周末学习计划

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周末学习计划范文第1篇

【摘要】 目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因，并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化，纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功，并得到高纯度的蛋白，且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。

【关键词】 亚洲带绦虫;膜联蛋白B2;基因克隆;免疫反应性

ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library， the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter， the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition， the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.

KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity

鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pET-28a(+)及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。

1.1.2主要试剂和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶 (大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1Annexins B2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫Annexins B2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点进行PCR反应。

1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和PCR鉴定，并进行重组质粒DNA测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。

1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的Ni-IDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。

1.2.4Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG进行Western blotting鉴定。

2结果

2.1Annexins B2基因的识别和序列分析该基因全长922bp，编码区为224～686bp。其最大ORF为其完整编码区。

2.2原核重组质粒的鉴定将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物行0.8g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带，与目的基因大小基本相符。此外，重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功(图1)。

2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到E.coli BL/DE3中，超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2)，与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526g/L。

2.3Western blotting鉴定纯化蛋白的免疫反应性

用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、感染牛带绦虫的患者血清以及亚洲带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白反应的结果均显示出较清晰的条带，而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带(图3)，表明该表达产物具有良好的免疫反应性。图1重组质粒的PCR和双酶切鉴定

Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA标准(DL2000);1：PCR产物;2：pET-28a(+)质粒双酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重组质粒双酶切;M2：DNA标准(DL 15000)。图2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product

M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未诱导;2：pET-28a(+)IPTG诱导;3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未诱导;4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG诱导;5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2纯化蛋白。

3讨论

带绦虫病的流行在我国西部一直是一个严重的公共卫生问题。每年由带绦虫病造成的健康和畜牧业经济损失上百亿，严重影响西部欠发达地区的社会发展。目前，亚洲带绦虫病的防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机制研究。图3重组蛋白的Western blotting 鉴定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：纯化蛋白与亚洲带绦虫患者血清的反应结果;2：纯化蛋白与牛带绦虫患者血清的反应结果;3：纯化蛋白与猪带患者血清的反应结果;4：纯化蛋白与亚洲带绦虫感染猪血清的反应结果;5：纯化蛋白与正常人血清的反应结果。

本实验通过生物信息学方法从已经构建好的亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出了一个膜联蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且预测出该基因位于胞浆，无跨膜区，二级结构基本上是以α螺旋为主。这些都符合膜联蛋白家族的共同特征[4]。根据膜联蛋白家族分布广泛，表达丰富且稳定的特性，可以推测其在绦虫的生理活动中可能起着重要的作用。

膜联蛋白是一个广泛存在的蛋白家族，在所有真核基因组中广泛表达。具有内部重复单位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+结合区域的特征，用以结合带有负电的脂质。虽然它为钙结合蛋白，但是在结构上却没有EF手，而且在和Ca2+结合后，还可以与磷脂再次结合而发挥生物学效应。例如，细胞的胞吞胞吐，离子通道的形成，调节磷脂酶A2的活性及细胞内外Ca2+浓度、抗炎症反应等。在长期的生物进化过程中，膜联蛋白家族各成员在生物学特性和生理功能方面表现出非常复杂的关系，且在研究过程中发现，annexins没有信号肽，没有跨膜结构，是一个典型的细胞内蛋白。但是，却有学者发现它可以与细胞外基质发生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制肿瘤[8]等。最新的研究报道，当将其作为疫苗的候选因子时，可以消除一些寄生于哺乳动物体内的寄生虫。此外，学者们认为膜联蛋白是维持细胞膜表面结构和信号转导功能的重要蛋白。并可能具有激活纤维蛋白酶原的功能，有助于破坏宿主的结缔组织，使虫体抗原更加容易进入宿主机体，诱发免疫应答。因此，对该基因的研究有助于进一步了解它的生物学功能及开辟预防治疗寄生虫病的新途径[9-10]。

目前，Annexins B2已经在猪囊尾蚴的研究被发现并命名，但是具体的生理功能还不清楚，且在亚洲带绦虫研究领域还是空白。因此，本研究将亚洲带绦虫成虫annexins克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒，在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，上清中有微量的表达，说明annexins主要表达在包涵体中。因此，进一步溶解包涵体[11]，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。此外，还尝试性的用上清过柱纯化并用蔗糖进行蛋白浓缩，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的，可用于不同抗原的比较和定量。其检测结果表明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应且在绦虫中的诊断特异性不高，推测其不能作为免疫诊断抗原的合适候选分子。但是，其具有免疫活性的高效表达。由此可推测它是一个具有开发潜力的基因。总之，本项研究填补了该蛋白在亚洲带绦虫研究领域的空白，也为进一步研究该基因的生物学功能及在诊断尤其是疫苗研究方面奠定了基础。

参考文献

\[1\]包怀恩. 我国亚洲带绦虫研究的现状和展望 \[J\]. 热带医学杂志， 2002， 2(3):215-219.

\[2\]张朝云，杨明，张科，等. 云贵州三地牛带绦虫核糖体tRNA-ITS1序列分析 \[J\].贵阳医学院学报， 2006， 31(4):291-295.

\[3\]黄江，胡旭初，包怀恩，等. 亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序 \[J\]. 热带医学杂志， 2007， 7(2):116-118.

\[4\]MOSS SE， MORGAN RO. The annexins \[J\]. Genome Biol， 2004， 5:219-221.

\[5\]CHOI SH， KWON SR， LEE EH， et al. Molecular cloning， functional characterization and localization of an annexin from a fish gill fluke microcotyle sebastis (Platyhelminthes: Monogenea) \[J\]. Mol & Bioche Parasitol， 2009，163(1):48-53.

\[6\]高奋堂，曹云山，徐义先，等. 氟伐他汀对人外周血单个核细胞膜联蛋白A1表达水平的影响 \[J\]. 临床心血管病杂志， 2006， 22(4):209-211.

\[7\]王义会，闫强，王平，等. 膜联蛋白B2基因的克隆及其真核表达载体的构建 \[J\]. 动物医学进展， 2007， 28(3):31-33.

\[8\]朱逢佳，曾苏，曹江. 膜联蛋白-1与肿瘤\[J\]. 细胞生物学杂志， 2008， 30(5):581-585.

\[9\]ZHANG Y， WANG KH， GUO YJ， et al. Annexin B1 from Taenia solium metacestodes is a newly characterized member of the annexin family \[J\]. Biol Chem， 2007， 388(6):601-610.

周末学习计划范文第2篇

1.注重良好习惯的培养。

教育就是培养习惯，我们通过班会和宣传专栏让学生知晓、明确学习各个环节应该怎样，不应该怎样。从课前预习、课堂学习到课下练习、课后复习，由任课教师手把手帮学生养成良好的学习习惯，掌握合适的学习方法，制定切实可行的学习计划。学校先后印发了《致篮球生学习习惯的一封信》和《致高一篮球生的一封信》，以人性化、学生易于接受的方式帮助学生规范学习行为，对篮球生的学习、训练、做人等方面提出希望和要求，从成人、成才、升学的角度给学生以指导，促进了学生良好习惯的养成，起到了润物细无声的效果。篮球特长生在文化课上相对来讲懒散一些，这也与他们大体力训练有关，所以不能指望孩子们课下给你整理笔记，认真复习。因此在篮球特长班的课堂上，每结束一个知识点的学习，教师注重让学生用几个关键词来概括该知识点，达到当堂掌握的效果。同时让学生整理知识的过程就是对知识进行加工的过程，对知识进行处理，揭示知识之间的内在联系，使之系统化、体系化的过程。这样既减轻了学生的负担，巩固了学习效果，又增强了学生的学习兴趣。

2.强化课堂教学和学情诊断。

著名教育家赞可夫说："教学法一旦触及学生的情绪和意志领域，触及学生的精神需求，这种教学法就能发挥高度有效的作用。"这说明，如果能使学生主动地学习，他们就会对知识产生浓厚的兴趣，热情很高，思维也会非常活跃。因此，在课堂教学中，教师要根据学生的这种心理特点，根据教学内容，通过学生喜闻乐见的方式，努力为学生创设自主学习、主动探索的空间，给学生提供充分的探讨、发现的时间，将枯燥无味的填鸭式的课堂教学转化为形象生动的一幕幕情境，激起学生强烈的求知欲望，激发学生浓厚的学习兴趣。课堂教学在学校"四步教学法"基础上，以"降低教学难度、分层教学、当堂达标"为目标，开展了篮球特长生"高效课堂"教学活动，解决了"篮球生学习时间短、基础差，提高学习成绩难"的困惑。坚持举行全体任课老师单元学情诊断分析会和教练与任课老师联席会。每次单元学情诊断测试后，组织全体任课教师召开班、科学情分析会，共同摸排学生的学习状况、精神状态、优势和不足，排查教学中存在的问题和盲区，做到因材施教、对症下药。每月篮球教练和文化课任课教师联席会，从学习与训练两方面结合，针对共性问题，商讨对策、互通信息，达成教育共识，形成教育合力，制定有效措施帮助学生全面提高。

3.实行篮球特长生"导师制"。

由任课教师包干负责3-5名学生，定期谈心，了解学生的思想、情绪、学习和生活。发现思想上的问题，老师给予及时的开导、疏导、指导；对生活上有困难的，给予帮助；对学习上有困难的，老师从方法上给予指导或联系相关老师给予补课。总之，让学生生活得开心，学得有信心，训练成绩和文化课成绩每天都有进步。

4.实行"激励卡"制度。

教学评价是教学过程中不可或缺的一个基本环节，由于它对学习具有反馈、调控、改进等功能，因此，对学习活动进行科学评价，是培养学生自主创新学习的重要方面。传统的评价方式往往重结果而轻过程，以结果的正确与否作为评价的唯一标准。对学生课程学习的评价，既关注学习结果，又关注他们在学习过程中的变化和发展；既关注学生的学习水平，又关注他们在实践活动中表现出来的情感和态度。任课教师使用并发放蓝色激励卡，及时表彰学生课堂闪光点，激发学习积极性；班主任使用红卡以表彰学生日常表现中的闪光点；教练使用黄卡以发现学生训练中的闪光点。

5.开展学科知识讲座。

为丰富篮球特长生周末生活，年级开展了周末学科知识讲座。讲座选题根据学生需要，联系实际，深入浅出，生动形象，耐人寻味，不仅丰富了校园文化生活，而且开阔了视野，成为篮球生多彩周末生活的重要组成部分。

6.建构学生日志，敦促能力培养。

年级建立学生台帐，使用学生成长记录袋记录学生的日常表现，以让师生交流恳谈常态中突出重点，动态中切中肯綮，帮助学生随时、及时纠改学习中的偏差，完善自身、提升能力。同时，针对学生不同时段的学习和心理特点，及时洞察，印发并学习《自主学习 走向成功》《志存高远 放飞理想》等文章，激发学生动力，指导学生学会自主合作方式，培养自学能力，助其学业成功完成。

7.注重科学化高效训练。