动物行为学分析方法

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇动物行为学分析方法范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

动物行为学分析方法范文第1篇

关键词：帕金森病；大鼠；6-羟基多巴胺

帕金森病（PD）是常见的中老年人中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不清楚， 研究认为可能与遗传、环境因素、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结果[1-2]。偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD动物模型之一，其在症状、病理、生化方面的表现与人类PD有不少相似之处，但该模型的损伤程度因6-OHDA的剂量、浓度、注射位点不同而存有争议，特别是对损伤早期大鼠行为学方面的观察比较缺乏。本实验通过观察6-OHDA损伤早期PD大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点，验证损伤早期PD大鼠模型的稳定性及可靠性。

1资料与方法

1.1一般资料 选用健康雄性SD大鼠40只， 体重 250～300 g，由南通大学实验动物中心提供。6-OHDA、抗坏血酸干粉剂、盐酸阿朴吗啡（apomorphine）、抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗体均购于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1实验动物分组 40只SD大鼠随机分为三组：①空白对照组（n=8）；②6-OHDA模型组（n=24）：分为24 h组（n=8）、7 d组（n=8）和28 d组（n=8）3个亚组；③假手术组（n=8）。

1.2.2动物模型 模型组大鼠用复合麻醉剂（含戊巴比妥钠、丙二醇、硫酸镁等，0.25 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回缩反射及角膜反射消失后，将其头部水平位固定在脑立体定位仪上，剪除颅顶鼠毛，碘酒、酒精消毒皮肤，沿中线切开一长约2cm切口，充分暴露前囟，参照Paxinos & Watson（1996）《大鼠脑立体定位图谱》确定左侧前脑内侧束（mfb）三维坐标位置，选取mfb区坐标：前囟后2.8 mm，中线左侧2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根据注射位点确定钻颅部位，手术刀尖小心钻开一直径约2 mm颅骨孔，微量进样器缓慢进针至靶点，留针10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗坏血酸），注射完毕后留针5min，以1mm/min的速度退针。手术完毕，用明胶海绵堵塞颅骨孔，适量青霉素涂敷创口，消毒缝合皮肤，放回笼中饲养。并于24 h、7 d、28 d分别检测大鼠行为学和组织学的改变。假手术组同法予含0.02%抗坏血酸的生理盐水4 μL，空白对照组不作任何处理。

1.2.3行为学检测

1.2.3.1跨步调节试验[3] 将大鼠身体的后半部分拖起 ，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑 ，记录10s内大鼠这一前肢走步次数 ，然后同法检测另一前肢的情况，以损伤对侧前肢行走次数所占比例（损伤对侧前肢行走次数/（损伤对侧前肢行走次数+损伤侧前肢行走次数））为评价指标。

1.2.3.2姿势不对称性试验[4] 握住鼠尾的中后部将其提起，悬空于实验台上方约10 cm处，使大鼠头向下处于垂直状态， 以其偏离垂直轴不超过10°为垂直位（标准位），记录大鼠头或上身左右摆动的情况，以摆动偏离垂直位并再返回到垂直位记数为1次。观察45 s内大鼠头或身体转动的方向和次数，以向损伤对侧摆动的次数所占比例（损伤对侧摆动的次数/（损伤对侧摆动的次数+损伤侧摆动的次数））为评价指标。

1.2.3.3阿扑吗啡诱发旋转试验 模型组分别于术后24 h、7 d、28 d于动物腹腔内注射阿扑吗啡0.5 mg/Kg 诱发大鼠向右侧（健侧）旋转，于阿扑吗啡注射后5 min开始记录，持续记录30 min。以24 h诱发旋转次数210次/30 min为合格模型。

1.2.4组织学检测

1.2.4.1动物灌注、固定、取材、切片 各组大鼠在最后一次行为学检测后，用复合麻醉剂麻醉，剪开大鼠胸腔，经主动脉快速灌注生理盐水（37℃）150～200 mL冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再缓慢灌注300 mL，至头与四肢均已发硬。断头取脑，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸盐缓冲液内，存4℃冰箱至脑块沉入瓶底。取中脑黑质组织块进行冠状连续冰冻切片，片厚20 μm。

1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具体步骤依次为：冰冻切片用0.01 M（pH7.4）磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）复性（2 min），非免疫的正常羊血清，室温下孵育30 min，抗TH抗体（1∶1000，抗体稀释液稀释），37℃孵育4 h， SABC试剂，室温下孵育1 h， DAB显色（阳性产物为棕黄色）。以上各步骤之间均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清与抗TH抗体孵育之间不漂洗。显色后贴片，自然风干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.4.3 TH阳性神经元记数 各组大鼠取包含黑质致密部最明显的中脑切片，在×100倍显微镜下计数两侧黑质有完整细胞体的TH阳性细胞，计算左侧与右侧黑质TH阳性细胞数的百分比（左侧黑质TH阳性细胞数/右侧黑质TH阳性细胞数×100% ）。参照蔡文琴等[5]介绍的神经细胞计数方法进行细胞计数。

1.2.5统计学分析 数据结果均使用 SPSS13.0软件进行统计学分析。数据资料采用均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析进行差异性检验，P

2结果

2.1行为学观察 对照组及假手术组大鼠经阿扑吗啡诱发后无旋转行为，也未出现非药物诱发的行为学改变。模型组大鼠在注射6-OHDA后数小时即出现损毁侧肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧缓慢旋转，不能进行直线或随意爬行。

2.1.1跨步调节试验 对照组及假手术组大鼠两侧前肢10 s内跨步次数基本相同，模型组大鼠在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h跨步调节试验评分出现有意义减少，7 d及28 d评分进一步减少，见表1。

2.1.2姿势不对称试验 在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，姿势不对称试验结果显示模型组大鼠头部和身体出现向右侧转动次数有意义增加，7 d及28 d姿势不对称试验评分进一步增加，对照组及假手术组大鼠头部和身体向两侧转动次数大致相同，见表2。

2.1.3阿扑吗啡诱发旋转试验 在注射6-OHDA后24 h，阿扑吗啡腹腔注射诱发大鼠以右侧后肢为支点，首尾相接向右侧旋转，30 min旋转次数210次/30 min，对照组及假手术组大鼠未诱发出旋转行为，见表3。

2.2组织学检测 抗TH染色结果显示，在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，大鼠左侧黑质TH阳性神经元数目出现有意义减少，高倍镜下见少部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等变性征象，部分神经轴突断裂、错乱；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元几乎消失，残留的TH神经元表现出染色质浓缩坏死现象，神经轴突散在稀疏；模型组大鼠右侧黑质TH阳性神经元数目同时也有部分减少；对照组及假手术组大鼠两侧黑质TH阳性神经元无明显改变，见表4，图1。

3讨论

研究PD需要建立稳定可靠的模型。6-OHDA是一种选择性中枢儿茶酚胺能神经元毒性物质，具有很强的呼吸链抑制作用，偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先报道了应用6-OHDA成功制备大鼠偏侧PD模型，这种模型能够在多巴胺能药物的诱发下产生旋转行为，以便于判断模型成功与否。阿扑吗啡是多巴胺（dopamine，DA）受体激动剂，能够引起该模型向健侧旋转，这是由于损伤侧纹状体多巴胺含量下降，多巴胺D2受体代偿性大量增加，且敏感性增高，出现超敏现象[7]，此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。

PD的神经保护治疗需要早期进行，评估6-OHDA损伤早期大鼠行为学变化，可进一步明确模型是否成功及神经保护性治疗是否有效。阿扑吗啡诱发旋转试验结合非药物诱发的行为学试验，其评估结果更加有效、可靠[8]。在偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后数小时，大鼠出现肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧不自主旋转，不能进行直线或随意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步调节试验和姿势不对称试验出现有意义改变，腹腔注射阿扑吗啡后可诱导大鼠在原地向健侧旋转，以健侧后肢为支点，首尾相接，形成环状，但旋转次数

偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h大鼠出现行为学和组织学方面的变化，为检测模型的稳定性和可靠性，实验设立6-OHDA损伤后7d和28d组。结果显示：大鼠行为学改变较24 h组更加显著，阿扑吗啡诱发旋转次数>210次/30 min，符合成功PD模型标准；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元减少90%。偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后，损伤对侧有部分DA能神经元丢失，可能与药物的渗透作用或经血液循环等有关。

综上所述，通过早期行为学检测，可为神经保护性研究确立合格的PD模型，避免了药物提前干预存在的药物显效与模型失败之间的争议。

参考文献：

[1]Cookson M R. The Biochemistry of Parkinson's Disease [J]. Annu Rev Biochem， 2005， 74： 29-52.

[2]Levy O A， Malagelada C， Greene LA. Cell death pathways in Parkinson's disease： proximal triggers， distal effectors， and final steps [J]. Apoptosis， 2009， 14： 478-500.

[3]Olsson M， Nikkhah G， Bentlage C， et al. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model：differential effects dopamine agonists and nigral transplants assessed by a new stepping test [J]. J Neuroecience， 1995， 15（5-2）： 3863-3875.

[4]Roghani M， Behzadi G， Baluchnejadmojarad T. Efficacy of elevated body swing testing the early model of Parkinson disease in rat [J]. Physiology & Behavior， 2002， 76（4-5）： 507-510.

[5]蔡文琴，王泊沄.实用免疫细胞化学及核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版社，1994：180-191.

[6]Ugerstedl U， Arbuthnott G. Quantitative reording of rotational behavior in rats after 6-hydroxydopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system [J]. Brain Res， 1970， 24： 485.

动物行为学分析方法范文第2篇

关键词：银杏平颤方；MPTP；形态学；行为学；帕金森病；中药

中图分类号：R285.5

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）11-2348-04

Experimental Study on Treatment of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe

and Its Diffrent Combination on the Behavioral Test and Morphology in the Model

Mouse with Parkinson Disease

ZHANG Jun1,LI Qianjun1,SHUN Hongmei1,BAI Limin1,QIU Tingjian3

（1.Guangzhou University of Chinese Medicie,Guangzhou 510120,Guangdong,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Hulin Hospital of TCM,Hulin 158400,Heilongjiang,China）

Abstract：Objective：To investigate the effect and its mechanism of Chinese herb recipe in the treatment of PD，to measure the effect of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe and its three similar prescriptions on the behavioral test and neurons in substantia nigra compacta（SNc）and striatum of model mouse for PD．Methods：The Parkinson’s disease model was established by consecutive administration of MPTP to C57／BL mice． The doses of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe were respectively given for 2 weeks and 4 weeks in the treatment groups. Animals were examined behaviorally with the pole test consecutively. then killed，Taking out the forebrain and striate body were observed in morphology by HE.Results：(1)Ginkgo Biloba Pingchan Recipe(GBPR) and its three similar prescriptions improved the dyskinesia of PD mice and showed different disability in pole the test and decrease of spontaneous motor activity, the model group mice demonstrated dyskinesia, scores obtained from the behavioral test were increased significantly compared with Normal control group. While the scores in treatment groups showed a marked decrease to some degree (allP0.05).(2)GBPR and its three similar prescriptions protected neurons in SNc. The HE showed that, there were seldom neurons in SNc in model group;while there were much more neurons presented in the treatment groups than that in model group.Conclusion：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe plays role in improving disability in pole test and increased spontaneous motor activity and in protection the neurons．

Keywords：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe;MPTP;behavioral test;morphology;Parkinson’s disease；Chinese medicine

帕金森病又称震颤麻痹，是一种好发于中老年人[1]的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，现在多数学者认为与氧化应激－自由基有关[2-3]。原发性帕金森病的主要临床症状和体征为静止性震颤、肌强直、少动和障碍。有时可出现面目呆滞、发音低、书写字体过小、唾液增多、皮脂外溢、体温增高、出汗增多、便秘、疲乏、手脚痉挛引起的疼痛、抑郁及情感方面改变等。延缓PD功能障碍的抗氧化治疗有诱发精神障碍的副作用[4-5]。为了研究探讨PD的发病因病机，建立了不同的动物模型。以往的研究已证实MPTP小鼠模型的生物化学和组织化学特征均与临床PD相似。因此，本实验采用以MPTP腹腔注射诱发PD小鼠模型，观察PD小鼠行为学、病理学的变化，研究中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠行为及DA能神经元形态结构的影响，以探讨其防治PD的机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物C57/BL6J小鼠，雄性，6～7周龄，体重（18±2）g，购于北京维通利华公司实验动物中心。动物自由进食饮水，动物房12h光、暗交替，平均温度22℃，相对湿度30%。

1.1.2主要仪器1510石蜡切片机：德国LETIZ公司。H-160万能研究显微镜：美国POLYVAR公司。Olympus BX5显微镜：日本Olympus株式会社。Image-pro Plus 5.0图象分析系统:日本Olympus株式会社。自制小鼠测试杆。

1.1.3化学试剂MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）购于美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1中药制备乙醇提取法获得浸膏,溶于蒸馏水中，根据药理学方法计算小鼠给药量[6]，动物用药量根据成人6倍量计算，按照每次灌胃量0.5mL配制。0.1mPa灭菌15min，4℃保存备用。每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃。

1.2.2小鼠PD模型的建立参照Nobutaka Arai,Kazuaki Misugi的实验方法[7]，略加修改，小鼠造模前采用爬杆法[8]进行筛选：动物给药前，先引导动物在15s内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕对其进行测定，选用0分C57-BL/6J小鼠（评分标准见表1），用生理盐水配制的0.3%MPTP（按30mg•kg-1•d-1）腹腔注射，连续5天。

1.2.3动物分组及处理选取0分小鼠随机分成6组,每组12只: ①正常对照组(简称正常组，Normal control，NC)：不作任何处理。②模型对照组(简称模型组，Model control，MC)：生理盐水每天灌胃0.5mL/只。③银杏平颤方全方治疗组(简称全方组,Ginkgo Biloba Pingchan Recipe,G)：灌胃全方中药每天约0.5mL/只(含生药量1.18g/mL)。④清热解毒方治疗组(简称解毒组,Jiedu Recipe,J)：解毒中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。⑤平肝熄风方治疗组(简称平肝组,Pinggan Recipe,P):平肝熄风中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。⑥化瘀通络方治疗组（简称化瘀组,Huayu Recipe,H）:化瘀通络中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。第②～⑥各组从造模第1天开始灌胃，每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃，各治疗组给予相应中药灌胃，模型组给予生理盐水灌胃。MPTP用生理盐水配制，每日30mg/kg腹腔注射，1日1次，各组连续用药5天。以上各组每日进行2次爬杆试验并进行评分，结果进行统计学处理。动物的存活期分别是造模开始14天和28天。

1.2.4小鼠行为学测试爬杆实验：所用工具为一直径13mm、高760mm的光滑不锈钢杆，垂直竖立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准见表1。实验前每只小鼠爬杆2次，选用爬杆行为计分为0分的动物用于实验，称重并随机分组。所有动物于注射MPTP前及末次注射后第1至第3周每日口服药物前后，均进行爬杆试验，每只鼠爬杆2次，积分并计算平均分，评分结果进行统计学分析。

1.2.5组织形态学观察①取材及材料处理：动物用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，打开胸腔，先经左心室升主动脉快速推注生理盐水20mL，后缓缓推注10%福尔马林灌流固定，取脑、置于10%福尔马林固定1周。脑组织经常规步骤处理：脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切片、片厚6μm，常温保存备用。

②HE染色法：石蜡切片烤干，脱蜡，脱苯，Ehrlich氏苏木精染，盐酸酒精分化，蓝化，伊红染色，脱水，透明、中性树脂封片。

③光镜下观察并摄片：根据小鼠脑立体定位图谱，每组每只动物选一张脚间核平面切片，取材部位见图1。

2结果

2.1小鼠行为学改变

2.1.1注射MPTP后 各组小鼠行为表现各组给药（MPTP）后10min小鼠都出现不同程度的肢体震颤，开始前肢抬举伴震颤，后肢僵硬，竖尾、竖毛及跳、蹿等动作，持续约30min后，又出现运动障碍，动作迟缓，短暂性活动减少，对外界刺激易产生尖叫，逃避反应慢；注射MPTP后1h，小鼠表现明显的运动减少，对外界刺激反应低下，之后逐渐恢复。但各组动物症状都于24h后完全消失。随着用药时间延长，动物运动障碍程度增加，症状持续时间和恢复时间延长。中药全方组和拆方各组均可不同程度改善PD小鼠出现的爬杆能力下降、时间延长和自发活动次数减少等上述小鼠行为学异常与模型组比较有显著性差异（P均

2.1.2中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠爬杆行为的影响正常组小鼠在给予生理盐水前后，爬杆测试无明显差异。MPTP 30mg•kg-1•d-1腹腔注射后当日及以后几天，协调能力明显降低，表现为快速下滑，甚至不能抱杆、坠落，持续4日后，于第5日末次注射MPTP后小鼠协调能力逐渐恢复，模型对照组1～4周评分结果与正常对照组相比升高且均有显著性差异（P

2.2病理学改变

2.2.1肉眼观察全部小鼠脑标本外观均未见明显异常，切面检查亦未见出血、坏死和软化灶。

2.2.2HE染色光镜观察正常组14天、28天脑黑质神经细胞形态正常，体积正常，结构清晰，密集成群。模型组14天、28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显减少，部分神经元丧失，残留神经元呈大多角形或锥体形状，有的胞体变小，胞核固缩，胞核结构不清，有的胞核变大，核染色质疏松，有颗粒出现，核周围胞浆有溶解样改变；胞浆染色加深，胞浆内可见大小不等的嗜酸性颗粒并出现小空泡。大部分小鼠黑质区域内尚可见广泛的淋巴细胞浸润，部分淋巴细胞围绕在血管周围形成血管套。残存的神经元体积瘦小，结构不清晰，色素变浅，同时伴轻度胶质细胞增生；与模型组14天和28天比较，银杏平颤方全方及拆方各组14天和28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显增多，神经元体积较饱满，结构较清晰；各中药治疗组14天黑质区神经元形态与28天各组相比基本相似，黑质区神经元数量未见明显减少，但有少数神经元变性，细胞呈圆形或卵圆形，胞浆内未见嗜酸性颗粒出现。但总的看来中药各治疗组与正常对照组比较神经细胞未见明显减少，无特异性改变；有的可见星形细胞轻度增多，胞核变大，偶见核分裂现象。解毒组28天2例黑质区有散在软化灶形成，病灶较小，灶内大多数神经元消失，残留的神经元胞体变小，胞核固缩。部分小鼠黑质区可见弥漫性淋巴细胞浸润，偶见淋巴细胞围绕在小血管周围但并未形成血管套。

3讨论

3.1模型的建立和银杏平颤方对PD模型小鼠行为学改善的作用

帕金森病又称震颤麻痹，临床以肢体震颤、木僵为典型症状，是一种好发于老年人的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，同老年痴呆一样是与衰老相关的神经退行性病。目前认为其脑内黑质纹状体的多巴胺能和胆碱能神经功能平和失调是运动障碍的主要原因，凡引起前者功能降低或后者功能亢进的因素均可以导致震颤。帕金森病人的行为变化为运动协调能力降低，在本实验中，用爬杆实验作为测定动物协调运动能力的指标。模型组小鼠协调运动能力明显降低，并且这种行为异常可持续数日，与正常组有显著性差异，这一结果与文献报道一致。

现在世界公认的两种帕金森病模型药物是6－羟基多巴（6-Hydrooxydopamine, 6-OHDA）和MPTP，6-OHDA是一种神经毒素，大鼠单侧纹状体注射微量的6－OHDA，能够造成多巴胺能神经元坏死，经阿朴吗啡诱导，动物可出现向健侧旋转的现象[9－10]，6-OHDA模型存在造模周期长、成功率低、症状不典型等问题，限制了它的应用。

MPTP是哌替啶的衍生物，可由脑中单胺氧化酶B催化生成MPP+，后者是一种选择性的神经毒素，可以损害人类和灵长类动物脑中黑质中的多巴胺能神经元，MPTP最初发现于吸毒患者的脑内，经分离获得该化合物，注射到猴体内可引起酷似临床震颤麻痹患者的几乎全部症状，并且严重程度与所用剂量和动物年龄成正比。最初认为啮齿类动物对MPTP的毒性不敏感，后来发现接受MPTP注射可能导致该动物出现震颤，但是种属差异很大，大鼠由于脑内MAO-B的活性或水平较低，MPTP不能被代谢成活性产物，因而大鼠对MPTP的毒性不敏感。MPTP注射给药可引起小鼠震颤，特别是C57／BL、BABC等，对注射MPTP产生的毒性极敏感， MPTP引起的小鼠行为学异常虽不像在灵长类动物上的症状典型，但造模周期短、重复性好，实验动物费用低，可引起脑内黑质纹状体的多巴胺含量降低，因此，MPTP小鼠模型被国外许多实验室广泛采用，这种模型为研究帕金森病的发病机理和药物治疗提供了条件[11-12]。

MPTP确可引起小鼠的行为异常，但其引起的小鼠行为变化，因采用的注射剂量、注射次数、注射途径的不同以及所采用的行为观察方法的不同而有所不同[13-16]。本实验采用的是最大剂量和最常用的注射途径，为缩短实验周期采用5次注射，得到比较明显的运动能力降低的效用。为了检查PD小鼠的协调运动能力，本实验选用爬杆试验，即让小鼠头向下倒竖于垂直的金属杆顶部，待其四肢握紧杆后，松手任其自由下行，此实验中，动物被动地下行，当协调能力降低时，行为发生明显改变。

实验结果显示， MPTP注射后，小鼠爬杆能力降低，并且这种行为异常可持续几日，以后逐渐恢复，这一结果与文献使用自主活动法观察的结果一致，采用此方法观察得到的银杏平颤方及其拆方对MPTP所致小鼠运动能力降低的改善作用这一结论是可靠的。

3.2银杏平颤方对PD小鼠DA神经元形态的影响

很多实验证实，MPTP对黑质DA能神经元具有选择性神经毒作用，其致病的过程是MPTP进入体内首先穿过血脑屏障，被星形胶质细胞、5－羟色胺能神经元摄取并在单胺氧化酶 B迅速催化下生成吡啶类代谢产物甲基－苯基吡啶离子（MPP+），MPP+与 DA的化学结构极为相似，故可以被DA转运体（DAT）识别并载入DA能神经元内，然后通过线粒体外膜上能量依赖性转运机制进入线粒体集中起来，之后阻断线粒体NADH氧化呼吸链，最终造成ATP衰竭和细胞死亡[17]，故直接损害DA能神经元的是MPP+。因MPP+和铁离子一样与神经黑色素有很高的亲合性，而黑质DA能神经元含有较高浓度的神经黑色素，所以 MPP+选择性地损伤了SNpc的 DA能神经元，中枢神经系统内其它部位的DA能神经元，如腹侧被盖区DA能神经元损伤则很小[18]。笔者在HE染色和TH免疫组化染色实验中也得到同样结果。DA合成限速酶TH与PD的关系很早就受到了普遍关注。TH已经成为DA神经元的标志酶。大量研究证明，PD动物模型及PD病人体内TH从基因表达、酶蛋白含量及分布到酶活性都存在广泛的异常改变，笔者的另一实验观察了各组小鼠中脑TH阳性黑质神经元，结果显示：模型组小鼠中脑SNpc内TH免疫组化观察到大量DA能神经元脱失，因而经黑质－纹状体通路投射到纹状体的DA神经递质减少，从而引起小鼠多巴胺和乙酰胆碱系统平衡失调而产生行为学障碍；HE染色结果与银杏平颤方全方及拆方各组小鼠行为改变成正比，而且黑质区神经元的变性、退化及坏死程度较模型组均明显改善，仅个别小鼠有轻微的软化灶形成。HE染色和TH免疫组化染色结果相吻合，这表明中药可减少多巴胺神经元的丢失、增加多巴胺神经元内TH的表达，各组中药在不同的时间疗效各不相同，就减少多巴胺神经元丢失的数量而言，在14天以解毒组最明显，28天以全方组最明显；就增加TH的表达而言，14天全方组和解毒组较明显，28天化瘀组较明显。这些变化说明中药银杏平颤方全方及拆方能使黑质神经元的损伤程度减轻，结构和功能接近正常，进一步从形态学方面证实了银杏平颤方全方及拆方可保护神经组织免受MPTP引起的自由基增多及氧化损伤所造成的损害，从而为PD的防治提供形态学依据。

以上结果从行为学和神经病理角度分别证明了模型成功。停药后小鼠行为恢复较快与脑内的表现不太相符，这与其他学者的报道一致[19]，具体机制尚不清楚。中药各给药组（14天，28天）小鼠行为障碍有明显恢复、TH免疫组化显示SNpc内DA能神经元数目较模型组明显增多，且全方组和化瘀组更为明显一些。这些结果提示银杏平颤方及其拆方能改善PD小鼠的行为障碍、对DA能神经元的正常形态及功能有保护作用。银杏平颤方及其拆方28天组治疗效果稍好一些，但与14天各组相比两者之间的差别并不很大，一方面提示银杏平颤方及其拆方对PD的治疗可能存在一定的量效和时效关系，同时也说明在短时间内银杏平颤方及其拆方即可达到满意的治疗效果。

参考文献

［1］Graham DG. Catecholamine toxicity: a proposal for the molecular pathogenesis of manganese neurotoxicity and Parkinson's disease［J］. Neurotoxicology，1984,5（1）：83-95.

［2］Floyd RA, Carney JM. Free radical damage to protein and DNA: mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidatie stress［J］. Ann Neurol，1992, 32 Suppl:22-27.

［3］Perry TL, Godin DV,Hansen S.Parkinson's disease:a disorder due to nigral glutathione deficiency［J］.Neurosci Lett，1982，33（3）:305-310.

［4］Peny TL,Yong VW． Idiopathic Parkinson's disease，progressive supranuclear palsy and glutathione metabolism in the substantia nigra of patients［J］.Neurosci Lett，1986，67（3）：269-274.

［5］Sofic E, Lange KW,Jellinger K,et al.Reduced and oxidized glutathione in the substantia nigra of patients with Parkinson's disease［J］.Neurosci Lett，1992，142（2）:128-130.

［6］徐叔云.实验药理方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1982：470.

［7］Nobutaka A,Yoshio G. Evaluation of a 1-methyl -4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP),treated C57 black mouse model for parkinsonism[J].Brain Res,1990,515:57-63.

［8］施新猷.医学动物实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1980：210.

［9］Hefti f, Eng A, Melaned E.Partial lesions of the nigrostrital pathway in the rat［J］.Neuropharmacol，1985, 24:19-25.

［10］高占国，刘传缋.MPTP的神经毒性与帕金森动物模型［J］. 国外医学•神经病学神经外科学分册 ，1995, 22(5):229-232.

［11］蔡元奋. 神经毒素MPTP处理之老年大鼠可作为研究帕金森氏症候群的动物模型［J］.生理科学进展，1997，28（1）：58-60.

［12］Arial N K, Misuqi Y, Goshima YM. Evaluation of a l-methyl-4-phenyl- 1,2,3, 6,-tetrahydropyridine(MPTP)-treatedC57BlackmouseforParkinsonism［J］. Brain Res，1990,515:57-63.

［13］Sonsall PK, Heikkila RE. The influence of dose and dosing interval on MPTP-imduceddopaminergic neurotoxicity in mice［J］. Eur J Pharmacol，1986,129(3):339-45.

［14］Mohammad Tariq,Haseeb Ahmed Khan.Effect of chronic administration of magnesium sulfate on 1-methy1-4-phenyl-1,2,3,6,-tetrahydropyridine induced neurotoxicity in mice［J］.Pharmaco Toxicol，1998,82:218-222.

［15］Rozas G,Lopez MT,Guerra MJ,et al.The overall rod performance test in the MPTP-treated-mouse model of Parkinsonism［J］.J Neurosci Methods，1998,83(2):165-175.

［16］Miller DB， Reinhard Jr J F, Daniels AJ,et al. Diethyldithiocarbamate potentiates the neurotoxicity of in vivo 1-methy1-4-phenyl-1,2,3,6,- tetrahydropyridine and in vitro 1-methy1-4-phenylpyridinium［J］.J Neurochem,1991,57:541-549.

［17］Dexter DT,Caraon A,VidaAhet M,et al.Decreased ferritin levels in brain in Parkinson's disease［J］.J Neurochem,1990,55(1):16-20.

动物行为学分析方法范文第3篇

【关键词】　慢性酒精中毒；模型；动物

慢性酒精摄入会造成的神经元凋亡，各种认知功能也由此而受到影响（尤其是记忆力、分析能力和注意力）。会出现心理问题、焦虑、抑郁，尤其母体吸收酒精，可引起胎儿酒精综合征，导致神经元发育过程中变性或凋亡，从而影响胎儿［1］。建立良好稳定的酒精中毒的动物模型对于研究慢性酒精中毒的发病机制，指导慢性酒精中毒的防治有实际应用价值。尤其是长期以来多数慢性酒精摄入模型多是采用了灌胃的方法，并且很少在小鼠中建模，局限了研究慢性酒精摄入对脏器，尤其是大脑的病理改变中的作用.本研究探索通过直接饮用含酒精水建立慢性酒精摄入脑损伤小鼠模型，模仿自然摄入，避免了灌胃可能造成小鼠脏器损伤，尤其是脑组织的应激改变，影响对小鼠脑损伤机制的研究。

1　材料和方法

1.1　实验动物　选用健康6周龄BALB/c雄性小鼠12只，体重（23±2g），购自于徐州医学院实验动物中心。

1.2　药物与试剂　无水医用酒精（西陇化工股份有限公司，分析纯，酒精度100%）；鼠饲料（购自于徐州医学院实验动物中心）；HE染色试剂盒（碧云天生物研究所）；olympus倒置显微镜X70（日本olympus公司）；MGC-BP智能型光照培养箱（上海一恒科技有限公司）；冰冻切片机（德国莱卡CM1900）；BK10000光学显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）。

1.3　实验方法

1.3.1　实验分组　将12只6周龄正常BALB/c鼠，随机分二组：不饮酒对照组和慢性酒精摄入组，分笼饲养。模型组小鼠给予酒精混合饮水喂食（乙醇浓度为10%）；对照组给予常规不含酒精饮水，两组小鼠均为标准饲料饲养。喂食过程观察记录模型组小鼠的性情变化，每5天检测小鼠体重一次。

1.3.2　建立模型2个月后小鼠行为学检测后，称重，短颈处死模型组和对照组小鼠，取小鼠大脑甲醛固定，脱水，-80°C切片，进行HE染色（染色步骤见碧云天HE染色试剂盒），显微镜下观察。

1.4　统计学分析　采用SPSS软件进行统计学处理，组间比较采用t检验，以P

2　实验结果

2.1　一般观察　对照组小鼠皮毛光滑润泽，行动灵活，进食及大便正常；模型组小鼠随着饲养，活动量减少、精神萎靡、嗜睡，毛皮松软、稀疏、蓬乱缺乏光泽，进食量减少，体重出现负增长，两组小鼠的体重有统计学差异（P均

2.2　Morris水迷宫　实验通过记录小鼠每次自入水时间直至其找到并爬上平台所需的时间，判断小鼠自身的学习记忆能力，以此作为小鼠脑损伤的一个指标。水迷宫训练5天时间里，模型组小鼠潜伏期时间比正常组小鼠需要时间长，无论是入水找到平台时间还是经过平台的时间都与正常组小鼠相比有显著性差异（P

2.3　组织学观察　冰冻切片HE染色分别观察模型组和正常组小鼠脑组织，发现模型组脑组织有明显的结构空泡、胞质增大、排列疏松、结构不清晰，隐约可见变性坏死的死亡细胞轮廓，提示慢性酒精摄入对小鼠脑照成了一定的实质性损伤。

3　讨论

酒精具有脂溶性，极易透过血脑屏障，与脑中丰富的卵磷脂直接结合，使神经细胞变性、神经纤维脱髓鞘、大脑皮质神经元活动受到抑制，产生持久的神经毒性作用［1］。慢性酒精中毒对人体的损害是一个长期的过程，可造成精神、神经系统和多器官的损害，尤其是对大脑皮层的损害，影响认知功能，可产生精神病性症状［2-3］。研究认为长期酒精摄入导致线粒体功能紊乱、氧化乙醛代谢能力下降、脑组织和脑静脉中乳酸浓度升高，引起脑组织的损伤。研究表明通过母体吸收酒精，引起胎儿酒精综合征，导致胎儿神经元发育过程中变性或凋亡。本实验通过长期低剂量喂食酒精构建慢性酒精摄入脑损伤小鼠模型，模拟现实中慢性乙醇中毒患者长期饮酒的过程。本实验结果表明，直接饮用含酒精水后的小鼠大脑组织神经细胞的数目减少、体积缩小、变形；细胞核轻度固缩，深染，结构消失；部分细胞坏死，细胞溶解、消失，隐约可见轮廓模糊的坏死细胞；小鼠的学习记忆能力大幅衰减，这些症状与与临床上长期饮酒患者出现学习力、记忆力、定向力和智力等功能降低相符合。通过直接在饮用水中加入酒精进行慢性酒精摄入脑损伤小鼠模型造模方法，简单易行，但要保证每只动物饮酒量的一致和酒精有效浓度。这种造模方式更符合自然状态下的慢性酒精中毒脑损伤特征，适合于慢性酒精中毒动物模型的制备，有利于慢性酒精摄入异常机制的深入研究。

参考文献

［1］　李翠莲，石秋艳，等.慢性酒精中毒脑损害［J］.实用心脑肺血管病杂志，2010，18（2）：197-198.

动物行为学分析方法范文第4篇

【Abstract】 AIM: To study whether the blockade of glutamate NMDA receptors in the ventral tegmental area (VTA) modulates the morphine withdrawal in rats. METHODS: The effects of (+) MK801， microinjected unilaterally into the VTA 30 min before naloxone (2 mg/kg， ip) administration， on the morphine withdrawal were assessed. Morphine dependence developed with increasing morphine injection (ip) and morphine withdrawal was induced by injection (ip) of naloxone (2 mg/kg). Wet dog shakes and GellertHoltzman score were used as the indexes to evaluate the intensity of morphine withdrawal. RESULTS: Unilateral microinjection of MK801 into the VTA significantly reduced the GellertHoltzman score and the incidence of wet dog shakes in morphine withdrawal rats. CONCLUSION: MK801 (2， 5， 10 g/L) unilaterally administered into the VTA significantly reduces the intensity of morphine withdrawal syndrome in dependent rats. These data support that glutamatergic transmission in the VTA and its interactions with dopaminergic neurons in the mesolimbic system play some important roles in opiate withdrawal syndrome. Our findings also suggest a potential use of NMDA antagonists in the therapeutic treatment of opiate abuse.

【Keywords】 MK801; Morphine deperdence; substance withdrawal syndrome; receptors， NmethylDaspartate; Rats; ventral tegmental area

【摘要】 目的： 研究中脑―边缘多巴胺回路腹侧被盖区(VTA)内源性谷氨酸信号转导在吗啡戒断形成中的作用. 方法： 给VTA微注射不同剂量谷氨酸NMDA受体拮抗剂（+）MK801，用行为学方法观察对吗啡戒断大鼠戒断症状的影响. 递增量吗啡ip 7 d建立依赖模型，末次给药1.5 h ip盐酸纳洛酮（2 mg/kg）诱发戒断症状，以GellertHoltzman Score和湿狗样颤为评价戒断症状程度的指标，进行统计学分析. 结果： （+）MK801（2， 5， 10 g/L）微注射于VTA可明显减弱吗啡戒断大鼠湿狗样颤的发生次数，且能显著降低吗啡戒断鼠的GellertHoltzman Score. 结论： VTA内源性谷氨酸受体及其与中脑―边缘多巴胺能信号转导相互作用，参与吗啡戒断的形成，提示谷氨酸受体拮抗剂可用于吗啡戒断的治疗.

【关键词】 腹侧被盖区；吗啡依赖；物质禁断综合征受体，N甲基D天冬氨酸；MK801；大鼠

0引言

阿片依赖是一种细胞适应性反应，许多脑区参与，中脑―边缘多巴胺回路系其中之一. 研究表明吗啡戒断大鼠腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元直径、数目减小［1］，放电频率及多巴胺释放量降低［2，3］，可见VTA多巴胺神经元功能下调. VTA多巴胺能神经元既接受自身受体D2的调节，又接受谷氨酸能投射. 激动VTA谷氨酸受体可增加伏隔核多巴胺释放和大鼠运动行为［4］，重复给予吗啡等可增加VTA谷氨酸释放和其受体亚基表达，可见VTA谷氨酸受体功能上调. 但该回路谷氨酸受体在吗啡戒断形成中的作用说法不一，因多数研究以全身或脑室内给药方式进行. 我们在吗啡依赖大鼠诱发戒断前，微注射谷氨酸NMDA受体拮抗剂（+）MK801于VTA，观察其对吗啡戒断症状的影响.

1对象和方法

1.1对象

SD雄性大鼠48只，体质量(235±15) g（西安交通大学医学院实验动物中心）. 盐酸纳洛酮，（+）MK801（美国Sigma公司），盐酸吗啡粉剂（青海制药厂，批号：010202），盐酸吗啡针剂（沈阳制药厂，批号：020907）.

1.2方法

1.2.1手术大鼠在戊巴比妥钠麻醉下，行单侧VTA套管埋植手术，套管埋植在距VTA背侧2 mm处，用不锈钢螺钉和牙科水泥固定在颅骨表面，VTA定位为AP -5.3 mm， ML +0.7 mm， DV -7.7 mm，手术过程用电热毯保持大鼠体温在(37±1) ℃，术后大鼠单笼喂养，且前3 d ip青霉素2000 u/d，术后7 d建立吗啡依赖模型.

1.2.2制模按照文献［5］的方法，首次剂量为10 mg/kg，分别在8：00和16：00各ip 1次，以后吗啡剂量每日增加10 mg/kg，连续注射7 d，其中第6，7日剂量维持在50 mg/kg，建成吗啡依赖模型. 末次给药1 h后，经套管VTA给予(+) MK801 (2， 5，10 g/L)或生理盐水0.5 μL， 30 min后ip盐酸纳洛酮（2 mg/kg）诱发戒断症状［6］，并立即放进透明玻璃缸（50 cm×50 cm×60 cm）内观察大鼠戒断症状1 h.

1.2.3实验分组将大鼠随机分为6组，即第1（盐水对照）组，第2（吗啡依赖对照）组，第3（吗啡戒断对照）组，第4［（+）MK801小剂量治疗］组，第5［（+）MK801中剂量治疗］组和第6［（+）MK801大剂量治疗］组. 每组8只.

1.2.4组织再建行为学观察后，60 mg/kg戊巴比妥钠ip麻醉大鼠，经心灌注200 mL生理盐水快速冲洗血液后，用40 g/L多聚甲醛固定液（0.1 mol/L PB配制，pH 7.4）400 mL灌流1 h，灌注后取脑，置入40 g/L多聚甲醛固定液4℃后固定12 h，再移入250 g/L蔗糖溶液固定24 h以上，按Paxinos大鼠立体定位图谱在前囟后4.8～5.8 mm范围内用冰冻切片机连续冠状切片，片厚50 μm，连续取片，收集于100 mL/L的乙醇溶液，5 g/L Cresyl violet染色［6］，确定给药部位.

1.2.5行为学分析参考FernandezEspejo等［7］的行为学定义和评分标准，戒断症状的严重程度用10个指标衡量，将其分为等级症状（依据出现次数的多少得分）和观察症状（出现即得分）2类，并定义不同的分值，① 等级症状： 湿狗样颤1～2次计2分，3次或更多计4分；后腿直立，跳跃或异常姿势1～4次计1分，5～9次计2分，10次及10次以上计3分；体质量丧失一个百分点计1分. ② 观察症状： 腹泻，眼睑下垂或咬牙出现计2分；激惹或出现计3分. 累加各戒断症状的得分，求得GellertHoltzman Score 评分.

统计学处理： GellertHoltzman Score评分以x±sx表示，所得数据采用Sigma Stat 2.0统计软件进行统计处理，应用单因素方差分析进行各组间比较，应用Post hoc comparisons (NewmanKeuls) 进行均数间两两比较检验；湿狗样震颤发生次数偏态分布，因此以中位数、25百分位数和75百分位数描述，采用Sigma Stat 2.0统计软件进行统计处理，应用KruskalWallis法进行多样本间的秩和检验，应用MannWhitey U法进行两组间比较，以P

2结果

2.1组织再建Fig 1表明了各实验组VTA给药的部位. 其中盐水或(+)MK801注射在VTA范围以外的实验动物，在统计分析时已剔除.

2.2(+)MK801治疗对吗啡戒断大鼠GellertHoltzman Score评分的影响各症状的累计GellertHoltzman Score评分应用单因素方差分析（one way ANOVA）显示6组间的评分差异显著，Post hoc comparisons（NewmanKeuls）检验显示第3组的GellertHoltzman Score评分显著高于其他5组（P

2.3MK801治疗对吗啡戒断大鼠湿狗样颤的影响湿狗样颤系吗啡戒断大鼠的特征性行为，实验过程中第1，2组均未出现. 第3至6组大鼠均有湿狗样颤发生，KruskalWallis法秩和检验显示各组间湿狗样颤发生次数差异显著，进一步应用MannWhitey U方法进行两样本间比较，第3组显著高于其他5组（P

3讨论

VTA是多巴胺神经元的集中区之一，主要起源于A8A10细胞群，该区的多巴胺神经元同时接受抑制性GABA能和兴奋性谷氨酸能纤维投射，前者的输入减弱或后者的输入增加均会导致VTA多巴胺神经元兴奋. 大量研究证实吗啡依赖和戒断的产生与中枢多巴胺能神经元活动密切相关，伏隔核［8］给予D1受体拮抗剂可诱发吗啡依赖大鼠的戒断症状，而全身给予D1受体激动剂可减弱吗啡戒断症状，可见在吗啡戒断时中枢多巴胺能神经元活动减弱. VTA多巴胺神经元主要投射NAcc和mPFC (medial prefrontal cortex)，同时也投射下丘脑和脑干，而下丘脑和mPFC又是自主神经网络的核心，吗啡戒断引起的VTA多巴胺能神经元活动下调进而引起自主神经系统功能加强，表现出戒断行为，因此有人认为多巴胺间接参与吗啡戒断行为的产生［9］；还有人认为吗啡戒断时运动增强直接由VTA多巴胺D2受体引起［10］. 近期的研究表明吗啡戒断大鼠中脑边缘多巴胺回路谷氨酸能神经元活动加强［11，12］，表现为该回路谷氨酸释放量增加，谷氨酸受体亚基GluR1，NMDAR1 表达上调，全身给予AMPA或NMDA受体拮抗剂可减弱吗啡戒断症状，因此认为在吗啡戒断时中脑―边缘多巴胺回路通过谷氨酸能神经元的活动发挥作用.

吗啡依赖模型建立时给予大剂量盐酸吗啡ip，且用2 mg/kg盐酸纳洛酮诱发戒断行为，以大鼠特异和敏感的行为学指标为参数，换算求得GellertHoltzman Score评分，整体衡量吗啡戒断大鼠戒断症状的程度，同时以大鼠敏感而特异的湿狗样颤发生次数为等级症状的代表，进行统计处理. 在实验过程中，吗啡戒断的特异行为如湿狗样颤、跳跃、扭体，在吗啡依赖对照组和盐水对照组均未出现，可见实验所得数据可靠. 另外GellertHoltzman Score评分系GellertHoltzman 于1978年建立的一种经典的阿片类物质躯体戒断评价指标体系. 实验结果表明VTA单侧微注射（+）MK801能明显减弱了吗啡戒断大鼠的GellertHoltzman Score 评分和湿狗样颤的发生次数，但(+)MK801这一作用在3个不同剂量组间未表现出显著的差异. VTA微注射（+）MK801拮抗了谷氨酸受体，从而降低VTA区多巴胺能活动，可见VTA内源性谷氨酸受体调节吗啡戒断行为的形成. 总之，微注射（+）MK801（2， 5， 10 g/L）于VTA显著减弱吗啡戒断大鼠的GellertHoltzman Score评分和湿狗样颤的发生次数，表明VTA内源性谷氨酸受体，及其与中脑边缘多巴胺能神经元相互作用参与吗啡戒断形成，同时提示谷氨酸受体拮抗剂（+）MK801具有治疗吗啡戒断和复吸作用.

参考文献

［1］ Spiga S， Serra GP， Puddu MC， et al. Morphine withdrawalinduced abnormalities in the VTA: Confocal laser scanning microscopy ［J］. Eur J Neurosci， 2003;17（3）:605-612.

［2］ Diana M， Pistis M， Muntoni A， et al. Profound decrease of mesolimbic dopaminergic neuronal activity in morphine withdrawal rats ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 1995;272（2）:781-785.

［3］ Shaham Y， Rajabi H， Stewart. Relapse to heroin seeking in rats under opioid maintenance: The effects of stress， heroin priming， and withdrawal ［J］. J Neurosci， 1996;16（5）:1957-1963.

［4］ Swanson CJ， Kalivas PW. Regulation of locomotor activity by metabotropic glutamate receptors in the nucleus accumbens and ventral tegmental area ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2000;292(1):406-414.

［5］ Hou WB， Zeng YM， Duan SM， et al. M2 muscarinic receptor of spinal cord mediated increase of nNOS expression in locus coeruleus during morphine withdrawal ［J］. Acta Pharmacol Sin， 2002;23(8):691-697.

［6］ Xavier B， Pere V， GarciaSavilla JA. Naloxoneprecipitated withdrawal in morphinedependent rats increases the expression of α 2aadrenoceptor mRNA in brain ［J］. Mol Brain Res， 1997;45(1):154-158.

［7］ FernandezEspejo E， Cador M， Stinus L. Ethopharmacological analysis of naloxoneprecipitated morphine withdrawal syndrome in rats: a newlydeveloped “ethoscore”［J］. Psychopharmacology， 1995;122(1):122-130.

［8］ Harris GC， AstonJones G. Involvement of D2 dopamine receptors in the nucleus accumbens in the opiate withdrawal syndrome ［J］. Nature， 1994;371(6493): 155-157.

［9］ Kandel ER， Schwartz JH， Jessell TM. Principles of neural science ［M］. 4th ed. Beijing: Science Publisher， 2001:960-981.

［10］ Druhan JP， Walters CL， AstonJones G. Behavioral activation induced by D(2)like receptor stimulation during opiate withdrawal ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2000;294 (2):531-538.

动物行为学分析方法范文第5篇

摘　要：目的：应用Walker-256细胞建立大鼠骨癌痛模型。方法：将4×104个W256癌细胞注入SD大鼠胫骨上段骨髓腔内，利用大鼠热板法和足跖加压法分别测量热刺激和机械刺激痛阈的变化，x线摄片进行放射学评、估骨质破坏程度，同时，组织切片HE染色观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况。结果：造模动物在12天左右开始出现热刺激和机械刺激痛阈明显下降(痛觉过敏)，并呈渐进性发展；胫骨x线摄片显示14天即有明显的骨破坏，第21天时出现病理性骨折；组织切片显示骨髓腔内肿瘤生长活跃，向外侵蚀破坏骨皮质。结论：从疼痛行为学、放射学、组织学等方面的研究结果显示，应用Walker-256细胞成功建立了大鼠骨癌痛模型。

关键词：Walker-256癌细胞；骨癌痛；大鼠；动物模型；痛觉过敏

骨癌痛是癌症病人最常见的一种疼痛，约三分之一的晚期癌症病人都会发生骨转移。肿瘤引起的疼痛严重影响了患者的生活质量。虽然治疗骨癌痛有化疗、放疗、三阶梯疗法及二磷酸盐等多种手段，但由于存在疗效短暂和药品不良反应等问题，仍有相当一部分癌痛得不到理想控制。发展新疗法的关键在于对癌痛发病机制的正确认识，然而由于长期以来缺乏相应的动物模型，阻碍了对癌痛发生机制的认识及抗癌痛药物的研发。近几年来国外相继有了股骨、肱骨、跟骨和胫骨癌痛动物模型成功建立的报道，为认识人类骨癌痛的机制以及筛选治疗性药物提供了很好的工具。但在国内，由于受到造模用细胞株来源的限制，癌痛模型复制仍然成为相关课题研究的障碍。笔者通过反复试验，成功地应用国内易得的Walker-256细胞株建立了大鼠骨癌痛模型，从而为抗癌痛药物的评价，尤其是对中药及其复方的筛选提供一个有用的工具。现将研究结果报道如下。

1　材料和方法

1．1 瘤株Walker－256大鼠腹水癌细胞株，由浙江医学科学院提供。

1．2 动物SD雌性大鼠，清洁级，体重140－160g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1．3 主要仪器XZC一2B型自控温度热板仪(山东医学科学院生产)，XZC―A型压力测痛仪(山东医学科学院生产)，高频乳腺摄片机(意大利产)。

1．4造模方法 参照Medhurst等报道的方法，将动物经3％戊巴比妥钠麻醉后，腹部朝上，左侧后肢剪毛，皮肤消毒，在胫骨上段将皮肤切开约1cm小口，小心暴露胫骨，先用5mL注射器针头穿刺打孔，然后换用5μL微量注射器进入骨髓腔，缓慢注入4μL含4×104个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水冲洗，皮肤缝合，在创口处滴撒少许庆大霉素注射液以防感染，假手术组动物左侧胫骨上段注入等体积的生理盐水，其余操作同模型组。

2 模型评价

2．1行为学分别于手术前及手术后第7、12、15、18、21天用大鼠热板法和足趾加压法测量热刺激和机械刺激痛阈。

热刺激：先将热板仪调节温度至(52±0.1)℃，然后将大鼠放置在热板上，待出现舔后足时所需要的时间值(s)即为该动物的痛阈值，每只大鼠测3次，间隔5min以上，取3次均值作为该动物的热刺激痛阈值，筛选基础痛阈在10～30s的动物用于实验。

机械刺激：将大鼠左后足掌置于压力测痛仪压力针下，按动电动按钮，使压力摇杆旋动，随摇杆的旋动大鼠足掌压痛点压力逐渐增加，以缩足或嘶叫为痛反应，出现痛反应时的重量值(×10g)即为该动物的机械刺激痛阈值，每只大鼠测3次，间隔5min以上，取3次均值作为该动物的机械刺激痛阈值。

2．2 放射学于造模后第7、14天分别随机抽取每组大鼠3-4只，第21天收集全部剩余大鼠双侧后肢，进行x线摄片，评估肿瘤诱发的骨破坏程度。放射学评分标准如下，O分：正常的骨结构，无任何骨质破坏的征象；1分：在胫骨近骺端注射部位附近，见小的放射性的骨质缺损病灶(数量少于3个)；2分：髓质骨缺损放射性病灶增多(大于3个)；3分：髓质骨缺失，同时皮质骨受侵；4分：单面的骨皮质完全缺损；5分：双面的骨皮质缺失，移位性骨折。

2．3 组织学将x线摄片后的大鼠后肢进行修剪，留下胫骨及少许软组织，先用4％中性甲醛液固定l周，再在含10％甲酸的多聚甲醛固定液中脱钙1周，石蜡切片，HE染色，镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况。

2．4统计学处理采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异标准。

3 结果

3．1痛敏的形成热刺激：与造模前的基础痛阈相比，模型组第12天开始，大鼠出现热刺激痛阈明显下降(P＜0.01)，以后逐渐降低，其中术后第21天痛阈与第12天比较均有差异显著(P＜0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第12天已出现热痛觉过敏，且呈渐进性加强趋势。

机械刺激：与造模前的基础痛阈相比，模型组第12天开始，大鼠出现机械刺激痛阈明显下降(P＜0.01)，并随时间推移逐渐降低，其中术后第21天痛阈较第12天进一步降低(P＜0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第12天已出现机械性痛觉过敏，且呈渐进性加强趋势。

3．2骨损坏程度大鼠胫骨X线片显示，模型组大鼠左侧胫骨随造模时间的推移逐渐出现明显的骨质破坏，且骨破坏的程度与造模时间成正相关。造模第7天的x线片仅见注射部位松质骨有小的放射性缺损病灶(见图1，评分为1，范围0-2)；第14天，X线示松质骨放射性病灶增多，同时骨皮质有明显缺损病灶(见图2，评分为3，范围2.4)；到第21天，骨破坏进一步加重，骨皮质完全缺失，病灶范围扩大，部分胫骨已出现病理性骨折(见图3，评分为4。范围3-5)。而假手术组胫骨X线片未显示明显的骨质破坏(见图4，评分为0)。

3．3肿瘤细胞的生长造模第7天的胫骨HE切片显示。骨髓腔内及骨小梁间见大量活跃的肿瘤细胞生长，骨小梁破坏较轻，骨皮质仍完整(见图5)；造模第14天，骨髓腔内充满了肿瘤细胞，大部分呈活跃状态，骨小梁破坏加重，骨皮质受侵，变薄，局部可见新生编织骨形成(见图6)；造模第21天，骨髓腔完全被肿瘤细胞所填充，中央大部分肿瘤细胞已退变坏死，而在骨髓腔的边缘部分，肿瘤细胞多呈活跃状态，肿瘤向外生长，骨小梁和骨皮质均完全被破坏(见图7)。而假手术组各时间点大鼠胫骨切片显示，骨髓腔内见各种正常的骨髓细胞，未见其他骨结构的改变(见图8)。

4 讨论

国外报道成功建立的骨癌痛模型主要应用两种瘤细胞，即NCTC2472纤维肉瘤细胞和MRMT-1大鼠乳腺癌细胞，然而，这两种细胞在国内很难获得，限制了癌痛模型的复制及相关课题的研究。因此，如何应用国内易得的瘤株建立稳定癌痛模型具有重要的现实意义和科研价值。资料显示，Walker一256癌细胞具有较好的骨侵袭能力，并且该细胞株来源于大鼠原发性乳腺癌组织，因而应用该瘤细胞建立骨癌痛模型可视为乳腺癌骨转移模型，具有重要的科研价值。

参照文献所述的方法，笔者采用了3种不同浓度的Walker-256癌细胞注入大鼠胫骨上段，并进行动态的行为学、放射学及组织学观察，结果表明，4×103、4×104、4×105个细胞3种浓度均可成功建立骨癌痛模型，且骨损坏和痛觉过敏的程度与瘤细胞浓度大小呈一定的正相关，随注入的癌细胞浓度增大其成模的时间会相应缩短，其中用4×104个细胞造模与文献报道的成模时间基本一致。

通过多次反复试验，笔者的经验是，在整个操作过程中应注意以下几点：一是造模用细胞悬液应于冰块上低温放置，每次抽取时要摇匀，并在2-3b内使用，最好不要超过4h，否则会影响癌细胞的活力；二是穿刺打孔时不可将对侧骨皮质穿透，且注射完癌细胞后应迅速用骨蜡封住针孔止血，否则均会导致癌细胞在骨外生长，易致造模失败；另外，无菌观念和熟练轻巧的动作也是保证造模成功的重要因素，需反复练习。