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【关键词】房建施工;管理;工程质量
1.概述房建工程施工管理的现状
1.1 房建工程施工人员和管理人员综合素质低
首先从事房建工程施工的人员大都是进城务工的农民工,这些人普遍文化水平较低,安全意识淡薄,对房建施工的专业知识也知之甚少,更别提具备相关的专业证书和上岗资格证了,他们从事房建工程施工仅仅是为了糊口,这种状况直接影响了工程的质量,同时也是造成安全事故频繁的重要因素之一; 其次是施工管理人员综合素质不高,具体表现为文化水平较低,缺乏基本的管理知识,不能有效的掌控全局等,这些无疑都对房建工程质量的提高起到了严重的抑制作用。
1.2 施工管理创新意识和创新力度低下
很多施工单位观念过于保守,不敢尝试新事物,害怕冒险,片面认为引进新工艺、新设备、新技术都是浪费,结果使施工团队一直停留在传统陈旧的管理模式上, 在质量检测手段和方法上不能与时俱进,仍然运用传统的方式来进行,而这些方法早已被先进的、专业的施工企业所摒弃,由于缺乏创新意识和创新举措,致使施工管理的水平不高,管理能力低下。
1.3 采用事后控制的落后管理模式
事后控制管理模式的弊病是众所周知的,应用这种模式很容易导致工程质量问题不能被及时发现和解决, 从而埋下质量安全隐患,以致在后期频发各种房建工程事故, 很多施工单位为了赶工程进度,明知这种情况还继续采用此种管理模式,可谓害人害己。
1.4 缺乏完善的管理制度
健全完善的管理制度可以有效保障企业顺利施工,在开展工作的过程中做到有法可依,有章可循,进而确保工作有条不紊的进行下去,但是当前很多企业似乎对这方面工作并没有给予足够的重视,存在体制制度不健全,项目责任管理不明确等现象,最典型的就是在一个施工团队中一人身兼数职,试想一下,这样又怎么能真正提高房建施工质量管理呢。
2.采取提高房建工程施工管理水平的有效举措
2.1 要加强对工程质量的控制和管理
施工企业要切实重视对施工现场工程质量的监控,这是提高工程整体质量的有效举措之一,具体建议可从以下三方面着手展开,首先施工单位要积极构建质量保证体系, 不断健全和完善质量管理制度,将质量管理责任具体落实到个人,这样可有效提高相关负责人的质量意识和责任意识,在施工之前,就要先做好质量技术交底工作,将质量技术交底和作业指导书发到施工班组, 使施工团队做到心中有数,同时还要正确划分各级技术管理人员的权限, 使各级人员都能各司其职,各尽其能,切实做到责任到人;其次要做好施工全过程质量控制,所谓施工全过程质量控制,主要指事前、事中、事后质量控制,事前质量控制主要是指在施工之前,对整个项目施工现场进行整体的规划和把握,事中质量控制主要是指在施工的过程当中,对工程质量进行做好监控和把握, 事后质量控制顾名思义就是指在工程项目完成之后,严格按照相关标准和规定对工程成品进行验收, 做好质量评定工作;最后要严格控制好工程施工程序,按照施工工艺进行施工,建议可请专人来负责这项工作,这是提高工程质量的关键之处,同时施工单位还要勇于尝试和采用新工艺、新技术,通过技术的革新和进步,实现施工质量和效率的提高。
2.2 要做好对工程进度的把握和管理
做好对工程进度的把握和管理,确保按时完成建设项目,避免拖沓现象的出现,为此可着重做好以下几方面工作,首先施工单位在施工之前,要合理编制好施工进度计划,计划编制完成之后,要严格按照施工计划进行和实施,及时调配人力、物力及资金等,保证工程的顺利施工,与此同时,做好动态跟踪,及时检查和发现各种可能影响工程进度的问题和因素,并采取有针对性的措施加以改善,把隐患扼杀在萌芽状态;其次利用好施工时间,合理配置好施工资源,施工资源和时间的配置也是工程部署的一个重要组成部分,因此切不可轻视这方面工作,一是要做好施工机械的均衡和限制,因为可能布置的机械数量或者可能获得的台班数量,都起着关键性的作用,直接决定着主要工程量可能达到的最大施工强度;二是在人力资源安排上,要努力实现时间上的均衡,力争达到人力资源的最优化,从而取得最佳的工作效率。
2.3 努力优化工程成本,实现企业经济效益的提高
工程成本的高低直接影响到企业经济效益的高低,因此施工单位要严格科学的控制好施工成本,首先要做好成本预算,合理规划好资金的支出, 施工单位先要深入仔细的研究招标文件所列的各项条款,并在此基础上,对投标工程成本作出科学的预测和计算,分析在正常情况下,完成工程所需要的人工费、材料费、机械费等,然后,制定正确的投标报价策略,最后要做的工作就是做好标书的书写,这样可为今后可能发生的索赔等提供保障和依据;其次要控制好工程成本,还要加强对施工现场的监管,坚决杜绝偷工减料及浪费现象的发生,在施工材料的采购上,要选择那些思想觉悟高,责任心强,工作清正廉洁的采购员开展这项工作,在保证质量的基础上降低采购成本,对工程材料的消耗量做到心中有数;最后对施工机械要注意保护和保养,努力增加机械的使用寿命,对机械进行出租时,也要做到合理安排,使之利用达到充分化和高效化。
2.4 做好施工现场的安全管理
安全问题是每个施工单位在施工中的重中之重,不断提问安全意识和技能,不仅是保障施工人员生命权力的需要,也是减少施工成本的需要。首先要积极构建安全生产制度和体系,要求施工人员严格按照安全规章制度进行操作,相关负责人也要切实履行好自身工作职责,定期对各项目工程进行安全工作检查,对于发现的违规操作现象,要按照相关规定进行严肃处理,绝不姑息纵容,这样可起到有效的警示作用;其次施工企业要加强对安全知识及安全重要性的宣传教育,使安全施工的理念深入每一位施工人员的心中,此外项目组还可成立专门的安全管理小组,设置专职安全员,加强对工人的安全技术交底,这样可有效减少安全事故的产生;最后相关负责人要做好安全生产检查,明确奖惩制度,在施工过程之中,除了要进行正常的安全检查之外,项目组还要不定期的进行抽查,一旦发现问题,要将问题落实到个人,做到整改责任人,并彻查出现问题的根源,这样可有效减少或消除安全隐患,此外施工单位要实施明确的奖惩制度,对安全工作模范及个人给予及时的鼓励和表扬,使之继续发扬这种良好的行为。
3.结语
综合以上,房建工程质量的优劣直接关系到千家万户的利益和安全,关系到房建行业能否得到健康长远的发展,为此施工单位要做好充分的思想准备,加强对实践的摸索和总结,同时注意学习和借鉴其它施工企业先进的管理模式和方法,相信经过这样长期的努力,一定可以提高工程管理的质量和水平。
参考文献:
[1]甄守奎.加强房建工程质量管理体系的探索[J].现代企业教育,2009(16).
氧化法本身又有多种分类,主要是石油化工企业产生的废水在成分上具有巨大的差异,所以要针对其成分特点选择具体的氧化方法,以实现高效、最经济、最安全的处理石油化工废水的目的。在此介绍几种典型的氧化方法和适用范围:第一,利用光催化氧化法处理含有21种有机污染物的污水,效果显著,且不会产生二次污染,该方法属于最新的处理石油化工污水的技术方法,目前还在研究和完善中;第二,利用湿式氧化法对含有有毒有害污染物和高浓度难降解的有机污染物进行处理,经过实践调查研究,利用湿氧化法处理石油化工废水时COD、无机硫化物等物质的去除率分别能达到81.8%和100%。该技术方法在应用上效果显著,能够有效的控制环境污染物,我国通过湿式氧化法处理石油化工废水在效果上已经达到了国外同类设备处理石油化工废水的效果;第三,利用臭氧化法与生物活性炭吸附技术相结合对石油化工废水进行深度处理,能够有效氧化有机污染物,同时提高活性炭的含氧量,延长使用期限,降解效果显著。
物理方法处理石油化工废水
物理方法处理石油化工废水也有诸多的分类:
1吸附
吸附是指通过利用固体物质的多孔性来吸附废水中的污染物的物理方法,吸附一般选用活性炭,因为活性炭具有较强的吸附性能,处理废水效果好,但是吸附方法在应用上具有成本高、易造成二次污染等缺陷,所以吸附方法需要和上文提到的絮凝和臭氧氧化方法结合运用。
2膜分离
膜分离污水处理方法在类型上也表现为多样化,如微滤、超滤及反渗透等,在实践应用中膜分离技术方法在去除石油化工废水的臭味、色度上都具有十分显著的效果,还能够有效去除有机污染物和微生物,该技术方法具有稳定可靠的应用价值。
3气浮法
气浮法是通过投放分散度高的小气泡哎粘附石油化工中的悬浮物,小气泡在废水中浮升到水面也会把附着物带出并使油类物质分离。在石油化工废水的处理程序中,气浮法是在经过絮凝工序后应用的技术方法,经过实践表明,气浮法在处理石油化工废水中具有稳定可靠的效果,值得继续推广,夸大其使用范围。
生化方法处理石油化工废水
1好氧处理
好氧处理的方法种类较多,在石油化工废水处理中可以应用的好氧处理方法有高效好氧生物反应器、生物接触氧化等技术方法,这一方法一般都与厌氧处理方法相结合应用,很少单独在石油化工污水处理中使用。
2厌氧处理
石油化工废水可生化性能差异在处理上一般需要先进行厌氧处理来提高其在后续的处理中的可生化性。厌氧处理方法主要有两类:其一是在高浓度有机废水的处理中应用的升流式厌氧污泥床,不但成本低,效果也十分显著;其二是厌氧固定膜反应器,能够有效截留附着污水中的厌氧微生物,将污水中的有机污染物进行转化后去除,该技术方法具有简单便捷、应用时效长的特点,也具有深远的应用价值和推广必要。
3组合法
石油化工废水的污染种类复杂多样,在不同的炼油厂废水水质表现得不尽相同,所以在处理方法上也不能单一的使用某种方法,所以将好氧处理方法与厌氧处理方法有效结合在处理效果上必将更加有效。这种组合的处理方法经过在石油化工废水处理中应用,效果非常好,所以值得在应用中加以推广,来为废水处理提供更加安全可靠的技术方法。
关键字:施工现场 强化 管理 探索
如今的建筑行业,表面看上去一片繁荣昌盛的景象,实际上建筑行业与行业之间也存在巨大的竞争。只有各大企业加强自身的建设队伍、提高自身的管理水平,才能在这么激烈的竞争环境下拥有一席之地。建筑施工现场管理,作为企业管理的关键部分,是企业生产活动的直接体现。提高建筑工程施工现场的管理工作,有利于降低施工企业的施工成本,实现有计划、有组织、有秩序的进行建筑施工,提高企业的影响力。
一、建筑工程施工现场管理存在的问题
施工技术管理与材料管理不到位,难以保证工程的施工项目的质量;由于工程项目覆盖面极广、工程量极大、需要的材料也极多,企业管理人员缺少经验与责任心,对一些施工技术与施工图纸理解不到位,导致施工现场问题频发。不仅工期会拖后,质量更是无法得到保证;在材料管理上,很多企业也无法做到对材料的预算上做到十分准确,造成了材料的浪费,甚至许多不合格材料混入项目施工现场,在利益的驱使下,偷工减料,从而导致工程项目的质量无法得到保证,最终影响到的还是企业自身。
目前,我国建筑行业虽然蓬勃发展,但各方面发展都不均衡,监督体系不够完善,与之相关的制度体系也没有完全形成。在法律上,对于施工现场约束力也不够,到底许多企业在建筑工程施工时没有收到国家法律的约束,监督与管理无法面面俱到,实际执行力不强,在评定的时候也缺乏权威性与可信度。工程的监督也变得有形而无神,难以发挥深入有效的监督作用,企业检测的手段也没有达到应有的真正管理和控制的效果。另外,监督管理人员的技术水平与专业知识也不全面,难以有效对建筑企业的现场施工进行有效管理。
在建筑企业施工现场,往往存在一些难以发现的安全隐患,施工企业往往对这些安全隐患不够重视,对安全管理的意识不够强,只注重一些表面上的检查工作。在各项安全条例上,企业没做到条条落实;在安全管理制度上,企业没做到完善;在安全教育上,企业也得到重视。总而言之,企业对安全管理不够重视,不够投入,千万不能忽略这些细节,往往在施工现场发生安全事故,就是源于这些小小的安全隐患。
二、 建筑企业施工现场管理的具体措施
首先要从技术、材料、设备、施工现场的安全管理、施工资料管理等几个方面进行具体分析。
第一,在技术方面,要求企业在施工前就根据施工现场的需要,制定出切实可行的施工计划,根据实际的情况,编写出施工的方案。由于一个工程项目的所包括的工程量以及技术量十分巨大,这就需要企业的项目部全体人员做好对建筑图纸的审阅工作,深刻理解图纸的内涵,将施工方案做到完美;并且要结合当地的气候特征,地形地貌的特点,编制出适合自己企业合理施工的方案,确保每一项工程都在控制的范围内。在施工时,要建立起完善的质检机构,用科学的手段定期对施工项目进行检查,以保证施工的质量。对施工人员进行必要的培训,使施工人员掌握适当革新技术,做到用科学的手段规范施工。
第二,在材料方面,由于在施工现场,所需的材料量十分巨大。因此需要对材料的使用做好记录,控制材料的用量,以免发生浪费行为。另外,一定要关注市场上出现的新材料、新产品,做到科学施工、科学管理。材料的价格有时会随着国情与建筑市场而变化,所以关注材料价格的变化也是企业应该做到的。有关部门在采购时,要做好必要的市场调查,进行货比三家,深刻了解所需材料的价格,然后尽快与生产厂家联系并签订合同,减少材料转手的过程,降低了材料的成本,这样更有利于施工资金的充分运转,以保证工程施工的正常进行。在材料的使用时,一定要严格做好记录,严格按照施工方案的计划发放施工材料,并对发放的材料进行监督与调查,使所有的建筑材料得到合理的使用,避免丢失浪费。
第三,在工程项目施工的时候,机械设备也不不可或缺的一部分,而所需的机械设备数量多,种类杂乱,这就要求企业要堆设备的使用有一套完善的管理办法,否则势必会引起混乱,这样不仅影响施工进度,还会增加施工的成本。所以企业必须加强设备的优化配置,参照工程量与合同合理确定所需设备的型号与数量,按照施工组织的计划,合理分配施工机械的使用,不是常用的机械,能够租赁的尽量使用租赁的方法,最大化的节约施工项目成本。在设备的使用管理上,使用的技术人员应该对设备的操作规范、性能、特点有相应的了解,在使用时一定要按照规范的要求安全操作,并且要定期对设备进行保养,坚决不允许过度使用机械设备的情况,以免机械疲劳工作发生安全事故。只有加强设备的管理,才能降低项目施工的成本,使工程项目取得更高的经济效益。
第四,在施工现场安全管理,直接关系到企业的生存与发展,正所谓安全是企业之本,这不仅关系到企业在社会的声誉,更关系到企业人员的人身财产安全。所以施工现场的安全管理,对工程项目的效益有着直接的影响。如何做好施工现场的安全管理,是项非常艰巨,也非常棘手的工作。做好施工现场的安全管理,首先要健全施工项目的各项安全管理制度,建立有关的各项管理机构,将安全生产的意识落实到每一个职工身上,做到人人懂安全、人人讲安全、人人重视安全的地步。另外,还要做好对施工安全管理的系统分析,对危险进行大致的分类,让企业人员对发现的安全事故进行比较,准确分析其产生的危险性。最后,还要加强对施工现场安全管理的监督,要不定期进行突击检查,对发现的问题绝不手软,一定要将监督工作做到位。
第五,在项目工程的验收时,要有一套非常完整的竣工资料,作为评价单位工作质量的依据,在项目竣工时,一定要注意对竣工资料的收集与整理,这也是作为建筑工程项目的技术性文件。在对资料进行管理时,要严格挑选专门的资料管理员,严格按照要求对资料进行分类,严格遵守管理制度对资料进行妥善的管理。在施工过程中的一些试验报告、调查记录、有关参数等等进行收集与归档,要将整个施工中所有的材料、机械设备的相关证书进行整理,并积极与资料管理业内人士了解具体的要求与规定。
三、结束语
加强建筑工程施工现场管理,是企业管理水平的体现,只有加强建筑工程施工现场管理,才能符合各方要求,建造起理想的工程项目,因此,这就要求施工建筑企业重视对建筑施工现场的管理,将建筑施工现场管理贯穿于整个施工过程。这不仅对提高整个施工工程的质量具有重要的意义,还直接关系到人民群众的生命财产安全问题。因此,各企业的管理人员在施工现场管理中需要不断探索、不断总结、不断创新,要学会接受新鲜事物,引进先进的管理理念,以此来提升企业管理水平,这不仅将实实在在地提高建筑工程施工质量,还能降保障施工企业的经济效益和社会效益。
参考文献:
[1]吕保军.建筑工程现场管理问题的探讨[J].建造师,2009(07)
[2]吴树壮.建筑工程现场管理的实践与探讨[J].科学技术管理,2007(S1)
关键词:根结线虫;人工培养;牡丹根腐病镰刀菌;优化方法
中图分类号:S436.412.2+9 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2012)11-0117-04
An Optimized Artificial Culture and Preservation Method
for Tomato Root-knot Nematodes
Liu Li, Yan ShiCui, Yao LiangTong, Ding YanQin, Du BingHai*
(College of Life Science, Shandong Agricultural University /Shandong Key Laboratory of
Agricultural Microbiology, Taian 271018, China)
Abstract Root-knot nematodes seriously decreased the production of crops, fruits and vegetables worldwide, and its artificial culture relied heavily on host plants. In this study, the tomato roots infected by root-knot nematodes were adopted from greenhouse of Fangcun Town, Taian City, Shandong Province, and the root-knot nematodes and eggs were separated by the method of mechanical beating-sifting spray and inoculated to double medium of Fusarium solani. The density of root-knot nematodes was about 2 300 per mini liter medium when inoculated with root-knot nematodes for three weeks and about 2 000 when inoculated with eggs for four weeks. Live root-knot nematodes could still be obtained after 5 months, if the culture plate was preserved at 15℃. This optimized method was independent of host plants, processed more simply, could obtain large quantity of root-knot nematodes in short time and preserve for long time.
Key words Root-knot nematode; Artificial culture; Fusarium solani; Optimized method
根结线虫(Meloidogyne spp)是一类广泛分布在世界各地的植物根系定居性内寄生线虫[1]。根结线虫属寄主范围广泛,可侵染的植物超过3 000种,分属114科,如蔬菜、粮食作物、经济作物和果树、观赏植物以及杂草都可被侵染[2,3]。根结线虫一旦发生,很难彻底清除,连作期愈长发病愈重。在温带、亚热带、热带地区的植物受害比其他地区更为严重,病害可造成作物减产10%~20%,严重时可达75%以上,还能传播一些真菌和细菌性病害[4,5]。
目前关于根结线虫的分类、生物防治、基因组研究已比较深入,而其培养和保存的研究相对较少。一直以来,对于根结线虫的培养多利用活体寄主植物如盆栽番茄、拟南芥、辣椒、马铃薯、空心菜等,或者是寄主植物的组织培养离体苗和根段外植体的方式,具有作业量大、过程繁琐、耗时长的缺点[1]。鲍时翔等(2009)[1]发明了一种利用香蕉枯萎病镰刀菌(Fusarium oxysporum fsp cubense)培养和繁殖根结线虫的方法,解决了根结线虫的培养依赖寄主植物的问题,但该培养方法存在供试菌种单一、操作过程非常繁琐复杂的缺陷。本研究小组在其基础上进行优化和改进,简化培养过程,优化操作方法,发现了另一种可用于根结线虫人工培养的镰刀菌——牡丹根腐病镰刀菌(Fusarium solani),用其制作二重培养基接种根结线虫悬液或卵悬液,培养出大批量根结线虫。该方法脱离了寄主植物束缚,操作更为简便,具有高效繁殖和长期保存根结线虫的优点。
1 材料与方法
11 供试材料
从根结线虫发病较为严重的山东省泰安市房村镇的日光温室中采集根结线虫侵染严重的番茄植株的根系样品,分离根结线虫和卵。用于番茄根结线虫培养的供试菌种为牡丹根腐病镰刀菌,由山东省农业微生物学重点实验室提供。
12 番茄根结线虫的分离
采用机械捣碎—过筛喷淋法。用清水洗净番茄根结样品,用剪刀将发病重、根结多的根系剪成长约1 cm的小段,放入组织捣碎均浆机中,加适量水捣碎5~10 min,形成线虫与根组织碎片的混合物。将混合物倒入装有10% NaClO溶液的三角瓶中,使溶液没过根系,摇晃三角瓶3 min[6]。再将混合物倒入组合筛上,组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目。用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约05 h,使线虫和卵从根组织内移到表面,被喷雾水冲洗至组合筛的底部。注意调节好水的流量,以免水溢出使线虫流失[7],喷淋后期使用无菌水。喷淋过后,取出组合筛中的325目筛,用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗,使线虫集中到筛的一侧,然后再用少量无菌水从筛的背面冲洗筛上物,收集液体到容器中,获得根结线虫悬液,并配成200条/ml的浓度。用同法冲洗500目筛,可制备卵悬液。
13 番茄根结线虫的人工培养方法
131 镰刀菌菌种的活化 从斜面保藏的牡丹根腐病镰刀菌菌种中挑取一小块接种到PDA培养基中活化,在28℃的培养箱中培养3~5 d。
132 镰刀菌种子液的制作 从活化好的真菌中挑取1个菌块接种在容积为100 ml内装50 ml液体PDA培养基的三角瓶中,于转速180 r/min、温度28℃条件下培养2 d即可获得真菌的种子培养液。
133 二重培养基的制备 将获取的真菌种子培养液以每板01 ml的量均匀涂布至固体PDA培养基中,在28℃的培养箱中倒置培养2 d左右,待整个培养皿长满菌丝后即为二重培养基。用于制作二重培养基的PDA平板要适当增厚,以延长根结线虫的培养时间。
134 根结线虫悬液的制备 见本文“12”番茄根结线虫的分离(采用机械捣碎-过筛喷淋法)。
135 根结线虫的接种与培养 无菌条件下,将制备好的根结线虫悬液05 ml(约100条)或卵悬液05 ml(约100个),接至二重培养基圆心处,合盖静置1~2 h使液滴浸沉,用膜封口,在28℃培养箱中倒置培养[1]。
从第二周开始,在根结线虫培养平板上菌丝消失区域均匀取样,用样品中的线虫数估算每毫升培养基中的线虫数。具体方法为:用半径为35 mm的打孔器,打孔取培养基样品至24孔细胞培养板中,每孔2块培养基样品、1 ml无菌水,搅拌均匀。每孔取40 μl混合液至96孔细胞培养板,在倒置显微镜下计数,每孔重复3次观察计数,计算24孔细胞培养板每孔中线虫虫体数目,然后估算每毫升培养基中的线虫数,统计3个线虫培养平板,每周测1次,直至第9周。
136 培养线虫的存放 对于已经进入繁殖高峰期的根结线虫培养平板,要转入冷凉条件下存放,可置15℃培养箱内[8]。
14 从培养平板获取根结线虫悬液或卵悬液
无菌条件下,在根结线虫培养平板上取适量培养基于容积为100 ml内装40 ml无菌水的三角瓶中,封口,于180 r/min摇床上振荡培养10 min,使线虫与水充分混合。在摇好的混合液中加入10% NaClO溶液21 ml,使混合液中NaClO浓度为05%,摇晃3 min[9]。然后将混合液倒入组合筛上。用本文12 中过筛喷淋的方法获取根结线虫悬液或卵悬液,并配置成所需浓度。
15 从培养平板获取根结线虫二龄幼虫悬液
根结线虫卵孵化的二龄幼虫是在整个线虫生活周期中对寄主植物根系具有侵染力的阶段,因此获取根结线虫二龄幼虫悬液具有重要意义。具体方法为:将根结线虫培养平板置于倒置显微镜下,用解剖针挑取其中的卵粒,置于200目网筛里,先将网筛置于05% NaClO溶液中摇晃3 min,然后置清水中1 min,并冲洗3次,再将网筛置培养皿中并使皿中的清水刚好没过筛底的卵粒,置28℃培养箱中孵化,每隔24 h收集皿内的二龄幼虫[9,10],收集3次,将收集的线虫二龄幼虫悬液配至所需浓度,置4℃备用。
16 线虫传代培养方法
为了获得持续和稳定的根结线虫源,需要对进入虫体繁殖密度低谷期的根结线虫培养平板进行换板传代。用本文“14”中的方法获取根结线虫悬液或卵悬液,然后用“13”中的方法,将悬液接种于二重培养基中,可继续培养根结线虫。
2 结果与分析
21 番茄根结线虫培养平板的变化及分析
用牡丹根腐病镰刀菌制作二重培养基培养根结线虫过程中发现,接种根结线虫悬液的平板,一周后中央接种处的菌丝开始消退,消退圈逐渐向四周延伸;培养两周时平板如图1所示;培养二周半时平板菌丝即完全消失,剩下黄褐色局部暗褐色的潮湿的培养基,而且此时培养基具有软度大、较松散、难以用镊子夹取等特点。对于接种卵悬液的平板,试验结果与接种线虫悬液的平板相似,只是中央菌丝消失时间要比接种线虫悬液的平板晚,两周时菌丝开始消退,三周半左右才可消失完全。
图1 接种根结线虫悬液二周时的线虫培养平板图片
由平板变化现象可知,接种线虫悬液后,线虫需要一段时间来适应平板环境,然后才开始取食菌丝。而接种卵悬液的平板菌丝消失时间要比接种线虫悬液的平板晚,这是由于卵适应平板环境后还需要先孵化成二龄幼虫,然后再取食菌丝所致。
22 根结线虫的密度变化
由图2可知,在接种线虫悬液的平板内,根结线虫不断繁殖,到第三周线虫密度达到最高峰,约为2 300头/ml培养基,然后随着时间的延长,平板内菌丝减少,空间拥挤,代谢废物增加,使根结线虫生存条件下降,线虫虫口密度不断降低,到第九周时,线虫密度约为120头/ml培养基,仅为高峰期的5%。接种卵悬液的平板,在第四周虫口密度达到最高峰,约为2 000头/ml培养基,第九周时,虫口密度约为240头/ml培养基,为高峰期的12%。从线虫密度总变化趋势来看,在第六周进行根结线虫换板传代培养最适宜。第四周到第九周,虫体密度变化趋势在局部(接种线虫悬液的平板在第七周,接种卵悬液的平板在第五周)呈不正常凹陷,可能是因为平板内部分区域线虫虫体密度不均所致,但不影响虫口密度变化总趋势。将牡丹根腐病镰刀菌菌丝完全消退后的根结线虫培养平板转入15℃条件下存放,5个月后培养基内仍有可供继代繁殖的活虫体。
图2 平板在接种线虫或卵后不同时期
线虫密度数量统计3 结论与讨论
根结线虫的分类研究已十分深入,生防研究也已在世界各国广泛开展,而关于根结线虫培养保存的研究却相对较少[1]。国外一些学者将根结线虫在离体拟南芥和番茄上进行繁殖[11,12],但试验条件要求高,要在严格无菌条件下。Barker等人介绍的根结线虫繁殖方法,设备和程序复杂,不易应用[13]。王汝贤等(1999)[13]在Lambert等(1992)水培法[14]的基础上简化改进,形成根结线虫的一种水培繁殖方法。吴庆丽等(2006)[15,16]在比较根结线虫在番茄和马铃薯上培养效果的基础上,研究了不同马铃薯品种对根结线虫的培养效果,并对其光照条件进行了研究。焦春伟等(2012)[17]利用空心菜适应性强且在沙培浇灌营养液条件下生长周期长、易管理的特点,用其培养爪哇根结线虫和花生根结线虫取得较好效果。目前国内外根结线虫的人工培养主要还是依靠盆栽番茄、拟南芥、辣椒、马铃薯、空心菜或其他寄主植物,存在作业量大、周期长、寄主对环境条件的适应性差、过程繁琐或不易管理等问题[16]。鲍时翔等(2009)[1]用香蕉枯萎病镰刀菌培养植物根结线虫取得较好效果,但其方法存在供试菌种单一,操作过程非常繁琐复杂的缺陷。
本试验在鲍时翔方法的基础上对其培养方法进行优化和改进,简化培养过程,优化操作方法,发现了一种可用于根结线虫培养的新镰刀菌——牡丹根腐病镰刀菌,解决了根结线虫培养长期依赖寄主植物和培养过程繁琐的问题,具有脱离寄主植物束缚、操作简便、高效繁殖和长期保存根结线虫的优点。该方法培养的根结线虫活性不变,其二龄幼虫对番茄幼苗依然具有侵染活性,其制备的根结线虫二龄幼虫悬液和卵悬液,可在许多研究如植株的抗线虫性[18]、根结线虫病害的生物防治、线虫的分类鉴定、基因组学研究等工作中使用,为根结线虫的进一步研究提供了便利。参 考 文 献:
[1] 鲍时翔,曾庆飞,方 哲,等一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法[P]中国专利,2009
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[关键词] 熊胆粉提取物;洗涤工艺;近红外光谱;偏最小二乘;柔性工艺
[收稿日期] 2013-07-24
[基金项目] 浙江省公益技术研究项目(2012C21102);中国博士后科学基金第六批特别资助项目(2013T60604)
[通信作者] *瞿海斌,Tel:(0571)88208428,E-mail:
[作者简介] 李文龙,助理研究员,E-mail:
在中药生产过程中,存在着这样一类问题:单元工艺过程每批投入的原料(输入)质量存在一定的波动,而工艺参数是固定的,导致很难保证工艺过程生产出的产品(输出)的质量一致性。为解决这类问题,必须充分考虑原料质量的波动,并为之寻求最为适宜的工艺操作参数,以提高产品质量批次之间的一致性。概括起来说,就是对于在一定范围内变化的原料,采用随之变化的工艺参数,以提高产品质量的一致性[1]。本课题组研究将此前馈控制理念应用于中药生产,是符合中药复杂体系的特点的[2-3]。
在熊胆粉提取物生产的过程中,洗涤工艺至关重要。该工艺是对熊胆粉粗提物的进一步纯化,使最终提取物中熊去氧胆酸含量高于控制限,同时使鹅去氧胆酸的含量低于控制限,在满足这2个条件的前提下,实现产率最高。在洗涤过程中,最为关键的工艺参数是乙酸乙酯的用量,若乙酸乙酯用量过多,会造成熊去氧胆酸的损失,用量较少则不能有效除去鹅去氧胆酸。由于各批次的熊胆粉粗提物质量存在一定的波动,因此在生产中如何优化乙酸乙酯用量变得非常重要。
近红外光谱信息丰富、分析快速,近年来有较多的文献报道将其应用于中药材[4-6]、中成药[7-9]及各类中间体[10-11]的定性判别和定量分析。利用中药的近红外光谱能够较为全面地反映其理化性质,避免用一个或几个物化指标反映中药质量的不足。本文采用近红外光谱反映熊胆粉粗提物的质量信息,通过模拟生产实验,以熊胆粉粗提物的近红外光谱数据的主成分得分值和乙酸乙酯用量为输入变量,对最终提取物的纯度和产率进行回归,研究输入物料信息、工艺参数和产品质量三者之间的关系,建立相关模型,以起到指导生产的目的。
1 材料
Antaris MX FT-NIR(Thermo Fisher公司,美国),配备Sab IR漫反射采样装置及RESULT3.0光谱采集软件;HY-5回旋振荡器(江苏省金坛市宏华仪器厂);Agilent 1200液相色谱仪(Agilent公司,美国),采用ELSD检测器;采用Unscrambler ( V9.6, CAMO PROCESS AS, 挪威)和Matlab ( V7.0, MathWorks, 美国)软件进行数据分析。
熊胆粉提取物,熊胆粉粗提物(上海凯宝药业股份有限公司);熊去氧胆酸,鹅去氧胆酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号分别为110755-9003,110806-200704);乙腈(色谱纯,Merck公司),三氟乙酸(色谱纯,TEDIA公司),其他试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 样品的制备 取16批熊胆粉提取物、熊胆粉粗提物,采集其近红外光谱后,每批熊胆粉粗提物按质量分成若干份,每份约10 g,得到40份样品。精密称定每份样品的质量,加入一定质量比的乙酸乙酯,置摇床上震荡洗涤60 min,26~30 ℃静置12 h以上,洗涤结束后抽滤,弃去滤液,将沉淀烘干即得精制后的熊胆粉提取物成品,计算收率,并采用HPLC-ELSD测定成品中熊去氧胆酸及鹅去氧胆酸的含量。
在熊胆粉提取物的生产当中,熊胆粉粗提物洗涤工艺规定的乙酸乙酯用量为4倍量,但是由于存在操作误差等诸多因素,实际的乙酸乙酯用量会有所变化,因此本实验设计的乙酸乙酯与样品质量比在3.0~5.0波动,具体用量见表1。
2.2 熊胆粉粗提物光谱采集 将熊胆粉提取物、熊胆粉粗提物混匀后装入样品杯中,利用Sab IR漫反射光纤采集光谱。样品采集温度25 ℃,以仪器内置背景为参比,波数范围4 000~10 000 cm-1,扫描次数64次,分辨率4 cm-1。为了保证不同批次样品光谱的可比性,样品装填的厚度、精密性在实验中尽量保持一致。
2.3 成品含量测定 本实验采用HPLC-ELSD[10]测定洗涤后熊胆粉提取物成品中的熊去氧胆酸及鹅去氧胆酸含量。Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);流动相0.05%三氟乙酸溶液(A)-乙腈(B),线性梯度洗脱,0~8 min,65%~100% B;流速0.8 mL・min-1;ELSD漂移管温度40 ℃,雾化气(N2)压力350 kPa;柱温40 ℃;进样量5 μL。所建方法经过验证,可用于熊胆粉提取物的分析,在上述色谱条件下,所得样品的色谱图见图1。
表1 不同试验批次中乙酸乙酯与熊胆粉粗提物质量比及最终收率
Table 1 The weight ratio of ethyl acetate and coarse extracts of bear gall powder in different experiment batches
注:纯度为产品中熊去氧胆酸的质量分数;收率为产品(熊胆粉提取物)占原料(粗提物)的比例。
2.4 样本集的划分 根据收率梯度(表1)将40批样本划分为校正集与验证集,其中30批样本为校正集,用于建立模型,剩余的10批样本为验证集,用于检验模型的可靠性。校正集收率范围86.10%~92.57%,验证集收率范围87.70%~91.56%。校正集和验证集样品的统计信息见表2。校正集样品的含量及收率分布范围均覆盖了验证集样品,而且样品分布都比较均匀,可知这种划分是合理的。
1. 熊去氧胆酸; 2.鹅去氧胆酸。
图1 洗涤后熊胆粉提取物的特征色谱图
Fig.1 Chromatogram of the bear gall powder extract after refining
表2 校正集和验证集样品的参考值信息
Table 2 Statistical information of the references values for the calibration and the validation sets%
3 结果与讨论
3.1 特征波段的选择 按2.2项下所列的光谱采集条件得到的样品的光谱图见图2,考虑到4 000~4 500 cm-1受光纤吸收影响,噪音较大,而9 000 cm-1以上的高频波段样品光谱吸收差异不显著,因此本实验选择的建模波段为4 500~9 000 cm-1。
3.2 光谱预处理 为有效消除颗粒分布不均匀及颗粒大小产生的散射影响。经过比较,选用多元散射校正(MSC)方法对光谱进行预处理。样品背景颜色和其他因素常导致近红外光谱出现明显的位移或漂移,常采用微分处理的方法进行基线校正。其中,一阶导数可有效消除光谱平移对测量的影响,二阶导数可消除光谱旋转对测量的影响[12]。但微分处理在除去低频基线的同时,还会放大高频的噪声,因此在微分处理前,通常都要进行平滑处理以滤去噪声。常用的平滑方法有Savitsky-Golay平滑方法和Norris导数滤波平滑等。本项研究以模型预测能力作为判断依据,选用Norris导数滤波平滑(11,5)和一阶导数对光谱图进行预处理。
图2 40批熊胆粉粗提物原始近红外光谱图
Fig.2 NIR spectra of the 40 batches of bear gall powder coarse extracts
3.3 主成分个数的确定 对预处理后的光谱数据进行主成分分析,所得不同主成分数所解释的光谱之间的差异,见图3,主成分数为8时,所能解释的光谱差异已在95%以上,为保证模型的信息量和稳健性,选用8个主成分进行建模。
图3 不同主成分数所解释的光谱之间的差异
Fig.3 Cumulative contribution rates of different principal components
3.4 模型的建立及评价 将光谱数据的前8个主成分的得分值和乙酸乙酯的用量作为输入变量,分别采用偏最小二乘方法对产物的纯度(熊去氧胆酸/%)和收率进行回归,建立校正模型。所得模型的各项性能参数见表3。所建模型校正集和预测集的相关系数都接近0.90,表明所建模型具有较为满意的拟合效果和预测能力。
表3 所建模型的各项性能参数
Table 3 Performance parameters of the calibration models
注:RMSEC.校正误差均方根。
3.5 熊胆粉洗涤柔性工艺应用方法 所建模型确定了原料性质、关键工艺参数和产品质量三者之间的关系。当新批次的熊胆粉粗提物需要进行洗涤操作时,可先采集其近红外光谱并进行预处理和主成分分析,得到前8个主成分的得分值,作为原料性质变量代入所建模型中,在3.0~5.0倍量的乙酸乙酯用量,每隔0.1作为一个工艺参数变量。根据原料性质变量和工艺参数变量,利用模型预测成品的纯度和收率,分别得到20组结果,在这20组结果中,选择纯度合格、收率最大的一组,则该组对应的乙酸乙酯用量即为最佳工艺参数。
4 结论
中药生产过程中,存在着原料质量一致性较差的特点,生产中为了提高原料的利用率,保证产品的安全有效,必须根据原料的具体特点,选用最为合适的工艺参数。本项研究以熊胆粉粗提物的洗涤过程为例,探索以近红外光谱反映原料差异,对工艺参数进行设计,建立根据原料性质和工艺参数预测产品质量的模型,可为熊胆粉粗提物的洗涤过程提供指导,并为类似的中药工艺过程提供了借鉴。
[参考文献]