微生物方法学研究

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微生物方法学研究范文第1篇

关键词：土壤微生物生态学；核酸探针杂交；梯度凝胶电泳；PCR

土壤中存在着极其丰富的微生物种类，它们在土壤生态系统中各自行使着独特的功能。自1953年以来，分子生物学理论和技术取得了惊人的成就，许多分子生物学研究方法和理念被应用到微生物生态学研究中，为微生物生态学研究领域注入了新的活力，极大地推动了微生物分子生态学的发展。下面介绍近年主要的几种研究方法：

一、标记核酸探针杂交技术

1.基本原理

以核酸分子杂交技术为核心，利用探针分析DNA序列及片段长度多态性。探针是能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，它可以是长探针（100～l000bp），可以是短核苷酸片段（10～50bp），也可以是从RNA制备DNA探针，斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法。

2.应用

科学家应用核酸杂交方法研究了被燃油污染及不污染的土壤提取的细菌DNA，结果表明：被污染的土壤提取的细菌DNA中各种烃的降解基因的检出率显著高于不污染的样品，且定量分析结果表明污染越严重，这种降解基因的含量越高，因而可以用该方法作为对土壤中燃油污染程度的评价。

3.原位荧光杂交技术

（1）基本原理。FISH是以荧光标记取代同位素标记的一种新的原位杂交方法。它检测核苷酸序列是利用荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核苷酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。

（2）应用及其优缺点。可以进行样品的原位杂交，应用于环境定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，现已成为微生物分子生态学研究中的热点技术，在土壤微生物分子生态学领域应用广泛。FISH技术的应用受到环境样品微生物的生理状态的影响，芽孢、放线菌及休眠时期的细胞的细胞膜的通透性低，影响群落中部分种属丰度的错误估计。

二、基于PCR技术的研究方法

PCR是一种聚合酶链式反应技术，主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异扩增目的基因或DN段，使研究的目的基因及其环境样品中的微量微生物基因得到无限的扩增，为这些基因和微量微生物种群的研究提供了保证。

1.PCR-RFLP方法

（1）原理。PCR-RFLP法是将PCR引物中的一条加以荧光标记，其基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。

（2）应用。现在很多研究人员利用16SrRNA来研究土壤微生物的多样性。该技术还可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群的变化。

2.PCR-SSCP方法

（1）原理。日本Orita等研究发现，单链DN段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。

（2）应用。Sabine Peters等人用该法研究群落的演替和菌种的多样性，并同传统的培养方法比较指出PCR-SSCP方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰，适合对微生物群落结构和演替的分析。

三、DNA扩增片段梯度电泳检测技术

1.变性梯度凝胶电泳

（1）基本原理。双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DN段区分开来。

（2）应用。DGGE方法是应用最早也是最常用的单碱基突变筛查方法之一，自从1993年DGGE被引入微生物学以来，该技术被广泛地用作分子工具比较微生物群落的多样性以及监视种群动态。PCR-DGGE用于分析华盛顿州东部4种土壤细菌群落结构和多样性，结果表明：管理和农学实践对细菌群落结构的影响比年降水量更大。

2.温度梯度凝胶电泳

（1）基本原理。温度梯度凝胶电泳技术则是利用温度梯度变性的原理，利用了不同分子在温度改变下构象的差别进行分离。

微生物方法学研究范文第2篇

[关键词]头孢呋辛酯片；微生物限度检查；

中图分类号：TD856 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）10-0323-01

一.验证材料：

1.供试品：头孢呋辛酯片（0.25g）（批号为：B20110501、B20110502、 B20110503）

2.培养基及试液：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、乳糖胆盐培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

3.菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、 黑曲霉

4.仪器：电热恒温水浴锅、电动离心沉淀机、电动匀浆仪；

二.验证步骤：

1菌液的制备：将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的新鲜培养物及黑曲霉孢子悬液用10倍稀释法，分别制成菌数约为50-100cfu/ml的菌悬液，混匀备用。

2供试液制备：取供试品10g置匀浆杯中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用电动匀浆仪将供试品打碎，混匀，制成1：10的供试液。

3细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

3.1试验组：

3.1.1取1：10的供试液10ml，置无菌条件离心（500转/分）3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至原量，混匀后取 1ml加至300ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，然后按照中国药典2010版附录微生物限度检查法中的薄膜过滤法进行过滤，并用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每膜300 ml，并在最后100 ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml，冲洗后取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂培养基平板上，置规定条件下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。

3.1.2霉菌、酵母菌计数：采用常规平皿法。取1：10的供试液1ml加至平皿中，并加入试验菌液1ml，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。

3.2菌液组：取稀释好的各菌液1ml，分别加入平皿中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，测定所加的试验菌数。每株试验菌制备二个平皿。

3.3供试品对照组：不加菌液，其他同实验组方法，测定供试品本底菌数，每株试验菌平行制备2个平皿。

3.4稀释剂对照组：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，其他同实验组方法，每株试验菌平行制备2个平皿。

3.5培养：细菌计数平板30-35℃培养3天；霉菌、酵母菌计数平板23-28℃培养5天，逐日点计菌数。

3.6判断标准：稀释剂对照组及试验组的菌回收率应均不低于70%。

3.7验证结果：见表1。

4 控制菌检查方法的验证：

4.1 试验组：取1：10的供试液10ml，置无菌条件离心（500转/分）3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至原量，混匀后转入500ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，然后按照中国药典附录“微生物限度检查法”中薄膜过滤法进行过滤，并用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每膜500 ml，并在最后100 ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml，过滤后取出滤膜，加至100ml胆盐乳糖培养基中，置30～35℃培养18～24小时。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。沿培养管的管壁加数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

4.2 接种EMB平板：以接种环沾取1-2环乳糖胆盐培养液划线于曙红亚甲蓝琼脂平板上，培养18-24小时，平板上呈典型大肠埃希菌44102菌落生长。

4.3 结果判断：试验组应检出试验菌。

4.4 验证结果：见表2。

三、讨论：

以上验证结果表明，头孢呋辛酯片采用上述方法进行微生物限度检查，霉菌数、酵母菌数测定采用常规法，细菌数测定采用低速离心（500转/分・3分钟）联合薄膜过滤法（每膜冲洗300ml），各试验菌的回收率均大于70%，控制菌检查采用低速离心（500转/分・3分钟）联合薄膜过滤法（每膜冲洗500 ml），大肠埃希菌呈典型菌落生长，说明以上方法有效的消除了供试品的抑菌作用，其检验条件对检查无干扰，根据中国药典2010年版的相关规定，此方法用于头孢呋辛酯片的微生物限度检查是可行的 。

微生物方法学研究范文第3篇

[关键词]复方补骨脂颗粒;芍药苷;初步稳定性

[中图分类号]R927 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）05（c）-091-02

复方补骨脂颗粒由补骨脂、赤芍、续断、锁阳、狗脊、黄精等六味药组成，具有温补肝肾，强壮筋骨，活血止痛的功效。用于肾阳虚亏、腰膝酸痛、腰肌劳损及腰椎退行性病变等。复方补骨脂颗粒收载于部颁标准中药成方制剂第四册，标准号为WS3-B-0779-91。为更好地保证该制剂质量，笔者以芍药苷为指标，对其初步稳定性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药

HP-1100高效液相色谱仪（美国惠普）；芍药苷对照品[中国药品生物制品检定所，批号(0736-200219）]，甲醇（色谱纯），二次蒸馏水，复方补骨脂颗粒（自制），其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 芍药苷含量测定方法学考察

1.2.1.1 高效液相色谱条件［1］：色谱柱：Hypersil C18(5 μm,ID4.6 mm×250 mm，大连依利特科学仪器有限公司)；流动相：甲醇-水（23∶73）；流速：1.0 ml/min；柱温30℃；检测波长230 nm。

1.2.1.2 溶液的制备：芍药苷对照品的制备：精密称取减压干燥至恒重的芍药苷对照品适量，用80%甲醇溶解配制的浓度为0.1484 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

样品供试品的制备：取装量差异项下的内容物，混匀、研细，取约0.1 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加入80％甲醇约40 ml，超声处理20 min，加80％甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

芍药苷阴性对照液的制备：取不含白芍的群药，按制备工艺制备阴性对照样品。取阴性对照样品适量，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照液。

1.2.2 系统适应性试验分别取芍药苷对照品溶液、供试品溶液、缺白芍阴性供试品溶液注入液相色谱仪，芍药苷的保留时间（tR）约为11 min。本试验条件下，供试品溶液芍药苷峰与其他成分能达到基线分离，阴性供试品溶液在芍药苷出峰处无干扰。理论塔板数以芍药苷峰计，应不低于5 000。

2 结果

2.1 线性关系

分别精密吸取“芍药苷对照品纯度检查”项下的对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定芍药苷峰面积。以芍药苷峰面积积分值为纵坐标（Y），芍药苷含量为横坐标（X），得回归方程： Y=1354.10734X+0.25894，r=0.99995，芍药苷在 0.07405-0.7405 μg范围内线性关系良好。

2.2 芍药苷对照品纯度检查

精密称取减压干燥至恒重的芍药苷对照品适量，用80%甲醇溶解配制得浓度为0.1484 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。精密吸取该对照品溶液及配制对照品溶液的溶剂各15 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用峰面积归一化计算芍药苷纯度为99.8%。

2.3 精密度试验

精密吸取芍药苷对照品溶液（0.4341 mg/ml），重复进样5次，每次5 μl，测定芍药苷峰面积，其RSD=0.7%。

2.4 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液5 μl，每隔2 h测定芍药苷峰面积。供试品溶液中芍药苷在8 h内稳定性良好。

2.5 重现性试验

精密称取胶囊内容物0.1 g，按供试品溶液的制备方法平行制备5份供试品溶液，同等色谱条件测定芍药苷峰面积，平均含量37.76 mg/g，RSD=1.1%。

2.6 加样回收率试验［2］

取已测定含量的胶囊内容物（平均含量37.76 mg/g），取约0.05 g，精密称定，分别加入芍药苷对照品适量，按供试品溶液的制备方法制备5份供试液，分别进样，测定芍药苷峰面积，计算为芍药苷的平均回收率为100.7%，RSD=2.1%。

2.7 样品测定

按供试品溶液的制备方法分别制备供试液，同法测定，外标法计算芍药苷含量，测定出复方补骨脂颗粒中芍药苷的含量为16.87 mg/g。

2.8 初步稳定性试验

2.8.1 样品包装及考察环境复方补骨脂颗粒样品以临床试验用包装（在包装材料质地与结构上相当于上市药品的包装），温度（37℃）放置，连续考察3个月。

2.8.2 初步稳定性试验项目及方法依据[性状]、[鉴别]、[检查]、[含量测定]，按本品临床试验用药品的质量标准草案进行检查。

2.8.3 初步稳定性试验及结果性状稳定，鉴别均为阳性，微生物限度合格，水分、崩解时限、芍药苷含量见表1。2.8.4 结论本品临床试验用药品质量稳定，直接与药物接触的包装材料对药品稳定性无影响。

3 讨论

该制剂的芍药苷含量测定方法可靠，线性关系良好，精密度高，稳定性好，适用于该制剂的质量控制。本实验采用留样观察法预测有效期，结果较准确，为质量控制和临床用药提供了参考依据。

[参考文献]

[1]赵永德，丁昌成，贾善学.RP-HPLC法测定胃肠舒片中芍药苷的含量[J].中国药师，2005，8(12)：1007-1008.

[2]谢秀琼.中药新制剂开发与应用[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2003.315-316.

微生物方法学研究范文第4篇

关键词：耳鼻喉科；慢性细菌；细菌生物膜；感染

生物膜是指附着在有生命或者无生命物体表面的一种被细菌自身形成的多聚基质包裹的菌细胞结构群体，临床研究表明80%以上的人类感染性疾病均是生物膜介导的[1]。近年来，随着相关学科研究的不断深入，学界对细菌生物膜的研究也越来越深入，慢性细菌感染和细菌生物膜之间的密切关系也日益受到人们的重视。

1鼻窦炎与细菌生物膜

徐瑞龙等人以90例实验组患者为研究对象，在其中64例发现了细菌生物膜的存在（阳性率71.1%），而检出率最高的细菌为表皮葡萄球菌，共占据41.7%（25/60），计算得出细菌培养与细菌生物膜间二者之间的Pearson相关系数为0.901，认为慢性鼻-鼻窦炎鼻黏膜中的细菌生物膜表达和细菌培养阳性之间表现为高度相关[2]。康晶细菌等人的研究表明，生物膜阳性和细菌生物膜阴性的临床慢性鼻-鼻窦患者，无论是在症状VAS评分，还是在鼻窦CT评分方面均差异显著（P

2慢性扁桃体炎与细菌生物膜

现阶段，学界已经发现在人扁桃体组织存在细菌生物膜。张琳等人的研究表明，根据电镜显示，就生物膜的存在方面来看，20例反复性扁桃体炎患者和20例健康人相比更普遍，与此同时生物膜在反复性扁桃体炎组的等级方面也要远远超出健康人，据此指出生物膜是导致反复性扁桃体炎的重要起始因素[7]。生物膜的形成和慢性扁桃体炎存在密切联系，其参与到了疾病的机制中，并且和机体免疫之间相互作用。

3中耳炎与细菌生物膜

杨名保等人的研究表明，在复发性或顽固性中耳炎患者中的耳积液中广泛分布着细菌生物膜，可能和中耳炎反复发作或者迁延不愈存在密切关系，并认为鲎试验及免疫荧光二重染色联合CLSM方法是当前有效的检测细菌内毒素的重要手段[8]。铜绿假单胞菌是慢性渗出性中耳炎的最常见病因之一并可形成生物膜。侯炜使用大鼠模型研究，发现铜绿假单胞菌在导致大鼠中耳黏膜形成细菌生物膜后，有效的治疗方法是鼓室内加用环丙沙星以及克拉霉素，联系治疗8d后即可起到明显的清楚细菌生物膜的作用[9]。林丽华等人的研究表明，大蒜素对于铜绿假单胞菌生物膜形成也具有重要作用[10]。等人则建议使用苦参提取物联合头孢他啶，结果证实可以对铜绿假单胞菌生物被膜起到很好的清除作用[11]。

4植入材料感染与细菌生物膜

随着人工合成生物材料当前在外科领域的广泛应用和普及，由此而导致的持续性感染也日益增多，因而这些生物医疗植入材料造成的感染，也就越来越受到人们的关注。陈希杭通过对新西兰兔体内生物膜的形态研究表明，扫描电镜能够发现在植入人工耳蜗植入术后感染后可在新西兰兔植入体周围发现S.E.生物膜的结构，并指出通过3%过氧化氢溶液以及碘伏等，能够起到清除并抑制细菌生物膜形成的作用[12]。陈军以128例共实施过692次失败的发音假体植入术患者为研究对象，认为发音假体与生物膜之间存在密切关系[13]。这和曹隆和等人的研究相一致[14]。其他和耳鼻咽喉科有关的医疗器械典型的如气管内插管及鼓室置管均为生物膜形成的良好环境。

综上所述，大量研究已经表明耳鼻咽喉感染性疾病中存在大量的细菌生物膜，并寻找出了治疗细菌生物膜相关感染的措施[15]。在今后还需要不断强化对细菌生物膜致病机制以及信号传递系统等内容的研究力度，以便寻找根除细菌生物膜导致的慢性感染和植入装置相关性感染的有效治疗方法。

参考文献：

[1]程向荣，王秋萍.细菌生物膜：治疗慢性鼻-鼻窦炎的新靶点[J]医学研究生学报，2008，21（2）：182-185.

[2]徐瑞龙，应华永，诸葛盼等.华慢性鼻-鼻窦炎患者细菌生物膜形成与细菌培养的相关性研究[J]浙江检验医学.2010，31（15）：97-99.

[3]康晶，杨秀英，刘万忠.细菌生物膜与慢性鼻-鼻窦炎的临床研究[J]宁夏医学杂志2012，16（15）：159-161.

[4]陈森泉，窦宇红，梁彩建.鼻内镜手术合并大环内酯类抗生素治疗鼻窦炎43例[J]现代生物医学进展.2011，02（28）；134-136.

[5]中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会，RhinologySGo.慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南（2008年，南昌）[J]中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2009，44（1）：6-7.

[6]邓晓慧，郑风劲，陈苏婉，等.阿奇霉素与环丙沙星合用对金黄色葡萄球菌生物膜的影响[J].四川解剖学杂志，2008，16（3）：15-17.

[7]张琳，罗蓉，孔维佳.扁桃体炎反复发作患者和正常患者扁桃体生物膜的比较[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志.2013，23（05）：123-125.

[8]杨名保，武勇进，郑加创等.复发性中耳炎中耳渗液细菌生物膜的观察及方法学研究[J].中华临床医师杂志（电子版）.2012，36（15）：103-105.

[9]侯炜，李晓，肖红.俊慢性化脓性中耳炎大鼠中耳黏膜的细菌生物膜形成特点及意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志.20120，19（05）：77-79.

[10]林丽华，余加林，刘官信.大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及结构定量化分析[J].中国微生态学杂志，2012，24（1）：22-26.

[11]，邓晨晖，张文，等.苦参提取物与头孢他啶联用对铜绿假单胞菌生物被膜清除作用影响的体外研究[J].新中医，2008，40（12）：98.

[12]陈希杭，陈曦，张榕.人工耳蜗植入术后感染的因素及其生物学特点研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志.2012，36（20）：152-154.

[13]陈军.发音假体植入术次数与假体生物膜上微生物成分的相关性[J]国外医学.耳鼻咽喉科学分册，2003，18（30）：96-98.

微生物方法学研究范文第5篇

[关键词] 氟康唑;高效液相色谱;药代动力学

[中图分类号] R92[文献标识码]C [文章编号]1673-7210(2009)08(b)-037-03

Determination of the concentration of fluconazol in healthy volunteer human plasma by RP-HPLC and applied in clinical pharmacokinetics

YE Chixia, FANG Jing, ZHOU Xueqin

(Department of Pharmacy, Shenzhen Hospital of Peking University, Shenzhen 518036,China)

[Abstract] Objective: To establish a method for determining the concentration of fluconazol in human plasma. Methods: The Phenomenex C18 column(4.6 mm×250 mm, 4 mm) was used. The mobile phase was consisted of water, acetonitrile and glacial acetic acid (25∶75∶0.2), the flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was set at 261 nm. Results: The linear ranges of fluconazol was 0.125-8.000 μg/ml, The intra and inter day precision over the entire concentration range were less than 15%. The average recoveries were 100.0%, 98.8% and 86.7% respectively according to the low, middle, high concentrations(0.25 μg/ml, 1 μg/ml, 4 μg/ml). Conclusion: The method is fast, reliable, accurate and can be used for mass hematoid treatment in clinical pharmacokinetics.

[Key words] Fluconazol; High performance liquid chromatography (HPLC); Pharmacokinetics

氟康唑(fluconazol)为三唑类广谱抗真菌药,通过高度选择性抑制真菌羊毛甾醇14α-脱甲基酶及真菌细胞内细胞色素P450的羟化反应,从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成,破坏真菌细胞壁的完整性,抑制真菌的生长繁殖。同时还能抑制细胞色素氧化酶与过氧化物酶,使真菌细胞内过氧化物大量积聚造成真菌死亡。其口服吸收快、体内分布广、半衰期长、耐受性好、副作用小,临床广泛用于各种深部真菌感染性疾病及浅表、黏膜真菌感染的治疗。本文通过建立高效液相色谱法来测定人血浆中氟康唑血药浓度,并用于健康人体药代动力学的研究,以为临床血药浓度的监控及合理调整给药剂量提供依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器

LC-10ATvp高效液相色谱仪,SPD-10Avp紫外检测器,LC-10ATvp输液泵,均为日本岛津公司生产;N2000色谱数据工作台软件(浙江大学智达信息工程有限公司);AT-130柱温箱(AUTO SCIENCE公司);TDZ5多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);BT25S电子天平(Sartorius公司)。

1.2 试药

氟康唑片(规格:50 mg,批号:050917,石家庄四药有限公司);氟康唑对照品(批号:10314-0101,中国药品生物制品检定所);内标(单硝酸异山梨酯,批号:050820,天津市隆佰生物工程科技有限公司,含量>99%);乙腈(色谱纯,TEDIA公司);冰醋酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);二氯甲烷(分析纯,广东汕头西陇化工厂);重蒸水(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,4μm);柱温:35℃;流动相:乙腈-水-冰醋酸(25∶75∶0.2),流速1.0 ml/min;进样量:20 μl;灵敏度:0.001 5 AUFS;检测波长:261 nm。

2.2 血浆样品的处理

精密量取血浆500 μl置1.5 ml离心管中,再加入内标溶液(单硝酸异山梨酯,0.32 mg/ml)20 μl,涡旋30 s,精密加入二氯甲烷5 ml,涡旋3 min,离心(3 000 r/min,15 min),取有机相4 ml,氮气吹干,80 μl流动相复溶,离心(14 000 r/min,10 min),进样20 μl。

在上述色谱条件下,空白人血浆、氟康唑+内标+血浆、受试者服药后1 h的血样色谱图,见图1。

图1 氟康唑血浆样品色谱图

(A.空白血浆;B.空白血浆+氟康唑+单硝酸异山梨酯;C.受试者口服氟康唑1 h后的血浆样品;1.内标(单硝酸异山梨酯);2.氟康唑)

Fig.1 Typical chromatograms of fluconazol in human plasma

(A: blank plasma; B: plasma spiked with fluconazol and isosorbide mononi-trate (IS); C: plasma obtained from a volunteer; 1: isosorbide mononitrate;

2: fluco-nazol)

由图1可知,血浆中杂质不干扰氟康唑和内标的测定。氟康唑保留时间约为8.7 min;内标单硝酸异山梨酯的保留时间约为6.3 min。

2.3 标准曲线的制备

精密吸取适量的氟康唑标准溶液加入500 μl空白血浆配成药物浓度分别为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml的氟康唑血浆样品。按“2.2”项下操作,以待测物浓度为横坐标,对应的峰面积(As)与内标峰面积(Ai)的比值(As/Ai)为纵坐标(Y),用加权(权重系数:W=1/X2)进行线性回归。结果,连续测定5 d得到其平均线性回归方程为:Y=0.512 1X+0.006 0(n=5,r=0.999 4),最低定量浓度为0.125 μg/ml(S/N>3,n=5)。

2.4 精密度实验

取适量氟康唑标准溶液,加入500 μl空白血浆配制成含待测物氟康唑浓度分别为0.25 μg/ml、1 μg/ml和4 μg/ml的血浆样品,按“2.2”项下自“加入内标溶液”起操作,每一浓度进行三样本分析,连续测定3 d,根据当日的标准曲线,计算样品的浓度。计算日内和日间的相对标准差(RSD)。3天内,低、中、高3个浓度的日内和日间精密度均小于15%,见表1。

2.5 稳定性实验

用氟康唑标准溶液配制含药浓度为0.25 μg/ml、1 μg/ml和4 μg/ml的血浆样品,每个浓度各4份,2份按“2.2”项下操作,考察血样处理后室温放置0、24 h的稳定性;1份于-20℃冰箱冷冻保存,反复冻融3次后取出处理,考察血浆样品在反复冻融条件下的稳定性;1份于-80℃冰箱冷冻保存15 d后处理,考察血浆样品在长期冷冻条件下的稳定性。每一浓度进行三样本分析,结果显示,氟康唑血样在考察的条件下均较稳定(RSD均小于15%)。

2.6 回收率实验

按“2.4”项下,配制低、中、高3个浓度(0.25 μg/ml、1 μg/ml和4 μg/ml)的血浆样品各3份,按“2.2”项下操作,得相应峰面积比值As(H)/Ai(H);另取低、中、高不同浓度的氟康唑标准溶液,用流动相稀释成相同浓度的氟康唑对照品溶液各3份,进样分析,获得相应峰面积比值As(D)/Ai(D)。按提取回收率=[As(H)/Ai(H)]/[As(D)/Ai(D)]×100%计算,低、中、高3个浓度的平均提取回收率为分别为100.0%、98.8%、86.7%。

2.7 方法应用

选择20名体检合格的健康男性志愿者,单剂量口服氟康唑片150 mg,分别于给药前(0 h)和给药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120.0 h从志愿者肘静脉取血3 ml置肝素试管中,离心(4 000 r/min,15 min),取血浆1 ml,-80℃冰箱储存,用于血药浓度检测。服药后2 h可适量饮水,4 h统一进清淡饮食。受试者在服药后避免剧烈活动,亦不得长时间卧床。20名受试者血药浓度-时间曲线,见图2。

图 2 20名受试者服用氟康唑片150 mg后的药-时曲线

Fig..2 Plasma concentration-time relationships of fluconazole after adm-inistration fluconazole tablets of a single dose 150 mg in 20 volunteers

3 讨论

氟康唑血药浓度检测方法文献提到采用微生物法、气相色谱法[1],微生物法是利用药效学特征测定药物浓度,虽然便捷、经济,但有一定的局限性,如线性范围窄(需要较多的时间点测定方能确定有效的线性范围)和无法进行良好的全程质控等[2],现已不主张使用。气相色谱法由于仪器维护、使用较为复杂,在临床药学方面使用频率亦不高。目前氟康唑体内的药物浓度测定也有使用高效液相-质谱联用法(LC/MS)[3]法的,虽定量准确、灵敏、用时少,但仪器、维护费用较昂贵;高效液相色谱法[4-5]以其灵敏、高效、普及得到广泛使用,本文在已有文献的基础上,建立RP-HPLC内标法测定健康受试者血浆中氟康唑浓度的方法,血浆中内源性物质不干扰样品的测定,标准曲线线性范围为0.125～8.000 μg/ml,定量下限为0.125 μg/ml(S/N>3),低、中、高3个浓度的平均提取回收率为分别为100.0%、98.8%、86.7%;日内和日间RSD均小于15%,每个样品的进样时间约为9.0 min。该方法符合生物样品分析要求[6-7],且灵敏、操作快速、简单、准确,适用于临床药代动力学研究中大批量生物样品的分析,并可用于临床血药浓度的监测,以便制订合理化给药方案及用于同种药物不同厂家、不同剂型的质量评定。

文献多采用以磷酸盐为流动相的水相、甲醇或乙腈作为洗脱系统,本实验把水相换为冰醋酸水溶液,不用磷酸盐,可减小磷酸盐对色谱柱的损害及降低使用后色谱柱的维护时间。血样处理文献采用固相萃取技术,费用及技术要求均较高;实际操作中使用较多的是对血样先碱化,然后乙酸乙酯萃取,本文也曾试用该法,效果不理想,而采用二氯甲烷液-液萃取,获得了较好的回收率及出峰位置。检测波长曾按文献[5]设为210 nm,虽可增加信号的响应值,但血样中杂质对氟康唑及内标的干扰较大。在本试验色谱条件下,内标曾选用非那西丁、别嘌醇、美托洛尔等,但均易与氟康唑峰或干扰峰重叠,后将检测波长调整到261 nm,用单硝酸异山梨酯做内标,尽管它们结构不同,保留时间有一定的差别,但无内源性物质的干扰,故选用它作为内标控制实验误差。

[参考文献]

[1]胡霞敏,杨晓燕,胡先敏,等.氟康唑胶囊在健康人体的药代动力学和生物等效性[J].中国临床药理学杂志,2006,22(6):429-431.

[2]邹建晖,李兵,彭向东,等.罗红霉素胶囊的人体生物等效性[J].中国临床药学杂志,2004,13(4):202-204.

[3]林建阳,陈之光,冯婉玉,等.氟康唑在健康人体的药代动力学及生物等效性[J].中国临床药理学杂志,2008,24(4):612-615.

[4]陈萍,彭彦,何秀萍,等.高效液相色谱法测定人血浆氟康唑浓度[J].医药导报,2007,26(2):141-142.

[5]孙文嘉,夏东亚,郭涛.RP-HPLC法测定人血浆中氟康唑的浓度[J].中国药房,2007,18(26):2028-2030.

[6]朱正飞,尚启平,李见春.RP-HPLC法测定人血清中阿莫西林浓度及应用[J].中国医院用药评价与分析,2008,8(10):753-755.