微生物的纯培养步骤

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微生物的纯培养步骤范文第1篇

关键词：微生物学；实验教学；改革

随着现代生命科学的迅猛发展，对生物学专业学生的需求在日益增加。与之相适应，许多高等院校都相继设立了生物技术、生物工程、生物制药等相关专业。微生物学是生命科学中各专业重要的专业基础课。如何进行微生物学实验课教学改革，是广大微生物学教育工作者面临的新课题。

由于微生物学内容丰富，涉及面广，实践性强，传统的实验课程教学体系已远远不能满足学生今后的发展。在微生物实验教学中，我们发现虽然在详细讲解后进行操作演示，但学生对标准的操作要领并不能很快掌握，以至于在实验过程中还是犯同样的习惯性错误。学生不能很好的掌握实验过程中的具体和关键性的标准操作，不能很好的锻炼学生的动手能力和创新能力的培养。因此，加大实验教学力度，强化实践教学环节等方面的改革势在必行。实验教学课件可以实现实验过程中的一些细节表现。学生可以根据自己的情况有选择的学习或对难点、重点反复的观看和学习。课件操作方便，使用多媒体技术即可自动演示实验过程，可以加强学生对实验操作的认识和思考，提高实验教学的质量。调整和增加新的实验项目将一些独立的知识点贯穿起来，既能增加学生的学习效率，又利于对大学生综合素质的培养与提高，激发学生的学习兴趣。

一、扩充和改进微生物实验项目，调整验证性和综合性实验项目的比例

为了培养学生的综合实验能力和学生的创新能力，体现微生物学实验改革的科学性和实用性，经过多年的摸索和实践对已有实验项目进行了调整和改进。新增加实验项目2项：菌群生长动力学实验和抗生素抗菌谱及抗生菌的抗药性测定；调整实验项目2个：① 实验室环境和人体表面微生物的检查。该部分是将“实验室环境及人体表面微生物的检查”这一实验（6学时）进行延伸。调整后的内容是以该实验为主线，在达到上述目的的基础上，再加上细菌的划线分离、纯培养及菌种保藏等内容，从而让学生较系统的学习培养基制备、高压灭菌、无菌操作技术，细菌培养、划线分离、纯培养技术、通过菌落特征对细菌进行简单分类以及菌种的保藏等知识和技能训练。另外，以该实验为例子，给学生灌输从环境中筛选菌种的方法步骤等。通过本部分的学习，学生能够基本掌握微生物相关操作，建立无菌操作概念，了解菌种的筛选分离等基本知识，为以后的实验准备工作和研究型教学奠定基础。② 将原来的“土壤微生物的分离和纯化（8学时）”改为“土壤微生物的分离纯化和鉴定（不限学时）”。调整后该部分内容是让学生以小组为单位对感兴趣的课题进行文献调研、实验设计、实验操作，筛选出自己感兴趣的菌株并进行鉴定（包括分离株的菌落特征、菌种的形态、大小、染色特性、生理生化特性等，再结合伯杰氏手册进行鉴定）和一定的应用研究（如特殊降解性能），最后以科技论文的形式提交实验报告，以及进一步延伸作为自己的学士学位论文选题研究。在实验过程中，开放实验室，学生可以充分利用课余时间，根据需要安排时间。

针对微生物实验在内容上的调整，我们设计了新的实验教学结构层次。将实验重组为基础、专业、研究性三个教学层次，各层次均由指导、自主、综合、设计等由易到难、循序渐进、不同要求的实验组成；以课程、课外，必做、选做，开放等多种形式开设；开放性实验是在教师的指导下，学生独立设计，独立准备和操作，从材料的准备到实验结束的全过程，都由学生独立完成，完成较为完整和系统的实验课题，使学生品尝自己的研究成果。

二、标准化实验操作光盘和实验教学课件的制作

为满足微生物学实验课教学的需要，丰富教学手段，课程组组织以实验操作经验丰富的教师为主，录制了一套标准化实验操作光盘，制作成教学课件（尤其是操作较为复杂，结果不易观察的实验，如：酵母菌的形态观察、死活细胞的鉴别）。将实验原理、实验目的、实验器材、操作步骤、注意事项以及一些微生物形态与结构以试听形式展现给学生，这不仅增强了实验操作演示的生动性，增加了教学的直观性，而且还使学生能很快掌握操作要领，加强了记忆，从而提高了实验教学水平。

三、改进实验教学的考核评价体系

传统的实验考核的方式主要以实验报告为主，针对这样的考核方式，学生常出现相互之间抄袭，作业敷衍的现象，既不能反映学生实验的真实水平，考核指标也比较单一。针对这些问题，结合实验教学的改革实际，我们重新制订了实践教学评价标准。首先加大了实验成绩在该课程总成绩的中比例，由原来的10%提高到20%；成绩构成包括理论水平、实际操作技能和实验报告三部分，将开放性实验设计方案纳入评分范围，实验进行过程中记录平时成绩，对实验结果不做硬性要求，但可作为评分参考。

四、总结

实验课大多为理论课的附属课程，实验成绩往往作为理论课成绩的参考或以很低的比例计入理论课成绩，在一定程度上造成了学生轻视实验学习和实验能力的培养。微生物实验课是生命科学所有本科专业的必修基础课，每年有几百名学生进入实验室学习，对实验项目的的调整可使众多学生受益。目前调整的实验项目和教学课件已经用于实验教学，效果很好。与以前相比，学生能够更好地掌握微生物最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深对微生物知识的理解；学生的学习兴趣、创造性、积极性都被充分挖掘、调动起来，能够主动地去了解日常生活中的微生物与我们人类的关系，并且养成了良好的学习习惯，为今后的学习打下了坚实的基础；学生能够与别人很好的协调与合作，培养了他们的团队精神。总之，通过项目调整提高了实验教学质量，培养了学生的综合素质。今后我们还将继续进行改进，以期获得最佳的教学模式，推动实验教学的改革进程，使实验课教学真正能够达到应有的效果。

参考文献：

[1] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

[2] 周德庆.微生物学实验教程[M].第二版.北京：高等教育出版社，2010.

[3] 金正一.建设开放性实验室的思考与实践[J].实验室研究与探索，2007，26（1）：124.

[4] 韩冰，李蘅，孟建宇.生物技术专业大学生科技创新能力培养模式的探索[J].中国成人教育，2007，22：144～145.

微生物的纯培养步骤范文第2篇

目前，电导率法和流氏细胞法是食品微生物快速检测比较常用的两种方法，其中以流氏细胞法为原理的仪器，由于投入成本贵，且部分产品的检测结果为死细胞，活细胞总和，因此与国标要求不符。而以电导率法为原理的仪器，因其投入适中、运行成本极低，所以已在中国的许多食品企业中广泛运用。

电导率方法的检测原理

微生物在生长过程中，将大分子的营养物质如蛋白质、糖类等降解成小分子的单糖或双糖，并经进一步代谢产生许多带电小分子，从而导致培养基电导率发生变化，电信号经放大后显示并记录，检测系统每10分钟检测一次电导率的变化。

电导率变化达到临界值所需的时间TTD与样品的初始菌数呈半对数线性关系，我们只要用标准方法(如平板法)为对照，积累一定的数据，做出标准曲线。就可以达到快速定量检测菌数的目的。

选择微生物快速检测系统的关键点

作为食品企业用户，对于微生物检测一般最关注的项目为：

1、检测结果是否真实可靠。重现性如何，以及与国标法的符合率是否高；

2、加量样是否足够大，按要求企业至少要能检测出lcfu／mL(灵敏度高)，加样量的大小决定了灵敏度的高低；

3、检测速度是否快，检测时间是否短以及操作步骤是否简洁；

4、运行成本是否经济，企业对仪器的一次性投资很关注，但更关注日常运行成本。这方面关键是测量瓶是否可以重复使用?重复使用时是否方便可靠?

5、检测方法是否具有权威性，该点主要是指国际上通过的认证，或国内是否有客户基础。

6、其它方面：如检测的灵活性、操作界面的人性化、检测项目是否齐全，培养温度范围如何等。

而目前全世界范围内做电导率检测微生物仪器的生产厂家仅2家，而英国DWS公司是其中最专业的一家，无论从产品性能，技术参数及客户的认可程度来说，该公司生产的Rabit微生物快速检测系统(以下简称Rabit)均是最适合中国国情的选择之一。

DWS公司Rabit最突出的优势

DWS公司生产的Rabit是全球电化学微生物检测领域最具权威的检测仪器，无论在设计、应用、灵敏度、灵活性、人性化角度，都充分考虑到客户的需求，在各方面都有完美表现，具体如下：

运行成本：为适合第三世界国家对检测成本的需要，Rabit使用的是可以高压灭菌并重复使用3年以上的耐高温塑料材质的测量瓶，所以日常的运行成本主要是培养基的成本。以细菌总数为例，使用原厂的培养基，每个检测的成本约1―2元人民币，客户还可以使用其它品牌的进口培养基，菌落总数检测成本低到0.2元。

灵敏度：由于Rabit采用的是10mL测量瓶，取样量1～5mL，与国标检测方法的取样量一致。其中对于不含添加剂的纯冷冻饮品，可直接取1mL溶解后的样品至测量瓶，灵敏度为1cfu／mL；对于添加其它成份的冷冻饮品，可先将样品稀释10倍，再取1样品至9mL培养基(或取5mL样品至5mL双料培养基)中，灵敏度为2-10cfu／mL。

虽然有些用户认为国标要求是小于30000个／mL，但是作为企业来说，我们应该控制得越低菌数越安全。即检测方法越灵敏安全系数就越高，用高灵敏度检测设备检测通过的产品，即使运输过程的冷链或终端出现某些问题，产生产品失效并导致人身健康损害的可能性就越小。

检测速度快：检测速度与样品中微生物数量，样品的加工保存方式、加样量，培养条件，临界点参数等密切相关。样品菌数越高，出结果越快。常见微生物项目的检测时间如下：

常规细菌总数最多24小时，大部分只需12小时左右。实际数据证明，大部分冷冻饮品可以在8～10小时内出结果。

大肠菌群通常只需12小时左右。

霉菌及酵母总数最多48小时。

UHT产品商业无菌测试为48小时。即包括保温24小时，上机检测24小时。

致病菌初筛时间一般为24―48小时。

节省检测时间：一个微生物要形成一个肉眼可见的菌落必须生长到108～109个，而用电导率测定方法，一个微生物生长到106～107个时，就可以明显测量出电导率的变化。电导率法为动态方法，样品中菌数越多，出结果越快。菌数较多的样品，数小时即可出结果。检测原料中微生物时的速度尤其快速。而传统平板法为终点判断法，不管样品中菌数是多少，培养时间都需要2天。因此电导率方法更省时、更灵敏。

操作步骤简单：当曲线校正完成后，我们只需制备好培养基，将测量瓶灭菌好，加9mL培养基(或5mL双料培养基)，直接取1-5样品至测量瓶中，放入仪器，设定好参数即可。仪器24小时全天候工作，非常安全可靠。无需国标法中所需的梯度稀释用的生理盐水、无需梯度稀释、无需倒平板，无需人工计数，无需清洗一大堆玻璃器皿，节省大量人力物力。

权威性：英国DWS公司在欧洲和日本韩国享有盛誉，在欧洲几个主要国家DWS的电导率方法都通过认证，上升为标准方法，在我国，目前一些国际知名的食品和化妆品公司已经购买此仪器投入使用，一些疾病预防控制中心、质检所和检测中心也已经采购这类仪器，并在着手制订相关的标准。

检测的灵活性：Rabit采用单样品管独立控制方式，某一个样品完成检测后，可随时取出，10分钟后放置下一个样品管，非常机动方便。

检测项目：Rabit由于采用了独家专利技术，可进行直接电导率或间接电导率测试，为检测常见的常规微生物项目和致病微生物提供了一个很好的解决方案。其常规微生物项目为：菌落总数。大肠菌群、肠杆菌，革兰氏阴性菌、厌氧菌，产孢菌，酵母和霉菌总数；致病微生物项目为：沙门氏菌，其它致病菌项目可客户自行开发。其每种项目均使用不同的培养基及不同参数。此外，RaNt还可以应用于消毒剂，防腐剂的评估测试，挑战实验，配方优化等方面。

操作界面的人性化：Rabit采用的是基于Windows界面的人性化操作界面，直观地实量饼图，反映样品检测的进展情况；数据可输出至其它统计分析软件进行分析。

其它特点：Rabit培养温度可以在25～45℃之间进行调节；采用干热加热槽，每个模块可放置32个样品管，温度精度达到±0.1℃；一套Rabit软件可最多控制16台主机，多达512个检测。

微生物的纯培养步骤范文第3篇

关键词：微生物学实验课程；多学科融合；教学改革；教学质量；创新能力

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）47-0108-03

微生物学是生物学和生命科学领域中极为重要的基础性学科，同时也是生物工程和生物技术专业的核心课程。由微生物学的发展史不难看出，该学科最重要的特征就是具有实验性和实践性，同时具有很强的应用性。微生物学实验教学既是对微生物基本理论的深化和巩固，又是培养学生观察能力、动手能力、分析问题和解决问题能力的最有效途径，更是培养学生创新能力、科学思维和提高对本专业学习兴趣的重要手段。因此，在开设微生物学课程时，微生物学实验也是既重要又十分必要的课程。我校的生物工程、酿酒专业和生物技术三门本科专业尽管分属于工科、理科性质，但均侧重于培养本领域具有国际视野、创新思维和解决实际问题的高素质人才。特别是我校“国家生命科学与技术人才培养基地”的人才培养目标明确定位为“培养适合社会发展的具有创新精神、实践能力和创业能力的新世纪高层次工业生物技术人才”。同时，微生物学是多个相关学科的联系纽带，特别是生物化学、分子生物学、细胞生物学和发酵工艺学等本专业的学科平台课程和专业核心课程，均依赖于微生物学科的支撑。同样，微生物学和微生物实验课程的知识体系、基本理论和前沿进展又离不开其他学科的支撑，因此，在学科交叉与知识融合的背景下，在本科课程设置和教学模式改革中，我们特别注重微生物学实验教学的教学模式改革和实践效果。

一、微生物学实验课程的传统教学模式及不足

微生物学实验是微生物学的重要组成部分，也是微生物学教学的重要环节。从培养人才目标上来看，微生物学实践教学与微生物理论教学具有同等重要的地位，甚至更高。就我校生物工程专业，微生物学理论课程设定40学时，而实验课程设定48学时，这也从一定程度上反映了实验教学的重要性。传统的实验教学虽有区别，但总的来看多以单元操作实验、结果验证实验为模块进行课程设置，其出发点是以掌握基本实验技能，加深基本概念和理论为目标的。就其出发点来看，传统的实验教学设置课程体系是发挥了良好的效果。但是，对照培养高素质、宽口径和创新型生物工程人才的培养目标来看，传统的实验教学仍有一些不足之处，概况起来有以下几点。一是在主观认知上，认为实验课的目的是验证课堂讲授的理论内容，常采用实验课堂上教师单纯讲解示范，学生一味跟踪模仿，造成了学生被动接受知识的效果。长此以往，实验教学形式僵化，学生上课兴趣降低，导致最终的教学效果很难达到预期目标。二是实验教学内容的设计上呈现点状式、碎片化特征，验证实验过多，综合型、设计型实验环节较少。这种实验内容的设计优点是强调对基础实验技术的掌握，但是很难充分激发学生的创新思维和探索未知世界的兴趣。三是实验安排上采取每周有实验，理论课和实验课并行的特征，导致一些连续性的实验难以及时完成。这种实验课程学时的安排布局看似合理，实则不符合微生物学实验的基本规律，因为有些微生物学实验需要半天、一天甚至更长时间才能完成，而零碎的时间打断了实验的节奏，导致不可预知的实验结果，更为重要的是没有给学生充分的时间去思考、分析和吸收消化所学知识，教学效果肯定大打折扣。为此，我们在吸收、总结传统实验教学精髓的基础上，根据工科专业人才的培养特征，探讨和尝试了一些微生物学实验课教学的新举措。

二、微生物实验教学改革的探索与实践

1.微生物实验课程的体系改革。传统的微生物学实验主要包含无菌技术、染色技术、纯培养技术、显微技术这四大技术。如前所述，一方面，这些实验技术是基本的微生物学实验操作，随着生命科学特别是微生物学科的快速发展，仅仅开设这样实验内容是跟不上学科发展的步伐的，因此微生物实验教学体系结构也要有相应的改革和创新，必须体现新内容、新技术、新方法和新进展。另一方面，实验课程通常将这些实验技术分散在相对独立的实验单元中，各单元之间缺乏方法和内容的有机结合，形成割裂的教学效果，难以有效地培养学生完整的知识体系，融会贯通的理解能力。这种传统的教学形式不利于创新型人才的培养。因此，我们在课程实验教学环节，重构课程实验的教学内容和课程体系，增加综合和设计型实验比重，进行基本技能和创新能力的交叉递进式培养。

首先，通过单元操作技能训练，培养学生的基本实验技能（即染色技术、显微技术、无菌技术、纯培养技术）和动手能力。本部分内容主要包括细菌、放线菌、酵母和霉菌的形态学特征；微生物培养基的配制和接种；微生物培养基的配制与灭菌等。单元操作训练是认识微生物、了解微生物的入门技能，也是开展微生物学研究和微生物工程必备基本技能。在开展单元实验过程中，为提高学生的积极性和实验兴趣，首先结合教学录像进行讲解，在实验的关键点设置思考题，在观看录像过程中，老师随时就问题和学生互动，让学生对实验原理不仅要知其然，还要知其所以然。在问题设置上要能够从细节入手，让学生学会知识的交叉运用、思维方式的灵活拓展。如在进行培养基灭菌实验中，首先设置问题1：常见的灭菌方式有哪些？其适用范围和特点有哪些？根据所学理论知识和老师引导，学生很容易回答这个问题。接着，设置问题2：无菌操作时，超净台面和双手表面如何杀菌？通过这个问题与接种操作技术结合起来。设置问题3：我们在消毒时为何用70%左右的酒精而不是用无水乙醇？通过这个将微生物学和生物化学两个学科进行了有机交叉，实现了知识的融合。紧接着设置问题4：如果工程发酵罐中发现了噬菌体污染，如何消毒？这个问题将理论问题与发酵工程相结合，该问题要求学生既要掌握理论知识，也要熟悉发酵工业才能很好地进行回答。通过四个环环相扣的问题实现了知识的迁移、交叉和融合。其次是通过综合实验设计，强化学生基本实验技能和微生物学基础理论知识的应用。在这一部分中，首先由教师将一系列独立单元实验设计成围绕为解决某一模拟课题而展开的系列关联的实验环节，然后学生利用微生物理论知识结合基本实验技能，在遵循微生物基本原理基础上在一定范围内自主选择实验对象。让学生学习和掌握相关的实验技术和方法并学会对不同实验结果进行分析比较。以自来水中大肠杆菌菌群检测为例，利用微生物的生理生化实验进行微生物的鉴定，并对照水质检测的国家标准来安排实验。在这个实验过程中，不仅利用了微生物学基本实验操作，而且还将大肠杆菌的形态学特征、生理生化特征以及菌种鉴定等知识融合到实验中。更为重要的是，让学生直接认识到微生物特别是大肠菌群在水质监测中作为指标菌的重要应用。再次，通过设计型实验，提升学生利用微生物学理论和实验技术开展工业微生物菌株选育的能力。在这一层次上采用学生自主设计、老师负责把关的开放式实验教学模式，强化工程概念和实践特征。学生通过完成前面两个阶段的实验，对微生物基本理论和实验技能有了较好的理解和掌握。在此基础上，开放式的实验教学按照自由组合分组、独立设计实验方案、协同完善内容安排、时间分配，强调团队合作的基本原则开展实验。老师在整个过程中要起着引导、启发作用。例如：以“从自然界中筛选产酸性淀粉酶（或有机酸）的芽孢细菌”研究课题开展实验为例。学生需要完成如下工作：通过生境分析明确采样地点；完成采样并查找或自行设计快速检出方法；进行富集和选择培养；筛选获得相对优良的产生菌株；初步鉴定和发酵实验。整个环节的完成不仅可以提高学生对实验课的学习兴趣，强化团队协作能力，更重要的是使他们获得一个真实的实验研究过程的锻炼。最后，设置交叉学科的创新课题，引导学有余力的同学积极参与授课老师的相关科研课题，激发学生对生物工程和生命科学的兴趣。如前所述，微生物与分子生物学、生物化学、遗传学、生物信息学等学科有着广泛的交叉与联系，当今工业微生物育种技术在多学科交叉融合的发展趋势下取得了长足的进步。因此，培养创新潜力大、科研素质高的学生，普通的实验设计难以满足需要。我们在不断的探索过程中，初步形成了创新课题的形式，让部分学生真正参与到科学研究的第一线。创新课题实验按照学科交叉、由易到难、注重创新的原则设置。在学生能够独立完成小型课题的基础上，再进一步融入到研究生课题的探索中。如，以“表达绿色荧光蛋白的重组大肠杆菌构建”为课题，将微生物学、分子生物学、生物化学、基因工程、生物信息学等相关学科知识交叉、融合其中，让学生在探索中创新，在创新中实现宽口径、厚基础型的人才培养目标。

2.微生物实验课程的课时安排和考核模式改革。如前所述，传统的实验教学课时安排导致不适宜于微生物实验课程的开展。为了避免分散的课时导致教学效果的降低，教务部门在安排班级教学任务时，会统筹考虑不同课程的差异性，在协调优化课时安排的基础上，排出相对完整的时间安排微生物实验课程教学。另外，任课教师统筹利用下午和晚上连续较长的时间开展教学工作。实践证明，优化课程学时结构，合理安排教学课时能够保障实验的连贯性、一致性，提高学生的积极性，从而显著提升教学效果。考核是实验教学体系的重要环节，是评估学生学习成效的重要手段。传统微生物学实验考核方式相对单一，通常以实验报告为主，考勤情况等为辅综合评定的方法作为考核手段。这种评价方法尽管具有标准公平、成绩公正、易于操作等优点，不足之处在于导致学生仅注重实验结果和实验报告的书写，而忽视了实验过程中发现问题、分析问题和解决问题能力的培养，更重要的是这种考核模式难以真实反映学生对微生物学理论和实验技能的综合分析能力和创新能力。因此，我们也对微生物学实验课程考核方法进行了一些探索和尝试。

首先，我们认为考核的内容不仅应包括对实验原理的理解和基本实验技能的掌握，还应包括分析和解决问题的能力、团队协作精神以及科学严谨的态度。因此，实行实验过程与结果并重的考评方法对于培养学生良好的实验技能和求真务实的科学态度很有必要。

其次，在加强对实验课程的管理和考核规范的前提下，淡化和简化实验报告中操作步骤按部就班的抄写，注重结果分析和讨论，并在实验结束后布置一些开放性的思考题让学生完成。这样，不仅能促使学生通过查阅资料解决问题，增强其学习主动性和分析问题的能力，也能避免学生对实验结果作假和抄袭实验报告的现象发生。

再次，分类考核，全面考查。对于一次实验课能够完成的单元操作实验，指导教师应当场检查学生的实验完成情况和结果，发现问题当场指出并评定课堂表现成绩。教师将根据实验课堂表现和实验报告完成情况，对每个单元实验的综合成绩进行评分。对于需要多次实验才能完成的综合性和设计性实验，要求提供详细的原始记录、实验结果分析报告作为实验成绩考核的重要依据。

三、结语

江南大学生物工程学院的微生物学理论教学和实验教学在多年来不断探索和改革的过程中，逐渐形成了具有特色的学科平台课程。在教学过程中，微生物学理论课老师一般都要担任微生物学实验教学课程，这样老师能够更好地自主协调和平衡理论教学与实验课程在时间、节奏和进度上的合理安排，从而使二者能够相辅相成，相得益彰，整体上提高微生物学的教学水平和质量。通过单元操作实验、综合实验、设计实验和创新实验等由易到难、由浅入深的实验内容结构安排，对学生更好地理解和消化理论课，培养学生动手能力、创新能力有重要的意义。

参考文献：

[1]诸葛健，李华钟.微生物学[M].第2版.北京：科学出版社，2009.

[2]周宜君，刘越，戴景峰，等.微生物学实验教学改革探索与实践[J].微生物学通报，2009，36（10）：1609-1613.

微生物的纯培养步骤范文第4篇

关键词：生物强化技术 废水治理 应用

前言

随着经济的发展，废水的成分日益复杂，尤其当废水中含有有毒、难降解的有机污染物时，由于对该类有机物具有专项降解能力的微生物在环境中的种类、数量较少，同时它在竞争中处于劣势，因此，传统的生物处理技术面临极大挑战。如果在传统的生物处理体系中投加具有特定功能的微生物或某些基质，增强它对特定污染物的降解能力，从而改善整个污水处理体系的处理效果，我们称这种技术为生物强化技术。

一、生物制剂的优点

生物强化制剂具有很多优点：

1、它能缩短微生物培养驯化的时间，迅速提高生物处理系统中微生物的浓度，从而提高工作效率；

2、生物制剂所含天然微生物，不含致病菌和病源体，这些微生物在酶的催化作用下，以污水中的有机营养物质为食物，当污水得到净化后，这些微生物会随着污染物的降低而逐渐减少，直至消亡，不会造成二次污染；

3、使用安全，操作简单方便，基本不需要添加设备或者工程，节省能源，节省资金投入。

二、生物强化技术的作用机理

生物强化技术， 就是为了提高废水处理系统的处理能力， 而向该系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种， 以去除某一种或某一类有害物质的方法。它是通过向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物来增强生物量， 以强化生物量对某一特定环境或特殊污染物的反应。投入的菌种与底质之间的作用主要有：

1、直接作用

就是通过驯化、筛选、诱变、基因重组等技术得到一 株以目标降解物质为主要碳源和能源的微生物， 向处理系统中投入一定量的该菌种， 就会达到对目标去除物去除效果的增强作用。

2、共代谢作用

就是对于一些有毒有害物质， 微生物不能以其为碳源和能源生长， 但在其他基质存在下能够改变这种有害物的化学结构使其降解。如在甲烷、芳香烃、氨、异戊二烯和丙烯为主要基质生长的一些菌可以产生一种氧合酶， 这种酶可以共代谢三氯乙烯（ T CE） ， 但共代谢机制成功地用在生物增强系统中的例子并不多见。

三、生物强化技术的实现

生物强化技术在水污染治理中的有效实施需要三个步骤：首先是高效菌种的培育：其次是高效菌种在投加系统中的生长及活力表现：最终结果是对目标物的有效去除或原系统某一特定性能的改善。

1、从自然界筛选菌种

从自然界筛选菌种的过程多数是以目标物为惟一基质来驯化、分离后得到的菌种，而实际废水水质状况一般比较复杂，含有多种成分，因此将其投加到系统后可能受到其他组分的抑制作用，难以达到预期的治理目标。为此，Babcock等开发了一种离线富集反应器（off―line enriching-reactor）。这种反应器可为生物强化技术的实施提供大量菌剂，并模拟实际废水的组成和环境条件，使投加到系统中的菌种很快适应新环境，从而有效去除目标物。研究认为，通过投加与目标物类似的营养物质可以达到富集培养的目的。通过研究还发现，用纯菌Pseudomonas sp降解1-硝基苯酚，葡萄糖的存在会提高1-硝基苯与最大比基质的去除速率，但此法并不适用于所有的微生物。例如，利用3～4种假单胞属的优势菌种进行2，4-二氯苯氧乙酸与葡萄糖的共基质实验，2，4-D的降解速率不受葡萄糖是否存在的影响。对于那些对目标物的降解需要诱导酶的微生物，可通过投加基质类似物、中间代谢物等作为酶的诱导物，这些物质一般能够产生广谱的亲和性酶，且能够保持高效菌种的降解性并促进其生长。

2、构建基因工程茵

基因工程技术的发展为人类快速获取一些高效菌种提供了新方法。利用降解性质粒的相容性，把能够降解不同有害物质的质粒组合到一个菌种中，组建一个多质粒的新菌种，便能使一种微生物降解多种污染物或完成多个环节的降解过程，并使不带降解性的菌获得降解性。另外，可采用质粒分子育种，即选择压力条件下，在恒化器内混合培养，使微生物发生质粒相互作用和传递，缩短了自然进化所需时间，以达到快速培养新菌种的目的。

3、水平基因转移

高效基因工程菌属于外源菌种，在与土著菌种的生存竞争中常处于劣势，不能维持一定的生存数量和比率，因此一直是困扰这项研究顺利进行的首要问题。由此大量研究集中在利用基因的自然水平转移来实现系统的生物强化上。其主要思路是将位于自由基因元素上的降解基因引入待处理污染物系统，通过自由基因向土著菌种的扩散和转移，实现已有菌种对污染物的原位基因修复。与传统的生物强化方法相比，水平基因转移方法由于降解基因处于一种自由的状态，因此具有如下潜在优点：

（1）含有降解基因的菌种加入到原始系统后，降解基因通过自由的水平转移进入原有系统的固有菌中，由于新菌对环境有更好的适应性，且转移过程是自然发生的，因此降解基因在菌种内也会更好地生存；

（2）在持续高效降解目标污染物的同时，不需要特意维持含有降解基因的菌种在系统中的存活率。

四、生物强化技术的应用

1、焦化废水处理

焦化废水中污染物组成复杂，含有十几种无机物和有机物，有机物包括酚类、芳香族化合物以及含氮、硫、氧的杂环化合物，属较难生物降解的高浓度有机工业废水，国内外研究者现在主要是通过投加高效菌种和化学试剂来提高现有处理设施的处理效率。固定化高效降解微生物的生物强化技术在焦化废水处理中也有成功的应用。通过利用喹啉为惟一碳源，驯化得到处理焦化废水的高效菌种，并使其一部分附着在陶粒载体上处理焦化废水，取得了很高的去除率。

2、印染废水处理

印染废水中含有大量难降解的有机染料，传统的好氧生物膜法去除效果不理想。利用高效脱色菌、聚乙烯醇（PVC）降解菌以及活性污泥接种厌氧一好氧系统，结果表明，利用高效脱色菌和PVA降解菌接种厌氧一好氧处理系统处理印染废水时生物膜形成快，去除效率高且稳定，厌氧反应器对色度的去除率比活性污泥接种高12.5%。

3、垃圾渗滤液

通过EM（efective microorganisms）菌剂培养生物膜和活性污泥来处理渗滤液，结果表明，EM菌剂可明显提高对COD、BOD的去除率，能够加快处理设施启动速度，重新挂膜速度较快，系统的稳定性也有所增强。

结束语

总之，生物制剂对于处理城市生活污水和天然水体的污染有其独特的优势，但是，天然水体中污染物浓度相对较低，如何让细菌适应新的环境，而且在降解污染物的过程中，没有有毒的中间产物生成，这些是其是否得到广泛应用的关键。

参考文献

[1] 姚桂莹，孟艳玲，张建超，王军. 炼油污水厂生物强化处理中试研究[J]. 四川环境. 2011（06）

[2] 李景全，肖盟，石步乾，苏全，杨彬，李国良，赵世玉，唐雪冰，张忠智. 生物强化技术在油田污水处理工程中的应用[J]. 油田化学. 2011（03）

微生物的纯培养步骤范文第5篇

【关键词】生物表面活性剂；鼠李糖脂；污水；修复

1、前言

随着人们的生活水平不断的提高，餐饮业在各个城市也迅速发展，餐饮废水的排放量逐渐增大，由此而产生的含油脂污水特别是含高浓度油脂的污水量大幅度增长，已成为城市生活污水的重要组成部分。油类物质进入水体，则漂浮于水体的表面，影响水体的复氧及其自然净化过程，危害水体生态系统，又会引起水体的富营养化，威胁环境和人类健康。

目前处理餐饮废水的方法主要有物理法、化学法和生物法三种方法。与物理、化学法相比，微生物处理法具有经济、高效的优点，并可以实现无害化、资源化，所以生物法在污水处理中长期以来占重要位置。

生物表面活性剂在污水的修复中有明显的增效作用。和化学合成的表面活性剂先比具有以下优越性：①生物表面活性剂具有一般化学合成的表面活性剂所不具有的独特的化学结构，从而产生一些对修复有用的性质。②生物表面活性剂是由微生物代谢产生的可生物降解的物质。投放到被污染地区不会造成新的污染。③与化学合成的生物表面活性剂相比，生物表面活性剂的生产价格是可以接受的。④生物表面活性剂可以在污染地区及其附近生产得到，不需要运输和储存。本实验主要通过合成生物表面活性剂鼠李糖脂，并将其加入校园含油污水中研究其对污水降解的增效作用。

2.实验部分

2.1实验材料与方法

2.1.1实验材料

（1）实验土样：石油污染土样取自油田油井附近地表深度为10cm左右的石油污染土壤。

（2）种子培养基斜面培养基（g/L）：牛肉膏2.0，蛋白胨5.0，NaCl5.0，琼脂20.0，pH值7.0。

（3）种子培养基（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨5.0，NaCl5.0，pH值7.0。

（4）发酵培养基（g/L）：豆油50，NaNO3 8.0，KH2PO4 1.0，Na2HPO4・12H2O 1.0 ，FeSO4・7H2O 0.2，PH值为7.0。

（5）苯酚溶液的配制：取5ml苯酚溶液放入到100ml容量瓶中，稀释到刻度，得5%的苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。

（6）鼠李糖标准溶液的配制：准确称取一定量鼠李糖溶于100ml容量瓶中，然后再配成不同浓度的标准溶液。

2.2实验仪器及试剂

2.2.1主要设备

超净工作台 JJT-7A

全自动高压灭菌锅 HVE-50

震荡培养箱 QHZ-98A

高速台式冷冻离心机 HFsafe1200

电子分析天平 BP211D型

2.2.2实验试剂及仪器

无机盐培养基（BR，上海化学试剂公司）、氯仿（AR，上海化学试剂公司），经重蒸后使用。甲醇（AR，上海化学试剂公司）、苯酚（分析纯重蒸馏试剂）、标准鼠李糖（国药）、氢氧化钠（分析纯）、盐酸（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、去离子水、蒸馏水、分液漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、直形冷凝管、蒸馏头、锥形瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、移液管、吸耳球、药勺、胶头滴管、容量瓶、移液枪、称量瓶。

2.3实验步骤

2.3.1产表面活性剂菌的分离纯化

取土样2.5g，加200mL无机培盐养基，在30℃，120r/min 的恒温摇床上振荡培养7d，移取一定量的富集培养液接入新鲜含油无机盐培养基中，同样条件下培养7d，共重复3次，在无菌的条件下，用接种环蘸取驯化培养液，在分离培养基的平板上划线后，平板倒置于恒温培养箱中培养24h，然后将典型菌落在分离培养基的平板上反复划线纯化后得到单一菌落，再将纯化的菌株接种至斜面培养基上培养后，4℃保存于冰箱中。

2.3.2鼠李糖脂的发酵培养及提取

配置发酵培养基，高压灭菌后将A6 4%接入发酵培养72h，取发酵液在8000r/min，4℃下离心20min取出上清液，加6mol/L的HCL调节PH值至2.0，静置过夜。用等体积氯仿/甲醇=2/1萃取，取下层有机相，64℃减压蒸馏得到浅黄色浆状物，既为表面活性剂的粗产物。

2.3.3鼠李糖脂的含量测定

将鼠李糖脂粗产物稀释至0～80mg/l的范围内，用同样的方法在480nm下测吸光度。根据标准曲线计算鼠李糖脂的浓度。得到的鼠李糖脂的浓度（CRH）和鼠李糖浓度（CR）的倍比关系CRH=3.5CR，计算鼠李糖脂的浓度。

2.3.4鼠李糖脂产生条件的优化

分别以葡萄糖、原油、甘油、豆油为唯一碳源，以NaNO3为氮源发酵培养，考察不同碳源条件下生物表面活性剂鼠李糖脂的产量情况。用同样的方法研究以尿素，NH4Cl，（NH4）2SO4，NaNO3为唯一氮源，豆油为碳源时，生物表面活性剂鼠李糖脂的产量情况。确定最优碳源和氮源。

2.3.5鼠李糖脂在污水修复中的应用

（1）污水中油脂含量的测定

取50ml混合均匀的水样，加入等体积的氯仿萃取，取出氯仿相。减压蒸馏，将其中的氯仿蒸出。准确称量称量瓶的重量，并将蒸馏后剩余的油脂用少量的氯仿溶解转入称量瓶中，放入水浴锅中将其氯仿蒸发殆尽（多次称量直至重量恒重），再准确称量称量瓶和油脂的总重量，减量法得出称量瓶中油脂的重量。

（2）鼠李糖脂在污水修复中的作用

取三组混合均匀的水样各1L，给其中一组加900mg/l的鼠李糖脂，另一组加入同样量的鼠李糖脂和降油菌，另一组做空白对照，分别测第5、10、15天时废水中油脂的含量，观察其变化情况

3.实验结果与讨论

3.1产表面活性剂菌株的分离和筛选

从油田油井附近所取的土壤样品中，经过平板分离筛选纯化，得石油降解菌A6。A6菌为铜绿假单细胞菌， A6菌株形态特征和生理生化试验指标等实验结果与假单胞菌属的基本特征一致，所以以A6菌为实验所用的菌。

3.2鼠李糖脂的发酵培养及提取

在发酵生产的鼠李糖脂过程中，发酵液在培养的第二天就发生了明显的乳化现象，表明以豆油为碳源能够诱导试验菌种产生鼠李糖脂，从而促进菌种对豆油的摄入和利用。萃取过程中，出现界面明显的分层，上层呈浅绿色，中层乳白絮状混浊乳化层，下层为透明至白色有机溶液，取下层萃取液于旋转蒸发仪中，减压蒸馏得到棕黄色鼠李糖脂粗品。

3.3鼠李糖脂的含量测定

（1）鼠李糖标准曲线的绘制

用紫外分光光度法在480nm处测得鼠李糖的标准曲线（见图1.1）的标准方程y=0.172x+0.0188――①，相关系数为0.9992，可见样品中鼠李糖的浓度和吸光度之间的关系可以很好的用①式表示。

①式中：y――鼠李糖溶液的吸光度。

x――鼠李糖的浓度，单位mg/l。

（2）鼠李糖的含量测定

测得样品的吸光度为1.501，将测得的吸光度值代入方程y=0.172x+0.0188中，得x=86.17，样品中鼠李糖的浓度为86.17mg/l。根据鼠李糖脂的浓度（CRH）和鼠李糖的浓度（CR）的倍比关系CRH=3.5CR，计算出样品种鼠李糖脂的含量为30.17%。

3.4鼠李糖脂产生条件的优化

（1）碳源优化

分别选用葡萄糖、原油、甘油、豆油为唯一碳源，NaNO3为氮源，发酵培养，所产生鼠李糖粗产物的干重如下图：

由图可以看出，甘油为碳源时产生的鼠李糖脂的量最多，而以豆油为碳源时产生的鼠李糖的量仅次于甘油为碳源时产生的鼠李糖脂量。

不同碳源产生树立糖脂的量不同，碳源是构成细胞物质和供给微生物生长发育所需要的能量，为细胞代谢产物中碳源开来源提供营养物质，不同为生物对碳源的利用情况有差异，但大部分微生物以有机碳化合物为碳源和能源。碳源的分析结果显示，甘油为碳源是鼠李糖脂的产量最为理想，甘油发酵中细胞生长和产物合成具有相同的代谢途径，所以鼠李糖脂的产量高。但是由于甘油成本较高，从经济方面考虑，豆油是大规模生产鼠李糖脂的首选碳源。

（2）氮源的优化

分别以尿素，NH4Cl，（NH4）2SO4，NaNO3为唯一氮源，豆油为碳源，在相同培养条件下发酵培养，测得鼠李糖脂粗产物的干重如下图：

由上图可以看出，以NaNO3为氮源时所产生的鼠李糖脂最多。氮源是合成生物表面活性剂鼠李糖脂的关键，它提供了合成原生质和细胞其它结构的原料，对微生物的生长发育和稳定生长及细胞产生生物表面活性剂其重要作用。NaNO3在鼠李糖脂的合成中具有促进作用，NaNO3为合成鼠李糖脂最佳氮源。

3.5鼠李糖脂和降油菌联合植物对污水的修复

（1）污水中油脂的含量

恒重法测得50ml混合均匀的水样中油脂的含量为0.0227g，经计算得出餐厅污水中油脂的含量为0.454g/l。

（2）鼠李糖脂在修复中的作用

分别测得鼠李糖脂及鼠李糖脂加降油菌对污水中油脂降解效果

由上图可以看出，三组污水中油脂都降低了，并且降解时间越长降解率随之增高。空白组中油脂的含量都有所降低。加入900mg/l的鼠李糖脂后油脂的含量和COD值有明显的降低，降解率约增加10%，污水在鼠李糖脂和降油菌共同作用下降解效果最好。

污水有一定的自净能力，水中的有机污染物在微生物的作用下进行氧化降解，逐渐被分解，最后变为无机物，是污水中有机污染物浓度降低。在污水中加入生物表面活性剂后，污水的降解率有明显的增高，原因是鼠李糖脂可以增强污水中疏水化合物的生物可利用性和生物降解作用，主要通过增加疏水的不溶性基质的表面积和增加疏水化合物的生物利用率来对污水进行修复。其次，鼠李糖脂的乳化作用可以使油脂液滴在水相中分散，并且增加两相之间的界面面积，能增强憎水性物质的亲水性和生物可利用性，降低其表面张力，降解率增加。鼠李糖脂还可以增加细胞壁的疏水性，使油脂进入细胞内从而被酶代谢，油脂在水中溶解度极低，鼠李糖脂可以促进疏水化合物的分散，增强疏水化合物的利用率。微生物是污水修复的主体，主要通过分泌胞外酶对有机污染物降解和吸收到细胞内由胞内酶对有机污染物降解，在污水中加入降油菌后，污水中微生物的种类和数量都有所增加，有机污染物会其被充分利用，降解率增高。

4、结论

本实验主要研究了生物表面活性剂鼠李糖脂的发酵产生及提取方法，并对其产生条件进行了优化，最后将其加入餐厅污水中研究在餐厅污水降解中的作用。实验得出的主要结论有：

①可用发酵法发酵产生鼠李糖脂并用萃取法可将鼠李糖脂从发酵液中提出，减压整蒸馏后可得到黄色胶状物鼠李糖脂。

②碳、氮源的优化结果表明，产生生物表面活性剂的首选培养基为（g/L）：豆油50，NaNO3 8.0，KH2PO4 1.0，Na2HPO4・12H2O 1.0 ，FeSO4・7H2O 0.2，PH值为7.0。

③生物表活性剂主要通过增加疏水的不溶性基质的表面积和增加疏水化合物的生物利用率来对含油进行修复。其次，鼠李糖脂的乳化作用可以使油脂液滴在水相中分散，并且增加两相之间的界面面积，能增强憎水性物质的亲水性和生物可利用性，降低其表面张力，降解率增加。鼠李糖脂还可以增加细胞壁的疏水性，使油脂进入细胞内从而被酶代谢，油脂在水中溶解度极低，鼠李糖脂可以促进疏水化合物的分散，增强疏水化合物的利用率。

【参考文献】

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