保留学籍申请书

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保留学籍申请书范文第1篇

目的: 建立流式微球载体技术（FMA）检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清抗HFRS 病毒特异性抗体IgM和IgG及细胞因子含量的新方法。方法: 选择28例临床确诊的HFRS患者及20例健康人血清标本， FMA定量检测抗HFRS 病毒IgM和IgG; 定量检测细胞因子IL6和TNFα。检测结果与ELISA法进行比较。结果: FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%， 健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为(532.62±397.19) ng/L和(392.68±177.68) ng/L， 明显高于健康对照组（38.77±20.32）ng/L（P

【关键词】 肾综合征出血热; IL6; TNFα; 流式细胞术; 免疫酶技术

［Abstract］AIM: To establish a flow microbeads assay (FMA) to examine the level of hemorrhagic fever with renal syndrome virus (HFRS V.) specific IgM， IgG and cytokines in HFRS patients. METHODS: Serum samples from 28 cases of HFRS and 20 healthy controls were studied. Serum levels of antiHFRS V. antibodies were qualified and inflammatory cytokines IL6 and TNFα were quantified by FMA. The results were compared with the results by ELISA. RESULTS: FMA showed that the positivity rates for antiHFRS V. IgM and IgG were 92.85% and 71.43%， respectively. None was detected positive in healthy control group. The serum level of IL6 and TNFα in HFRS group were (532.62±397.19) ng/L and (392.68±177.68)ng/L， respectively， which were significantly higher than that in healthy control group (38.77±20.32 ng/L and 15.91±6.91 ng/L， P

［Keywords］hemorrhagic fever with renal syndrome; IL6; TNFα; Flow cytometry; immunoenzyme technology

肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）是由HFRS病毒引起的自然疫源性急性病毒性传染病。临床上， 检测特异性IgM、 IgG和细胞因子的方法仍以ELISA法为主， 该技术是以包被在酶板上的抗原(或抗体)与标本中的抗体（或抗原）反应， 形成抗原抗体复合物， 再用酶标二抗和酶底物显色， 通过酶标仪检测。该方法的灵敏度存在缺陷， 并且是一种非均相法检测， 必需将未结合的抗体和酶标二抗分离出去后才能进行读数， 因而增加了操作时间、 操作步骤和系统误差。

流式微球载体技术 (flow microbeads assay， FMA) 是利用流式细胞术（FCM）和高聚分子微球载体技术检测可溶性生物分子的新技术。原理是在聚苯乙烯微球上进行抗原抗体反应， 用荧光物质标记的二抗为示踪剂， 通过流式细胞仪进行检测。该方法灵敏度高， 可作均相法分析， 减少了操作步骤和时间。我们采用FMA检测HFRS患者血清异性IgM、 IgG及细胞因子含量， 并与ELISA方法进行了比较。

1 材料和方法

1.1 材料

陕西省疾病预防控制中心病毒研究室提供的HFRS患者血清28例， 其中男18例， 女10例， 年龄17～52岁， 平均年龄30.6岁。FACSCalibur流式细胞仪、荧光校准微球（Flow check）购自美国BD公司。FMA 试剂盒由比利时鲁汶大学医学院馈赠。HFRS病毒抗体定性检测试剂盒主要成分包括: 基因工程重组汉滩病毒抗原包被聚苯乙烯微球， 荧光素（FITC）标记羊抗人IgM和IgG， 阴性对照血清和阳性对照血清。人IL6和TNFα试剂盒主要成分包括: 鼠抗人IL6或TNFα抗体包被聚苯乙烯微球， 荧光素（FITC）标记鼠抗人IL6和TNFα抗体， 不同浓度梯度的IL6和TNFα标准品。肾综合征出血热病毒 IgM、 IgG检测试剂盒购自北方生物技术研究所， IL6、TNFα生物素亲和素酶联免疫技术法检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 FMA检测血清特异性抗体

（1）血样采集: 空腹抽取HFRS病人和健康人静脉血2 mL， 分离血清，-20℃保存。（2）检验方法: ①管1空白对照: 只加微球载体。管2零标准管: 加微球载体和标记抗体。管3 阴性对照。管4 阳性对照。管5此管开始为待测样本管。②加微球载体: 各管加样本稀释液100 μL。所有管加微球载体10μL/管 ， 轻柔震荡混匀。③加待测样本: 管3加阴性对照10μL、 管4加阳性对照10μL。待测样本管加待侧样本10μL， 轻柔震荡混匀， 置2～8℃孵育 20 min。④清洗离心: 加PBS 4 mL/管， 3 000 g离心6 min。弃上清， 存留管底微球沉淀约100 μL。⑤标记从管2开始， 各管加标记抗体10μL， 震荡混匀， 置2～8℃ 、 避光20 min。⑥分析每管加PBS 0.4 mL， 轻柔震荡混匀后上流式细胞仪分析: 上机检测前， 用荧光校准微球校正流式细胞仪光路和流路， 使变异系数值（CV）在2.0之内。依次上样， 计数>500， 得到每个测定样本荧光强度。（3）结果判定: ① 临界值（cutoff值）计算: 临界值=阴性对照荧光强度值×2.1。②阳/阴性结果判定: 测定样本荧光强度值≥临界值为抗体阳性。测定样本荧光强度值

1.2.2 FMA检测血清IL6和TNFα的含量

设置空白对照: 只加微球载体。零标准管: 加微球载体和标记抗体和标准品管。标准品管最终浓度分别为800、 400、 200、 100、 50 ng/L， 用Weitongcount制作标准曲线。操作步骤详见产品说明书。

1.2.3 ELISA法检测血清特异性抗体及IL6和TNFα的含量

按照试剂盒说明操作。血清IgM和IgG检测结果判断采用目测法， 根据显色深浅判阳性或阴性。IL6和TNFα检测结果: 在酶标仪上检测吸光度值， 用CurveExpert1.3统计软件， 绘制标准曲线， 并计算标本中细胞因子含量， 其IL6和TNFα浓度以ng/L表示。

1.2.4 统计学分析

应用SPSS10.0统计软件包进行统计分析。IgM、IgG、IL6和TNFα的表达水平， 符合正态分布以x±s表示。两组样本间均数的比较， 采用t检验; IgM和IgG阳性率比较采用χ2检验; 将IL6和TNFα做相关分析， 计算相关系数（r）和P值， P

2 结果

2.1 FMA与ELISA方法检测血清特异性抗体

结果见表1、 2。经χ2检验， 两种方法的阳性率比较差异无统计学意义（χ2=1.33， P>0.05）， 两种方法符合率IgM和IgG均为11/14=78.6% ， 两种方法高度相关。FMA检测血清抗体结果见图1， 其中IgM两组比较P

2.2 FMA与ELISA方法检测血清IL6和TNFα的含量

ELISA法结果见表3， FMA法结果见表4， 图2。患者和健康人比较P0.05）; IL6 的r值为0.215， P值为0.461（P>0.05）， 两种方法比较均无相关关系， 提示二者无明显统计学意义。表3 ELISA方法检测血清 IL6和TNFα的含量（略）表4 流式微球载体法检测血清 IL6和TNFα的含量（略）

3 讨论

研究表明， 人群感染HFRS病毒后仅少数人发病， 大部分人呈隐性感染状态， 患者感染后抗体出现早， 发热1～2 d即可检测出lgM抗体， 第7～10天达高峰; 第5～7天可检测出lgG抗体， 第14～20天达高峰。

在不同的抗体成份中， 对机体起免疫保护作用的主要是由汉滩病毒G1和G2糖蛋白刺激产生的中和抗体和血凝抑制抗体。细胞免疫在对HFRS病毒感染的免疫保护中同样起重要作用。一些细胞因子的水平在HFRS的不同病期也有明显变化［1］。

ELISA法常被用于IgM、IgG及细胞因子等检测， 但因所需样品量大、精确度小、费时等， 并且一次只能检测一种成分， 这些都限制了方法的检测范围与前景。传统的FCM因只能检测颗粒性物质， 因而限制了流式细胞术的使用。FMA法有机地整合了有色微球、激光技术、流体力学、高速数字信号处理器和计算机运算法则， 在各种应用中的检测结果与传统的ELISA基本一致， 但有着ELISA无法比拟的优越性: ①通量大; ②标本利用率高; ③特异性强; ④敏感度高， 动力学范围宽; ⑤液相反应; ⑥节约人力资源; ⑦重复性好。此外， 吴煦等采用流式免疫微球芯片技术分析特异性血小板自身抗体及其他物质， 与微孔板改进抗原捕获ELISA（MACE）进行比较， 两种试验结果高度相关［2］、稳定性和重复性较好［3］、精确度较ELISA 要好， 能同时进行多个成分的分析［4］。

我们将FMA应用到HFRS患者血清异性IgM、IgG及细胞因子含量的检测， 采用间接免疫荧光FMA定量检测人血清中HFRS病毒抗体IgM和IgG; 采用双抗体夹心免疫荧光FMA定量检测人IL6和TNFα， 检测结果与ELISA法进行比较， FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%， 健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为（532.62±397.19）ng/L和（392.68±177.68）ng/L， 明显高于健康对照组（38.77±20.32） ng/L（P

在我们检测的患者中， 两种方法检测IgM的检出时间均为发病第2天， 高峰均出现在发病第4～7天， IgG检出时间均为发病第4天， 高峰均出现在发病第7～14天， 而这与以往的研究结果不完全相同。两种方法不同的是FMA法检测IgM、IgG可以定量， 而ELISA法不行。两种方法检测血清IL6和TNFα的含量比较， IL6显著增高时间均为发病第4天， 高峰均出现在发病第4～7天， TNFα显著增高时间均为发病第2天， 高峰均出现在发病第2～4天， 且IL6和TNFα的浓度呈正相关。这与江振友等［5］实验结果趋势相同。细胞因子在HFRS发病机制中所起的重要作用在国内外研究中多有论述。但采用FMA法于以上指标的检测尚未见报道。本实验结果HFRS患者血清中IL6和TNFα含量较健康对照组明显升高， 推测HFRS患者发热、 出血和肾脏损害等病理表现与细胞因子大量产生密切相关。

综上所述， 利用FMA对HFRS病人血清异性IgM、IgG及细胞因子含量的检测， 克服了以往ELISA法检测技术的缺陷， 提高了HFRS检测的准确度和重复性， 该方法可以更好的用于临床， 推动HFRS检测的研究与应用。并在HFRS发病机制的探讨、 诊断及预后评价中有一定意义。

参考文献

［1］Caughey Mc， hart CA. Hantavirus［J］. J Med Microbiol， 2000， 49: 587.

［2］吴煦， 王建中， 李传保， 等. 流式免疫微球芯片技术分析特异性血小板自身抗体［J］. 中华检验医学杂志， 2008， 31（1）: 32-38.

［3］江敏， 陶德定， 肖徽， 等. 细胞可溶性蛋白质的流式微球技术定量检测［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志， 2007， 16（5）: 617-618.