养36 h，观察酵母菌的生长情况.

1.2.6.2lacZ报告基因表达的检测①采用β半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达. 用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上. 将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5 s后，置于室温裂菌. 将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有Z buffer/Xgal的Whatman#1滤纸上，赶尽气泡，于30℃孵育30 min～8 h，观察颜色变化. ②采用诱饵载体转化酵母菌AH109后铺SD/Trp/Xagal平板检测lacZ报告基因的表达. 将诱饵载体转化酵母菌AH109后铺SD/Trp/Xagal平板，于30℃培养36 h，观察平板上菌落颜色的变化.

2结果

2.1核心蛋白基因片段编码区的扩增扩增出与预期大小一致的cDNA片段（图1）. 核心蛋白大小为588 bp.

2.2重组pUC19核心蛋白质粒的酶切鉴定及序列分析鉴定正确的pUC19核心蛋白重组质粒分别作正反向测序，序列分析表明所扩增的核心蛋白基因序列与登录的HCV核心蛋白基因序列完全一致（图2）.

2.3重组pGBKT7核心蛋白质粒的酶切分析见图3.

2.4Western Blot检测蛋白的表达在Mr为19×103可见明显目的条带且无杂带（图4）.

2.5HIS3报告基因表达的检测可见单纯AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生长，而含有pGBKT7核心蛋白质粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生长，但所有克隆在SD/His和SD/Leu平板上均不生长.

2.6LacZ报告基因表达的检测含有HCV核心蛋白的酵母细胞显色中可见LacZ报告基因没有被HCV 核心蛋白激活(图5). 当LacZ报告基因被激活时β半乳糖苷酶大量表达，活性增高，在Xagal存在时，菌落显深蓝色，且扩散面积较大.

3讨论

酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法［5］. 我们在酵母双杂交Gal4系统3基础上成功构建了融合有HCV核心蛋白的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白，再将含HCV核心蛋白的重组质粒转化入Ura缺陷生长的AH109酵母菌中. 通过Trp，Leu及His缺陷的营养筛选表明，带Trp营养筛选标记的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白已成功转化入带有Ura 营养筛选标记的AH109酵母菌中. 带有重组表达质粒的AH109酵母菌在His营养缺陷的SD培养基上不能生长，说明构建的HCV核心蛋白对HIS3基因无激活作用. 同时β半乳糖苷酶印膜法及平板法检测结果也表明构建的HCV核心蛋白对LacZ基因无激活作用. 说明HBV核心蛋白对AH109无毒性，且对报告基因无自激活作用. 这与体外构建质粒共转染实验已经证明的结果相似. 这样，我们就能利用核心蛋白为诱饵，从人cDNA文库中去钓取与其相互作用的蛋白.

HCV 核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有多种调控细胞、病毒基因表达及细胞生长以及免疫调节等功能. 临床和实验研究显示HCV感染与HCC发生发展过程密切相关，其中病毒核心蛋白起到重要的作用［6］. 早期研究认为，HCV属于非整合性RNA病毒，与产生两种确定作用的反式激活子（X和截短的preS/S）的HBV不同，并不存在直接致癌的病毒蛋白. 后来研究证实核心蛋白也是一种反式激活蛋白，其作用甚至超过X蛋白［7］. 核心蛋白对细胞信号转导途径，尤其是NFκB，AP1和SRE相关途径具有明显的增强作用［8］；在HeLa和HepG2细胞系中HCV核心蛋白与TNFR1胞质区相互结合，影响TNFR1的信号传递，增加了TNF诱导的细胞凋亡，与细胞增殖、分化及慢性炎症形成等有关［9］. 在HepG2细胞中，核心蛋白激活人类cmyc基因、RSV LTR和SV40早期启动子［10］；HCV核心蛋白与p53协同破坏宿主细胞的完整性，干扰抗原递呈和免疫反应， 逃避各种非抗原特有效应因子清除HCV感染肝细胞，使病毒得以复制［11］.

目前的研究表明，病毒编码的蛋白对宿主细胞生长的调节作用可能是HCV致癌的主要因素. HCV核心蛋白是一种重要的转录激活因子，能够反式激活同源/异源的病毒/细胞转录调节序列，对HCV的慢性化和促进肝细胞的转化有密切的关系. 我们拟利用核心蛋白作为诱饵，从人肝cDNA文库中去钓取与其相互作用的蛋白，以期对其功能有进一步了解.

【参考文献】

［1］ Otsuka M， Kato N， Taniguchi H， et al. Hepatitis C virus core protein inhibits apoptosis via enhanced BclxL expression［J］. Virology， 2002，296(1):84-93.

［2］ Bergqvist A， Rice CM. Transcriptional activation of the interleukin2 promoter by hepatitis C virus core protein［J］. J Virol， 2001，75(2):772-781.

［3］ Lee S， Park U， Lee YI. Hepatitis C virus core protein transactivates insulinlike growth factor II gene transcription through acting concurrently on Egr1 and Sp1 sites［J］. Virology， 2001，283(2):167-177.

［4］ Gietz RD， Woods RA. Screening for proteinprotein interactions in the yeast twohybrid system［J］. Methods Mol Biol， 2002，185:471-486.

［5］ FromontRacine M， Rain JC， Legrain P. Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive twohybrid screens［J］. Nat Genet， 1997，16(1):277-282.

［6］ Moriya K， Fujie H， Shintani R， et al. The core protein of hepatitis C virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice［J］. Nat Med， 1998， 4(9):1065-1067.

［7］ You LR， Chen CM， Yeh TS，et al. Hepatitis C virus core protein interacts with cellular putative RNA helicase［J］.J Virol， 1999，73(4): 2841-2853.

［8］ Kato N，Yoshida H，OnoNita SK， et al. Activation of intracellular signaling by hepatitis B and C viruses: Cvirus core is the most potent signal inducer［J］. Hepatology， 2000，32(2):405-412.

［9］ Matsumoto M， Hsieh TY， Zhu N， et al. Hepatitis C virus core protein interacts with the cytoplasmic tail of lymphotoxinbeta receptor［J］. J Virol， 1997， 71(2):1301-1309.