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光阴荏苒,岁月如梭,逝者如斯夫。转眼间,我们从高州一中毕业已是一年半了。这一年七个月间,我们每个人所走的路不尽相同,或春风得意,或平平淡淡,或艰辛坎坷……但是,无论人生如何浮沉,也无论世事如何的变迁,我们都没有忘记那份同学间的真挚友情。一年多的时间,什么都是浮云,我们还是原来的我们,不曾改变。
出于大家的共同愿望,也出于我个人的想法,我决定组织一次高中同学聚会。我们相约于2月4号(农历正月初五,有可能会变)下午三点在一中校门口相见,不见不散哦!希望大家相互转告,并都能来参加聚会!
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【摘要】 目的:研究高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)同时测定健康人口服加味逍遥散(Modified XiaoYao Decoction, MXYD)后血清中阿魏酸和芍药苷含量及其药动学。方法:水浴法预处理血样,HPLC法同时测定8名健康人在口服加味逍遥散浓缩汤剂后8个时间点各个血清样本中芍药苷与阿魏酸的血药浓度。应用3P97药动学分析软件对血药浓度时间数据进行拟合。选用香豆精为内标,芍药苷和阿魏酸检测波长分别为:0~10 min为230 nm和10~25 min为320 nm。结果:8名健康志愿者口服MXYD浓缩汤剂后,在血清中检测到芍药苷和阿魏酸。两种化合物分离完全,未出现其他物质干扰峰,保留时间(retention time, Tr)分别为8.02 min和13.32 min,内标香豆素为19.14 min。芍药苷和阿魏酸的平均回收率分别为100.9 %和95.3%,平均相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为3.4%和3.2%。用空白血清加标准品绘制标准曲线,芍药苷线性范围为40~1 280 ng/ml,信噪比为3时最低检测线为5 ng/ml,最低检测浓度为15 ng/ml(RSD=12.5%);阿魏酸线性范围为10~320 ng/ml,最低检测线为0.65 ng/ml,最低检测浓度5 ng/ml(RSD=9.7 %)。成分日间与日内精密度及准确度在92.1%~109.9%,且RSD
【关键词】 加味逍遥散; 芍药苷; 阿魏酸; 高效液相色谱; 药动学
Objective: To simultaneously determine the contents and explore the pharmacokinetics of ferulic acid and paeoniflorin by high performance liquid chromatography (HPLC) after oral administration of Modified Xiaoyao Decoction (MXYD), a compound of traditional Chinese herbal medicine.
Methods: A total of 8 healthy men were enlisted in this study. The serum samples were preprocessed by immersion method. The HPLC system was used to determine the contents of ferulic acid and paeoniflorin in the blood samples of the 8 healthy volunteers, and the blood was collected through the ulnar vein at 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h and 3 h after MXYD administration. The dates of serum concentrationtime were fitted by using the 3P97 analytical program of pharmacokinetics. The internal standard (IS) was coumarin. The detection wavelengths of paeoniflorin and ferulic acid were 230 nm from 0 min to 10 min and 320 nm from 10 min to 25 min respectively.
Results: After MXYD administration, paeoniflorin and ferulic acid were separated completely in the serum and no other interfering peaks were found in the spectrum of the chromatograms. The retention times of the paeoniflorin and ferulic acid were 8.02 min and 13.32 min respectively, and that of the coumarin was 19.14 min. The mean recovery rates of paeoniflorin and ferulic acid were 100.9% and 95.3% with relative standard deviation (RSD) of 3.2% and 3.4%, respectively. The calibration curve for paeoniflorin was linear over the concentration range 401 280 ng/ml. Its lowdetection limit based on a signaltonoise ratio of 3 was 5 ng/ml and lowconcentration limit was 15 ng/ml with an RSD of 12.5%. Ferulic acid was in the range 10320 ng/ml; its lowdetection limit was 0.65 ng/ml and lowconcentration limit was 5 ng/ml with an RSD of 9.7%. The method was found to be highly precise, with an RSD
Conclusion: This is a study on simultaneously determining paeoniflorin and ferulic acid in serum of healthy volunteers after oral administration of MXYD. The assay is suitable for identifying the serum levels of ferulic acid and paeoniflorin in clinical investigations.
Keywords: Jiawei Xiaoyao Powders; paeoniflorin; ferulic acid; high performance liquid chromatography; pharmacokinetics
自拟加味逍遥散(Modified Xiaoyao Decoction, MXYD)由《太平惠民和剂局方》中的逍遥散加减而成,适用于治疗抑郁[1]和脾气虚型、肝郁脾虚型功能性消化不良[2]。阿魏酸和芍药苷分别来自当归和白芍,是该方的两个主要成分。杨玉兴等[3]应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)对人服用加味逍遥散后血清中的阿魏酸进行了定性和定量研究;Yang等[4]对狗服用精制后芍药苷的药动学进行了研究;罗焕敏等[5]对大鼠服用当归芍药散后体内芍药苷与阿魏酸同时进行测定,并进行药动学研究。人口服后这两成分的同时检测及药动学研究未见报道。因此,我们利用HPLC对健康人口服加味逍遥散后血清中的芍药苷与阿魏酸进行测定,以便指导加味逍遥散在临床中的应用。
1 材料与方法
1.1 主要仪器 Waters HPLC,包括2996二极管阵列检测器、2695自动进样系统和EmpowerTM 数据处理软件(美国Waters公司);小神医煎药机(天津三延精密机械有限公司);3P97药动学分析软件(中国药理学会数学药理专业委员会)。
1.2 药品与试剂 自拟加味逍遥散由当归25 g、白芍药25 g、柴胡25 g、茯苓25 g、白术15 g、生姜10 g、大枣15 g、薄荷15 g、栀子15 g、甘草15 g、牡丹皮15 g、厚朴30 g、枳壳30 g和葛根40 g组成。药材购自四川大学华西医院门诊中药房,均经华西医院中药药理实验室鉴定为正品。加味逍遥散汤剂制备:按照处方比例精确称取各组成药物,总量2.7 kg,放入小神医煎药机中,添加8倍水,浸泡约30 min后煎煮,煮沸后继续煎煮30 min,然后用4层纱布过滤;按上述方法重复煎煮1次。两次煎出滤液合并,32 ℃减压浓缩,使其终浓度为1 g/ml。冷却后置于消毒容器中,密封保存于4 ℃冰箱内备用,用时摇匀,温服。阿魏酸(批号为1107739910)、芍药苷(批号为110736200423)和香豆素(批号为911216)标准品均购自中国药品生物制品检定所。
1.3 健康志愿者入选标准 健康男性8名,来源于招募者。纳入标准:体格检查正常;年龄19~40岁;体质量正常(在标准体质量±10%之内);获取知情同意,志愿受试。排除标准:有药物及食物过敏史者;1个月内服用过药物者;有晕血、晕针史;精神病患者;嗜烟、嗜酒者;既往有心、肝、肾、胃肠及造血功能障碍等严重疾病者;依从性差者。剔除标准:实验后发现有违背实验方案或使用过影响药物测定的药物和食物,可能干扰实验结果者。终止实验标准:从医学角度考虑受试者有必要中止实验者,如实验过程中发生晕针、晕血,服药后有不适感或过敏反应等。
本研究已获得伦理委员会批准,自愿受试、体检合格者入选。入选者于实验前签署知情同意书。
1.4 实验方法
1.4.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS3(5 μm,4.6 mm×250 mm),流动相为甲醇︰0.5%乙酸水溶液(40︰60,v/v),选用香豆精为内标(internal standard, IS);芍药苷的检测波长在0~10 min为230 nm;阿魏酸的检测波长在10~25 min为320 nm。
1.4.2 标准品溶液配制 阿魏酸1 mg置于容量瓶内,加入50 ml甲醇摇匀;芍药苷1 mg,甲醇定容至50 ml;取香豆素2 mg,甲醇定容至100 ml。3种溶液最终浓度均为20 mg/L。
1.4.3 给药与采血 志愿者于实验前3 d不得饮用啤酒、茶、咖啡及其他饮料;实验前8 h不准进水和食物。实验当天测定其空腹体质量及心率、脉搏、血压;每位志愿者在服用浓缩中药汤剂前抽取静脉血,作为空白对照。取血后按5 g/kg口服一次中药浓缩汤剂。服药后计时,于服药后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h和3 h于肘静脉抽血5 ml;随时记录受试者出现的各种反应,遇特殊情况积极处理;口服中药前与服药后各时间点血标本于3 000 r/min离心10 min,获得空白与含药血清,分装于1.5 ml EP管中,-20 ℃保存。
1.4.4 血清样品的预处理 所有血清(包括空白血清、含药血清及空白加入标准品的血清)均采用水浴法预处理。取1 ml血清放入10 ml试管中,在100 ℃沸水中10 min,搅拌60 s直至均匀,于8 500 r/min离心15 min,取100 μl上清进样。
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1.4.5 制作标准曲线及测定最低检测限 取6份1 ml空白血清,分别放入10 ml试管中,加入不同体积的芍药苷和阿魏酸标准品溶液,使芍药苷和阿魏酸在血清中的浓度分别为40、80、160、320、640、1 280 ng/ml和10、20、40、80、160、320 ng/ml。每管分别加入香豆素标准品溶液25 μl,充分混匀后采用上述水浴法预处理,HPLC测定。分别以芍药苷、阿魏酸和内标香豆素的峰面积比与其浓度作线性回归,得到回归方程;当信噪比(signaltonoise, S/N)为3时确定芍药苷与阿魏酸的最低检测限。
1.4.6 精密度与回收率的测定 取3份1 ml空白血清,分别放入10 ml试管中,加入不同体积的芍药苷和阿魏酸标准品溶液,使两者在血清中的浓度分别为40、160、640 ng/ml和10、40、160 ng/ml 3个梯度。每管分别加入香豆素标准品溶液25 μl,充分混匀后按上述血清预处理方法处理后进样100 μl检测。重复上述实验过程,5次/d,使用相同的样品与方法连续测定5 d。以加入血清中芍药苷和阿魏酸的量为标准值,实际测得的峰面积比值代入回归方程计算出计算值,计算值与标准值相比求得回收率和日内精密度,并计算出相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)。计算公式分别为:回收率=(计算值/标准值)×100%;精密度=(计算值的平均值/加入标准浓度)×100%;RSD=(标准差/平均值)×100%。
1.4.7 样本血药浓度的测定 对8名志愿者服药后各个时间点的含药血清进行预处理,以本实验色谱条件进样,得到芍药苷、阿魏酸峰面积与香豆素峰面积的比值,将比值代入回归方程,分别得到芍药苷和阿魏酸的血药浓度,并绘制血清药物浓度与时间曲线。
1.4.8 药代动力学参数的测定 采用中国药理学会数学药理专业委员会编制的3P97药动学分析软件对测得血药浓度数值进行拟合得到一系列药动学参数:最大出峰时间(time of maximum concentration, Tmax),最大血药浓度(maximum concentration, Cmax)、分布相半衰期(t1/2α)、表观清除率(apparent clearance, CL/F)和血药浓度时间曲线下面积(area under concentrationtime curve, AUC)等。
2 结 果
2.1 芍药苷、阿魏酸与内标香豆素的分离情况 芍药苷、阿魏酸峰与内标峰,血清内源性物质及加味逍遥散吸收入血的其他成分峰均能很好地实现基线分离,无杂峰干扰;芍药苷、阿魏酸和香豆素标准品在相同条件下进行对照,保留时间分别为8.02、13.32和19.14 min;对其紫外吸收峰予以定性分析,样品的最大紫外扫描波长与标准品一致。见图1和图2。
2.2 标准曲线及最低检测限 空白血清加入芍药苷标准品后,在40~1 280 ng/ml浓度范围内的线性回归方程为y=59.5x+5.48(x代表峰面积比值,y代表血药浓度)(r2=0.999 1)。S/N为3时最低检测限为5 ng/ml,最低检测浓度为15 ng/ml(RSD=12.5%)。空白血清加入阿魏酸标准品后,在10~320 ng/ml浓度范围内的回归方程为y=161.3x-7.82(r2 =0.992 3),最低检测限为0.65 ng/ml,最低检测浓度为5 ng/ml(RSD=9.7%)。
2.3 回收率与精密度 健康人空白血清加入芍药苷和阿魏酸标准品后的平均回收率分别为100.9%和95.3%,平均RSD分别为3.4%和3.2%。见表1。该方法检测芍药苷和阿魏酸日间、日内精密度在92.1%~109.9%,且RSD
2.4 血药浓度测定 将健康人服药后各个时间点血清中测得的芍药苷和阿魏酸峰面积与内标峰面积相比,所得比值分别代入两者的回归方程,计算出血清中芍药苷和阿魏酸的浓度并绘制血清药物浓度时间曲线。见图3。
2.5 药动学参数的测定 本实验成功地在服药后健康人的血清中检测到了芍药苷和阿魏酸,并建立了同时检测芍药苷与阿魏酸的高效液相色谱法,使用药动学软件得到药动学参数(表4)。药动学参数显示人口服MXTD后芍药苷和阿魏酸被吸收入体内,两者的最大浓度时间大约在服药后45 min左右,然后逐渐下降。表4 芍药苷与阿魏酸在血清中的药动学参数
3 讨 论
汤药进入体内后,血清成分多样,欲确定方剂体内血清成分谱,必须建立汤药进入体内多成分测定方法。本实验完成了健康人口服大复方MXYD浓缩剂后芍药苷与阿魏酸在血中的测定研究,利用HPLC法对芍药苷与阿魏酸同时测定,为其他药效成分的测定方法和药动学研究打下了一定基础,对临床治疗功能性消化不良的中药复方的质量、用量等监测有一定意义。
MXYD治疗功能性消化不良疗效确切。由于是大复方,其中所含化学成分可达几百种,但进入人体的成分才可能是药效成分,所以研究服药后进入人体的成分才能更好地了解加味逍遥散的药理作用。对于MXYD的药动学研究已有开展,但报道多数是单味中药[3]或者动物实验[6]。中药药动学研究最终要回归于对人体的实验。故本实验以“复方效应成分动力学”假说和“生物方剂分析中医药学”思路为理论指导基础,应用HPLC法分析了人口服加味逍遥散后吸收入体内成分芍药苷与阿魏酸的药动学。
本实验建立的检测方法显示了较好的线性关系,具有较好的精密度和准确度。有报道使用内标法根据回归方程计算得到两者的血药浓度,通过对大鼠血清中阿魏酸与芍药苷的药动学研究,结果显示两者最大血药浓度出现时间在2 h和3 h,半衰期1~2 h[5],明显大于本实验结果。这说明不同实验对象对药物的吸收与体内反应是不同的。本实验方法适用于人口服加味逍遥散浓缩煎剂后芍药苷与阿魏酸血药浓度的测定,为进一步研究加味逍遥散中代表疗效的靶成分以及临床用药量化依据打下了基础。
【参考文献】
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余国汉, 梁绍财, 孙祺章, 等. 加味逍遥汤合并氯米帕明治疗抑郁症的对照研究. 中国中西医结合杂志. 2007; 27(4): 318320.
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杨玉兴, 黄熙, 任平, 等. 肝郁脾虚证患者口服加味逍遥散后阿魏酸的血药浓度HPLC测定法. 南京中医药大学学报. 2003; 19(2): 8688.
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罗焕敏, 李晓光, 肖飞. 当归芍药散中阿魏酸和芍药苷的药代动力学研究. 中药材. 2003; 26(3): 189192.
seropharmacological effect of tujian mixture on phospho-akt and pten of glomerular mesangial cell cultured in high concentrations of glucose yin de-hai1, liang xiao-chun1, zhang hong2, et al (1.peking union medical college hospital, beijing 100730, china;2.institute of basic medical science, chinese academy of medical sciences, beijing 100730, china)
abstract:objective to observe the effects of serum containing the medicine of tujian mixture on phospho-akt and phospho-pten of glomerular mesangial cell (mc) cultured in high concentrations of glucose. method the glomerular mesangial cells from sd rat were divided into six groups:the normal control group, the group of mc cultured in high concentrations of glucose, and four other groups cultured in high concentrations of glucose + different concentrations of rat’s serum containing tujian mixture. after 72 hours, the content level of phospho-akt (thr308) and phospho-pten (ser380) in mc was detected by using sandwich elisa. results the level of phospho-akt (thr308) in the group of mc cultured in high concentrations of glucose was significant higher than that in the normal control group (p<0.01). the level of phospho-akt (thr308) in the groups with serum containing tujian mixture was significant lower than that in the group of mc cultured in high concentrations of glucose (p<0.01). the effects indicated a remarkable change with different dosage of tujian mixture. furthermore, the level of phosphated pten (ser380) in the group of mc cultured in high concentrations of glucose was significant lower than that in the normal control group (p<0.01). the level of phosphated pten in the groups with serum containing tujian mixture was significant higher than that in the group of mc cultured in high concentrations of glucose (p<0.01). the effects also indicated a relationship with the dosage of tujian mixture. conclusion chinese herbal medicine tujian mixture can increase the level of phosphated pten and inhibit activation of akt in cultured mc in high concentrations of glucose.
key words:tujian mixture;glomerular mesangial cell;diabetic nephropathy;pi3k-akt signaling pathyway;pten
糖尿病肾病最为关键的病理改变是肾小球细胞外基质(ecm)的逐渐堆积,最终导致肾小球的硬化。wWw.133229.COm肾小球系膜细胞(mc)发生表型转化,由静止表型转化为增殖/分泌表型,细胞肥大,大量分泌ecm,同时基质蛋白的降解减少是造成肾小球ecm堆积的原因。我们既往的研究发现,中药菟箭合剂可以减少糖尿病大鼠mc的表型转化,减轻肾小球系膜区ecm的堆积,显著降低糖尿病大鼠尿蛋白的排泄量[1]。有研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)-akt信号通路异常激活是糖尿病肾病mc细胞肥大、ecm异常分泌重要机制[2],本研究观察了菟箭合剂含药血清对高糖条件培养的mc磷酸化akt和pi3k/akt的抑制物类脂磷酸酶pten影响。
1 材料与方法
1.1 菟箭合剂含药血清的制备
正常sd大鼠,体重250~280 g,购自北京大学医学部实验动物科学部,许可证号:skxk(京)2006-0008。适应性喂养3 d后按每100 g体重2 ml的剂量灌胃菟箭合剂口服液(菟丝子、鬼箭羽和汉防己,三药比例为1∶3∶1,中药饮片购自北京同仁堂药店,水煎制成口服液,每1 ml含原药材1 g),每日灌胃2次,连续3 d,末次灌胃后2 h进行麻醉(12%乌拉坦,每100 g体重1 ml腹膜内注射),颈动脉插管取血,3 000 r/min离心10 min取血清,5 ml分装,-20 ℃保存待用。正常sd大鼠血清的制备除按每100 g体重灌胃自来水2 ml外,其余同含药血清的制备。
1.2 大鼠系膜细胞的培养及分组
sd大鼠(体重100~120 g)按经典方法培养、鉴定大鼠肾小球mc[3]。取第4代细胞用于本实验。从培养瓶中消化mc,制成1×106/ml浓度的细胞悬液,接种于10 cm直径的培养皿中,每个培养皿接种5 ml细胞悬液,加完全rpmi 1640培养液(含20%胎牛血清,l-谷氨酰胺2 mmol/l,青霉素100 u/ml,链霉素100 u/ml,丙酮酸钠2 mmol/l,胰岛素0.6 u/ml,hepes 12.5 mmol/l)至15 ml/皿,置培养箱中(37 ℃、5%co2)孵育,24 h细胞贴壁良好后换不含胎牛血清的培养液静置24 h。将培养液中胎牛血清换为不同条件大鼠血清,分为6组:正常对照组(5 mmol/l葡萄糖,20%正常大鼠血清),高糖组(30 mmol/l葡萄糖,20%正常大鼠血清),高糖+1倍含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%含药大鼠血清),高糖+4倍稀释含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%用4倍正常大鼠血清稀释的含药大鼠血清),高糖+8倍稀释含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%用8倍正常大鼠血清稀释的含药大鼠血清),高糖+16倍稀释含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%用16倍正常大鼠血清稀释的含药大鼠血清)。
1.3 系膜细胞磷酸化akt和pten的检测
使用cell signaling公司的磷酸化akt(thr308)和磷酸化pten(ser380)双夹心elisa试剂盒检测。按其操作说明书进行:加入不同处理因素培养液培养大鼠mc 72 h后,弃培养液,4 ℃下pbs冲洗细胞,每一培养皿(10 cm直径)加0.5 ml细胞溶解液,刮下细胞,移至试管中,4 ℃微量离心取上清液即是细胞溶解液,以一次使用的样品量储存于-80 ℃待用。检测时用样品稀释液稀释细胞溶解液至适合的倍数,根据预实验结果最终样品稀释倍数磷酸化akt为1倍稀释液稀释、磷酸化pten为8倍稀释液稀释。加100 μl稀释后的细胞溶液至相应的微孔中,按操作说明书依次完成加一抗、hrp连接二抗、tmb底物、终止液等操作步骤,最后用酶标仪以450 nm波长读取样品吸光值。
1.4 统计学方法
应用spss13.0统计软件进行统计学分析,各组间均数比较采用方差分析。
2 结果
(见表1)表1 各组mc磷酸化akt和磷酸化pten的比较注:与正常对照组比较,p<0.01;与高糖组比较,*p<0.05,**p<0.01
3 讨论
肾小球mc的肥大和ecm合成的增多等细胞表型和功能的改变是糖尿病肾病病理变化的基础[4],导致mc表型和功能改变的机制目前并不完全清楚,可能是多种因素共同作用的结果。pi3k-akt信号通路在调控细胞的增殖、分化、凋亡中起关键作用,pi3k-akt通路由胰岛素和多种细胞因子受体激活,引发在pi3k作用下的第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(pip3)的堆积,进而引发akt在308位苏氨酸和407位丝氨酸的磷酸化,磷酸化akt进而诱发一系列细胞下游事件,促进细胞的存活、增殖与分化,阻断细胞的凋亡。pten是细胞内pi3k/akt信号通路的主要负调节物,通过催化pip3的3位磷酸基团脱磷酸,使pip3形成pip2,降低了pip3水平,从而阻断pi3k/akt信号通路。有研究发现,糖尿病大鼠肾小球内pten表达显著减少、akt活性升高,通过重组pten腺病毒转染肾小球mc使其过度表达pten,可抑制高糖诱导的mc肥大[2],提示糖尿病肾病时mc表型和功能的改变可能与pi3k-akt信号通路的异常(pten表达的降低、akt的异常激活)有关。
pi3k-akt信号通路的调控是一个非常复杂的过程,包括胰岛素受体、受体酪氨酸激酶、整合素受体、多种细胞因子受体、g蛋白耦联受体均与pi3k-akt信号通路的激活有关。糖尿病肾病时存在多种以上受体激活的因素,因而可造成pi3k-akt异常激活,从而可能造成mc的肥大和ecm异常分泌等细胞表型和功能的改变。然而,糖尿病肾病时更为重要的pi3k- akt信号通路的异常改变使pten活性降低,pten活性的降低使pi3k-akt信号通路持续处于激活状态,可能是糖尿病肾病时mc肥大和大量分泌ecm的重要机制,提高pten活性可能是治疗糖尿病肾病的重要靶点。
我们既往的研究发现,中药菟箭合剂可以减少糖尿病大鼠mc的表型转化,减轻肾小球系膜区ecm的堆积[1]。为了进一步研究菟箭合剂的作用机制,我们观察了菟箭合剂对高糖条件培养的mc磷酸化pten和akt的作用。结果表明,高糖条件培养的mc磷酸化pten水平显著降低,而磷酸化akt水平显著升高,菟箭合剂含药血清则可显著升高mc细胞内磷酸化pten水平,同时显著降低磷酸化akt水平。
本实验中我们采用将所有组别大鼠mc培养液中的胎牛血清用大鼠血清替换的方法,药物干预组与对照组之间的差别仅为是否为含药血清和含药血清稀释浓度的差别,从而排除了由于血清种类不同对实验结果的干扰。
【参考文献】
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当前,我国许多单位对于聘用律师的认识还基本停留在有麻烦、打官司找律师,即诉讼律师的层面上。然而事实上,律师在投资、融资、改制、提供见证、认证等方面,也可以起到十分积极、甚至不可替代的作用。此外,聘请律师很重要的一个作用是防患于未然,企业有许多经营活动,如果事先有律师参与,提供相关的法律意见和建议,则完全可以避免事后不必要的诉讼和纷争,从经济效益角度讲,前期花一些律师顾问费,要比出现问题后再聘请律师效益更高。
因为,在各类复杂的法律事务面前,非专业人士处理起来往往力不从心,事倍功半,有时甚至误入歧途。对于法律的漠视与无知更有可能招致无法挽回的败局。当深陷危局之时,才想起律师,殊不知,此时已经冰冻三尺了。这时不管聘请多么高明的律师,都难以在短期内化解危机,付出的代价将可想而知。
聪明的企业决策者可能已经意识到,为成功地避免企业运营过程中可能出现的各类致命性风险,聘请专职执业律师担任常年法律顾问,在做出重大决策之前听取律师的建议,可以成功地避免后患,其睿智程度无异于以极小的代价购买多份兰德公司的报告结论。
因此, 我所愿竭诚为贵商会提供常年法律服务。为了能让贵商会感受到我们的诚意,我们拟定为贵商会提供一次免费的法律服务。服务的形式可以是讲座、培训、法律咨询或是其他形式,具体方案会在于贵商会沟通后及时提出。
若贵商会对我们的这次免费法律服务感到满意,愿意聘请我们做为贵商会法律顾问的话,我们将会为贵商会及会员提供如下服务项目:
一、专业诉讼服务
民事、商事、刑事、行政等诉讼案件,劳动仲裁、普通经济仲裁等仲裁案件。
二、非诉法律服务
法律顾问、法律咨询、各类合同审查、律师函、参与重大项目合同谈判、出具专业法律意见书、法律风险尽职调查等非诉法律服务。
顺颂
商祺!
XXXX律师事务所
20xx年十月二十一日
法律顾问的邀请函范文二尊敬的 黄耀和 律师(老师):
为了提升律师办理企业并购与重组业务的技能,提高企业并购与重组律师服务的品质,我们决定开办一期并购与重组律师专业技能高级研修班。该班拟聘请国内资深并购与重组律师、高校知名并购重组学者、政府主管部门专家以及并购重组纠纷审判专家联袂授课。
鉴于您在业界的学术地位、成就和影响,我们真诚地聘请您为点睛网高级培训师,并邀请您在百忙之中拨冗前来为本班授课。现就本班的有关情况向您报告如下:
一、本班名称
本班名称:并购与重组律师专业技能高级研修班。 二、时间安排
1、20xx年3月26至20xx年 月 日之间,共授课8-10天。 2、授课时间为上午9.00时-12.00时,下午1.30时-4.30时,晚上(如有)6.30时-9.30时。
3、每天面授上课共6个小时,即8节课(45分钟/课)。 三、授课方式
1、本课程开设面授班和远程班,采取面授、网络、光盘等立体覆盖教学模式。即北京学员在现场听课(同时录制网络课件);外地学员在网上听课;不能或不愿上网的学员,通过课件光盘、讲课录音和教材讲义等方式学习。
2、特别敬请各位老师理解本班的立体教学模式,并许可我们在面授的同时以网络视频、光盘课件或讲义教材等方式使用本课程内容进行教学使用,并取得相应回报与收益。
3、如无特殊约定,每位老师每次授课安排半天(即3小时,4节课),每次详细讲授1-2个实务技能专题。
四、听课对象
1、面授班即在现场听课的对象为北京市及周边地区执业在二年以上的律师,计划招收70人。
2、远程班即在网上听课的对象为全国各地的执业在二年以上的律师,每班计划招收学员100人。
五、授课内容
1、详见附件一(课程单元表)。
2、我们建议您的授课方向为《并购与重组律师业务概论》。具体内容请老师确定大纲,填入回执表反馈我们。我们收到您的反馈意见后进行统一协调平衡,最终确定您的讲课内容。
3、重要建议:选题尽量考虑律师业务的实用性、不宜太大,小题大作为好;以案例教学;课后可留15-20分钟互动;尽量每20分钟左右讲完一个章节,以方便网络课件的分集制作。
六、授课时间
我们希望您20xx年 月 日上午(或在此后至20xx年 月 日间的周六或周日,预选一个半天)前来授课,并填写回执告诉我们,或者电话商量具体授课时间。 七、课酬回报
1、课酬:授课老师每小时课酬标准为1000元,讲课半天为3小时计3000元整。如果您认为以上课酬太低,请将您所期待的数额反馈我们再行商定。
2、杂费:授课老师的交通费、住宿费由我们安排报销,中午工作餐或晚餐我们负责招待。
八、确认邀请
授课老师如果同意接受我们的聘请,可以下列方式反馈意见: 1、填写以下回执(见附件),通过email或传真发回我们。 2、直接在电话中确定讲课时间和讲课内容。 邀请函回执
联系方式
联系人:王XX(教务)XXXX
XX(主编)XXXXXXXX
邀请人:XXX
XXXX年XX月XX日
法律顾问的邀请函范文三尊敬的各位同仁:
20xx年是国家xx规划的开局之年,我们盈科律师事务所亦将紧随国家经济发展的宏观布局,调整思路,开拓进取。近几年矿产行业和矿业企业成为了国民经济中的重中之重,越来越稀缺的矿产资源势必掀起更高的投资热潮。而基于矿产能源行业的飞速发展,对专业的矿业法律服务的需求也将随之迅猛增长。
在刚刚过去的 20xx年,盈科律师事务所矿产资源法律事务部已与国内外各矿业投资机构、各矿业协会、tcm矿业总裁班等诸多矿业精英群体进行了充分的沟通并达成共识,同时结合盈科律师的专业优势及人脉资源,一个集矿业投融资和法律服务为一体的全国性矿业服务平台已初具规模。为了更进一步的发展,盈科律师事务所矿产资源法律事务部决定,邀请有意于矿业发展方向的律师同仁加盟本部,共同打造盈科矿业服务体系,以总所矿业部为纽带,在各分所联合设立分所矿业部,组建一支不少于四十人的矿业服务团队,形成一个全国性的矿业投融资平台和专业的矿业法律服务平台。
现将具体内容通知如下:
一、分所矿业部(或专职矿业律师)设立及人员要求。
1、分所矿业部(或专职矿业律师)设立要求:根据分所实际情况可选择设立分所矿业部或专职矿业律师,并设固定联系人一名,专人一对一地与总所矿业部联系。每个分所以个人名义加盟的专职矿业律师原则上不超过2名。
2、人员要求:由于矿业服务的专业性与特殊性,申请加盟盈科矿业
的律师,必须符合下列条件之一:. 分所矿业部负责人或专职矿业律师;【法律顾问邀请函】
. 拥有矿产资源类企业 3年以上工作经历;
. 拥有为矿产资源类企业提供过 3年以上的法律、会计、金融或相关服务的工作经历; . 拥有 10位以上矿产资源行业的客户或者有意投资矿业的投资类客户。
加盟律师须能够承受一定的工作压力,能够完成总所矿业部的工作安排,包括但不限于承担矿业部期刊相关专题的撰稿工作等。
3、具体流程:
(1)加盟律师,须填写申请表(附件1),并请同时附上个人简历(附件2)、相关业绩及近期个人照片,由当地分所主任签署同意,于20xx年3月20日前发送至邮箱:。
(2)加盟律师须做出声明,同意总部可将其信息用于宣传推广和业务投标;
(3)总所矿产资源法律事务部将对提交的申请进行审核和评价,审核通过的律师,须与本部签订《盈科矿业律师合作框架协议》,方可成为本联盟的正式成员律师。
二、总所矿业部的优势及支持。
1、总所矿业部的优势:
(1)资源优势
在十几年的酝酿期中,我们与诸多矿业投资机构、矿业协会、勘察机构等已建立了广泛而密切的联系,拥有充足的客户群,掌握了大批的矿业投融资项目。
(2)人脉优势
经过多年的经营,矿业部亦与各地相关政府机构保持了良好的沟通,其中包括国土资源部、各省国土厅等司局级单位。同时也与多家教育及培训机构、勘察机构、矿交所等建立了紧密
的战略合作关系,平台广阔,人脉资源丰富。
(3)见解独到
矿产资源法律事务部团队成员均毕业于国内一流法学院,团队核心成员兼具矿业从业背景,对矿业产业的现状和前景无论在整体把握还是局部分析上均具独到见解,认识深刻、视野开阔,并具实际可操作性。
(4)信息共享
受矿业本身专业性强的影响,矿业法律服务受众面相对较窄,因此如何对外推广是各个分所矿业(或专职矿业律师)加盟后第一个要面临的问题。总所计划通过定期举办矿业法务讲座、召开全国性或地域性矿业行业会议、发行矿业部专业期刊等方式有针对性的向客户进行推广,在维系既有客户群的基础上挖掘潜在客户群。同时,这部分信息也将免费提供给各加盟律师。需要提醒的是,各分所加盟律师签约后应积极掌握矿业行业动态,增加矿业相关知识储备,紧跟总所推广步伐。
2、总所矿业部支持:为了把盈科矿业打造成全国性的行业平台,提升盈科矿业服务的影响力,更为了律师个人在矿业领域内的快速发展,打造有竞争力的专业矿业律师团队,矿业部将居中协调,为资源的整合保证畅通的沟通渠道。矿业部将通过以下方式对加盟律师给予有力支持,帮助加盟律师树立专业形象,使相应客户群体能以最直接的方式看到并了解团队律师在矿业法务、投融资领域的优势。. 总所矿产资源法律事务部将对成员律师进行具体、实时的业务指导;
. 成员律师可以成为中国矿业交易网的正式会员,可以利用该网络平台免费、获取、交流矿业信息;
. 定期举办矿业律师专业研讨会;
. 定期出版专业期刊《盈科矿业法律专刊》;成员律师可以担任期刊的编委、撰稿人,可将该期刊作为专业资料寄送客户;该期刊将对成员律师进行包装、推荐。
. 合作开展各项矿业法律服务,如交易信息及投融资渠道的共享、合作开展矿业并购项目等;
三、收益分配
矿业律师的收益来源主要是两方面:一是来自专业的矿业法律服务,二是来自项目居间信息服务。矿业法律服务项目包括矿产能源投资项目的收购与重组,矿产能源企业的反向收购、私募、海内外上市与融资,矿产能源企业矿权法律事务等多个方面;项目居间信息服务主要是矿业律师通过各种方式帮助项目转让方和受让方对接,最终促成交易完成。
收益分配原则,按所里规定办理,具体项目可特殊处理。
四、结束语
随着xx各项规划的展开,矿业行业面临更为深化的全面洗牌,各矿业企业间的横向联合和纵向整合将是未来的发展趋势。而近几年各地方政府对推进矿业企业的改革的关注也持续升温。这对法律服务工作者来说既是机遇也是挑战。盈科律师事务所矿产能源法律事务部本着快速发展,
合作共赢的理念,诚邀所内有识有志之士加入矿业团队,互助互利,共同打造金牌矿业法律服务团队,共创美好未来!
联系方式:XXXXXXX
医院推广会是指医药企业的产品获准进入或已经进入大、中型医院后,企业和医院联合召开的一种产品介绍会。目的是通过向医生介绍产品的药理研究、毒性实验、临床使用、功能主治等多方面的情况,增加医生对产品的认识,促进医院使用量的增长。 医院推广会操作步骤
一、与药剂科主任约定时间和地点。时间一般为下午下班前1~2小时,地点最好安排在医院的会议室。医院会议室一般有幻灯机、投影仪、电视机、录像机等,企业销售代表讲课时使用,产品介绍效果会更佳。
二、确定到会对象。一般为正副院长、药房主任、采购、相关科室的医生等(确保请到权威医生)。同时,与药剂科主任确定到会人员的纪念品。纪念品最好为厂家生活化的广告促销品,以便医生记住企业名称和产品名称。
三、会议程序
1.会前备齐签到册、宣传资料、幻灯片、录像带、广告礼品等,调试会场各种仪器,粘贴广告画,可做横幅、挂旗,标明“某某企业某某产品介绍会”字样。
2.与会代表报到时,由医药代表及其主管做接待,递送名片,发放纪念品及资料,请医生登记姓名、职务、职称、住址、联系电话等,以便于将来联系。
3.会议由院方药剂科主任主持。首先作人员介绍;其次由厂方较高级别代表致欢迎词,作公司介绍,邀请院领导讲话;最后由该医院的区域医药代表作产品介绍。如能请到当地权威医生讲课,则效果更佳。
4.产品介绍之后,可组织简单问题的抢答赛,并发放奖品,以加强医生的记忆及对产品宣传资料的了解、阅读。
5.会议结束后致答谢词,并进行会场整理,以给院方留下良好的印象。
四、注意事项
1.会议时间不宜太长,最好控制在1小时左右;
2.着装一定要职业化,演讲用普通话;
3.每次推广会最好只介绍一种产品或某一类型的产品,以切实加强宣传记忆的效果;
4.推广会以后,当地的医药代表最好在三天以内开始第一次拜访,并保持一定的频率。
商业推广会一般是指医药企业充分利用商业客户的网络关系,以会议的方式,将产品导入医院、药店、诊所或调往其他商业客户的一种方法。它主要有导入医院型,导入药店、诊所型,商业平调型,综合型等几种形式。 商业推广会操作步骤
一、会前的准备工作
1.与医药商业客户的经理协商,确定会议类型,并根据会议类型确定邀请对象。
2.确定会议规模,成立会务组,选择会场,发出邀请函。
邀请函的制作可决定到会人员的多少及开会时的拿货准备状态。一般的医药企业和商业企业在开会时只将开会的时间、地点及产品情况告之邀请对象,邀请对象在开会前准备状态较差;而湖南怀化正好制药有限公司在产品的邀请函中却注明了许多东西:时间、地点、公司简介、产品简介、推广会的内容及程序、订货订单及政策、广告播放情况、服务承诺等,效果非常好,许多与会代表刚到会场便送来了订单。
3.医药企业代表必须在开会前将货发至医药商业客户处。
4.会务费原则上由医药企业出,但也可协商解决。
5.制定商业业务员奖励政策及客户进货让利政策,以调动他们的积极性。
二、会场布置
1.会议地点一般为宾馆、客户的会议室等。
2.会议的主席台上方悬挂产品推广会横幅,并标明商业客户名和医药企业名,会场门口置欢迎词板、台卡、陈列样品及宣传品。
3.医药企业备齐各种资料,商业公司备好发票。
4.主席台上可设置摸奖箱,放置奖品。
三、会议内容
1.会议签到,发放饮料、宣传册、价目单、小礼品,会议程序表等。
2.会议由商业客户的经理主持,由医药企业最高级别代表介绍企业的宗旨、理念、目标、发展战略、产品销售形势等公司情况;由医药代表或当地权威医生介绍产品情况、使用情况,增强到会代表订货的信心。
3.组织抢答赛,以激活气氛。
4.医药企业的销售代表和商业客户的业务员要积极宣传,拿订单,对一些重点客户晚上也须加强订货公关活动。
5.抽奖及兑奖可放于活动的最后(订货基本完毕)进行。
四、注意事项
1.医药企业的销售代表与商业客户在会后须马上清理订单,将订货客户分类;对于订货量大的客户须加强跟踪服务,对于订货量小的客户也可用信函、电话加强联络,确保销售的良性循环。
2.会后及时兑现对商业客户业务员的承诺,调动其送货、收款、服务的积极性。
3.调整客户货源、库存,并加紧收款工作。
五、各种类型商业推广会的侧重点
1.医院型:在现阶段,由于大中城市医院进药管制加强,因此,公关进药后,召开单个的医院推广会较为适宜。但在县级医药市场,采用医院型推广会,可以快速地占领广大的农村区、乡医院。
2.药店、诊所型:一般应选择大中城市,在当地市场投放广告以后,或者在大中型医院销售较好的情况下,通过商业推广会铺开市场。同时,也可利用日用消费品助销理念,招聘DTC代表做市场。