保险感言

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保险感言范文第1篇

关键词 肿瘤干细胞 靶向给药系统 耐药 信号转导通路 胰腺癌

中图分类号：R735.9 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）06-0028-06

胰腺癌是目前预后最差的消化道肿瘤，其发病率与死亡率接近。虽然，胰腺癌的研究取得了重要进展，但其预后仍很差，学者们仍在寻找新的治疗方法。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）学说的提出为寻找根治胰腺癌提供了新的理论基础，该学说认为，在实体瘤或体外细胞系中存在的极少数细胞具有自我更新和多分化潜能，可能在肿瘤的发生发展以及放、化疗耐药中起到重要作用[1]。目前，胰腺癌干细胞已被证实具有自我更新、高致瘤性、活跃分化潜能和强耐药性的特点，具有极高的恶性特点。

1 CSC的理论基础

肿瘤由具有异质性的组织组成，关于肿瘤的异质性有两种解释：一种观点认为异质性起源于不同类型的细胞，即具有干细胞样特性的细胞，这种细胞来源于天然多功能干细胞，还是正常细胞经过突变后转变为干细胞，尚不清楚；另一种观点认为，肿瘤的异质性来自克隆演化，突变的肿瘤细胞生存并繁殖，突变优势细胞群类似干细胞，具有促进肿瘤生长的能力。两种观点并非相互独立，而是具有内在联系。因此，CSC具有两层含义[2-3]：①肿瘤起源于组织干细胞或胚胎细胞，具有自我更新的调节；②肿瘤是具有干细胞特性的细胞亚群。

2 CSC的简要发展史

早在150年前，病理学家Connnheim和Duramte就提出，组织中存在的极少数干细胞可能是肿瘤的起始细胞。1994年，Lapidot等[4]首次通过特异细胞表面标志分离出人急性粒细胞白血病干细胞，发现只有白血病干细胞才具有不断自我更新，维持其恶性显性的作用，首次证明了CSC的客观存在，是人类第一次分离出CSC。2003年，Al-Hajj等[5]成功分离出人类乳腺癌干细胞，通过连续移植实验，诱发出非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠（NOD/SCID）的乳腺癌。2004年从中枢神经系统肿瘤中分离出具有干细胞特性的细胞[6-7]，并在动物实验中得到验证。2005年，Saad等[8]从前列腺癌组织中成功分离出表型为CD44+/α2β1hi/CD133+的前列腺癌干细胞（约0.1%），其在体外有很高的增殖潜能并形成二次克隆，具有自我更新、无限增殖和分化的能力，在非雄激素依赖下长期存活。2005年Kim等[9]从小鼠非小细胞肺癌模型的最初阶段分离到支气管肺泡干细胞。2007年Li等[10]首次从手术切除标本中分离到CD44+CD24+ESA+胰腺癌干细胞，并通过小鼠的体内成瘤实验证明其成瘤性，组织病理学特点与手术标本类似，证实该干细胞具有高度的自我更新能力。

3 CSC的鉴定方法

目前鉴定胰腺癌干细胞的方法主要有细胞表面标记、侧群细胞（side populations，SP）实验、成球生长实验和动物致瘤性实验。

3.1 细胞表面标志

主要利用细胞表面带有特异性膜蛋白（即表面标志）的特点，经特异性抗体结合后，用流式细胞仪在荧光活化系统检测下分选出荧光细胞。胰腺癌表面主要分子标志为CD44+CD24+ESA+、CD133+、乙醛脱氢酶1（ALDH1）、c-Met等。Olempska等[11]应用实时定量PCR检测发现，ATP 结合盒（ATP-binding cassette， ABC）G2在细胞株Panel、Panc89、Colo-357、Panc Tul和A818-6中均显著高表达，而CD133仅高表达于Pane Tul和A818-6细胞株，因此认为ABCG2+/CD133+细胞可能是胰腺癌干细胞，并且通过致瘤实验得到验证[12]。Jimeno等[13]在动物实验中发现胰腺癌部分细胞高表达ALDH1，并且该细胞具有明显的耐药性，表现为CSC的特性。Li等[14]研究表明c-Met介导了胰腺癌干细胞的生长与转移，可作为一种表面标志进行肿瘤细胞的分选。

3.2 SP细胞实验

CSC具有ABC转运蛋白的功能，能够外排核酸染料Hoechst33342，而大部分非CSC不具备该蛋白。SP细胞实验利用该特性，通过荧光显微镜和流式细胞技术观察具有CSC特性的不着色细胞。Zhou等[15]分离出人胰腺癌细胞株panc-1中的SP细胞，并发现用吉西他滨处理后，SP细胞的比例明显升高，并且该SP细胞具有较高的克隆形成能力和更强的成瘤能力。

3.3 成球生长实验

CSC在特定的培养基可以形成干细胞球，从而特异富集CSC。其针对流式细胞分选出来的CSC的验证，将分选出的CSC进行体外培养，通过悬浮细胞球的生长验证CSC的自我更新和分化能力。细胞生长曲线实验是对分选出的CSC进行体外培养，观察细胞生长指数，并绘制生长曲线，通过对比普通肿瘤细胞的生长速度验证CSC的增殖能力。

3.4 动物致瘤性的体内实验

是指用一定数量的待测肿瘤细胞悬液接种至NOD/SCID小鼠体内，观察是否会有肿瘤生成以及肿瘤的发展进程，用以评估待测细胞是否具有形成并维持肿瘤生长及异质性的能力。动物体内致瘤性实验是目前验证CSC的金标准。

4 胰腺癌干细胞的通路研究

胰腺癌干细胞与正常细胞一样具有多分化潜能、自我更新能力和信号转导通路，这些通路在胰腺癌干细胞的自我更新和自我调控中起到重要作用。在胰腺癌干细胞中表现得异常激活的通路有音猬因子（sonic hedgehog， Shh）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Notch、骨形态发生蛋白（BMP）、胰十二指肠同源蛋白1（PDX1）和B细胞特异性莫洛尼白血病毒插入位点-1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1， BMI-1）等。

4.1 Shh通路

在人胰腺癌组织中的Shh通路异常激活，胰腺干细胞Shh通路的激活程度是胰腺癌组织的11倍[10]，并且发现利用转基因技术将Shh基因导入到正常胰腺中，可使胰腺组织向胰腺癌前病变方向发展，出现胰腺常见的基因突变类型，如K-ras基因突变、Her2/neu过表达等[16]，利用Shh通路抑制剂环巴胺抑制后，体外胰腺细胞增值明显抑制[17]。

4.2 BMI-1通路

原癌基因BMI-1是转录抑制因子基因polycomb家族成员，它通过调节端粒酶的活性控制细胞的增殖和凋亡。参与正常干细胞调控作用的BMI-1在CSC的维持和自我更新中同样具有重要作用，如乳腺癌、结肠癌等肿瘤中的CSC均明显上调。有学者证实胰腺癌细胞（CD44+CD24+ESA+）中的BMI-1 mRNA具有异常表达，并认为在胰腺癌干细胞中的自我更新的维持上具有重要作用[18]。

4.3 Notch信号通路

Notch是非常保守的信号系统，其受体多与相邻细胞间的膜结合配体结合而被激活。Notch途径的激活过程是γ-分泌酶作用于Notch受体的细胞内结构域，该结构域从膜上脱落，移位到细胞核调控基因表达，从而影响细胞增值、分化和转移过程。Notch通路的异常与胰腺癌干细胞的自稳具有明显的相关性[19]，其确切关系仍在进一步的研究中。

4.4 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路

mTOR信号通路是新近发现的胞内信号通路，该通路可汇聚和整合来自营养、生长因子、能量和环境压力对细胞的刺激信号，进而通过下游效应器真核细胞始动因子4E结合蛋白1（4EBP1）和核糖体S6蛋白激酶（S6KS）调节细胞生长，并发现该通路与胰腺癌干细胞的自我增值具有明显的相关性。Mueller等[20]发现，胰腺癌干细胞的mTOR信号通道异常活跃，雷帕霉素是mTOR的抑制物，阻断该信号通道可以抑制部分胰腺癌干细胞（CD133+）的生长，为了更好地杀灭干细胞，研究人员将雷帕霉素、环杷明和吉西他滨三药联合（CRG），发现对CSC的杀伤力极强，可以明显延长无瘤生存时间，提示mTOR信号通路积极参与了胰腺癌干细胞的自我更新与分化。

4.5 PDX1途径

PDX1是胰腺发育早期起重要作用的启动基因表达的蛋白，在胰腺自我更新时，PDX1可在胰腺导管细胞中短暂表达，在胰腺导管腺癌中高表达[21-22]，其表达程度又与肿瘤的大小、分化程度以及淋巴结转移等密切相关。并且发现这些特性都与CD133+，CXCR4+的胰腺癌CSC的特性非常吻合[23-24]。

4.6 基质细胞衍生因子1/侵袭前端趋化因子受体-4（SDF-1/CXCR4）轴

SDF-1/CXCR4轴无论是胚胎时期胰腺的形成还是损伤胰腺的修复均具有重要作用，可以促进细胞的增殖和迁移并促进胰管形成。有研究表明在胰腺癌CSC发生转移之前，使用特异性抑制剂（AMD-3100或AMD-070）阻断CXCR4的表达，会明显降低胰腺癌的转移发生率[25- 26]。

5 胰腺癌干细胞与转移

胰腺癌一旦出现转移，预后极其不佳，癌细胞的转移过程涉及多种活性因子及酶的参与，并不是所有的胰腺癌细胞都具备转移的能力，只有其中的一小部分会出现转移并最终形成转移瘤。Wellner等[27]研究发现，锌指E-盒结合同源异形盒1（ZEB1）是胰腺癌细胞上皮间质转化的激活因子，ZEB1通过抑制细胞microRNA-200的表达，阻止细胞的正常分化，激活细胞出现上皮间质转化，并使癌细胞具备干细胞的表型，从而使癌细胞发生侵袭、转移。因此提出ZEB1-microRNA-200反馈弧可以作为治疗胰腺癌的靶点。Hermann等[28]发现侵袭性胰腺癌标本中，CD133胰腺癌干细胞与CXCR4+呈共表达。CD133+CXCR4+细胞和CD133+CXCR4-细胞均可在小鼠体内形成肿瘤，但是仅CD133+CXCR4+细胞的肿瘤发生转移，提示可能存在两种不同表型的胰腺癌干细胞，即稳定型干细胞和游走型干细胞；同时发现在小鼠模型中阻断CXCR4胰腺癌干细胞与化疗耐药信号通路可抑制肿瘤转移，这对临床治疗胰腺癌转移有重要的指导意义。但目前仍未明确CXCR4+细胞来源于何处，是干细胞最初就富有的一种亚克隆，还是在肿瘤发展过程中干细胞受到微环境影响诱导产生的新亚型，因为这涉及如何确定通过抑制CXCR4+胰腺癌干细胞来阻止肿瘤转移的治疗策略，究竟是直接消灭CXCR4+的干细胞亚群，还是诱导干细胞分化进而减少干细胞抑制转移。Singh等[29]使用吉西他滨联合AMD3100封闭胰腺癌细胞CXCR4后，发现胰腺癌细胞的生长与转移都受到了抑制，很好的验证了Hermann的研究成果。

6 胰腺癌干细胞与耐药性

耐药的肿瘤细胞与CSC具有许多相似的特征，如大多处于细胞周期的G0期，不进入增殖周期，而大部分化疗药物作用于细胞增殖期，不能杀灭处于G0期的癌细胞，这些细胞的细胞膜ATP泵耐药分子，具有极强的自我修复DNA损伤和抗凋亡的能力。越来越多的研究显示胰腺癌干细胞介导了其对放化疗的抵抗，Hermann等[30]采用吉西他滨干预CD133+CSC，发现其对吉西他滨明显耐药，干预5 d后其比例明显上升，达细胞总数的50%。他们在体内实验发现吉西他滨具有抑制胰腺癌生长的作用，但CD133+CSC的比例明显升高，进一步说明CD133+CSC的耐药性。Wang等[31]的研究支持Hermann的研究结果。Lee等[18]通过CD44+CD24+ESA+CSC移植瘤模型也证实胰腺癌干细胞对放、化疗抵抗。他们用放疗联合吉西他滨化疗干预上述模型时发现，移植瘤的生长不仅不被抑制反受到刺激，深入研究表明CD44+CD24+ESA+CSC在吉西他滨的作用下不会凋亡，仅停止增殖，一旦停止用药，该细胞亚群又开始增殖和分化。Kallifatidis等[32]的研究发现，西兰花提取物莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）能增强化疗药物对胰腺癌CSC的杀伤作用，体外实验发现，通过抑制ALDH1和Notch-1表达可诱导凋亡和抑制细胞的增殖；体内实验发现，SFN可以抑制种植瘤在裸鼠体内生长，且无不良反应。Rausch等[33]研究发现，肿瘤靶向药物索拉非尼（Sorafenib）可以抑制胰腺癌CSC的增殖、分化和转移，在种植瘤模型研究中，发现索拉非尼可以抑制种植瘤的生长和血管形成，但却可以激活胰腺癌CSC中的核因子-κB（NF-κB），NF-κB是一种常见的转录因子，可以被炎性因子、生长因子或趋化因子等激活，NF-κB一旦被激活，就会使胰腺癌CSC死灰复燃，而将SFN与索拉非尼联用，可以阻止NF-κB的激活，抑制癌细胞克隆增殖，彻底消灭胰腺癌CSC。

7 胰腺干细胞的临床意义

肿瘤现有的药物治疗，虽然具有一定的疗效，对肿瘤细胞具有明显的抑制和控制作用，无论对转移灶和原发灶，均是暂时的控制，大多数患者均可以发生复发和转移，其中最为关键的问题是没有彻底清除CSC。因此，消灭非成瘤细胞，可以使肿瘤缩小，但不能治愈，如果药物直接针对CSC，直接将CSC进行清除和诱导CSC进行转化，将对肿瘤的治疗是一个历史性的改变。因此针对胰腺癌干细胞的信号转导通路的研究，会导致新的治疗肿瘤方法的诞生。Mueller等[20]报道应用CRG三联疗法治疗胰腺癌干细胞具有明显的疗效，但仍有一定的临床风险，如雷帕霉素和环杷明联用传统化疗药有潜在的风险，可能对其他器官的功能同样具有抑制作用。当然Mueller等[20]的CRG三联疗法在动物实验中显示裸鼠尚能耐受该疗法，但应用于临床还需大量的临床前实验。虽然此疗法未进入临床，但其优势尚存，CRG三联疗法中的药物均已经在临床使用，可以减少巨大的工作量，而且各自的毒副作用已知，仅需研究联合应用后的毒副作用，相对工作量减轻。

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保险感言范文第2篇

肝纤维化（Hepatic fibrosis，HF）是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，是所有慢性肝病的共同病理基础。正常肝脏细胞含有肝细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞、肝星形细胞（HSC）。在病毒性肝炎、铁铜代谢异常、自身免疫疾病等因素作用下，相关细胞分泌多种细胞因子，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF )、肿瘤坏死因子 -α( tumor necrosis factorα，TNF-α)、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等，这些细胞因子首先与 HSC膜上受体结合 ，然后通过不同或相同的胞内信号转导系统（JNK/MAPK信号通路、JAK/STAT通路、TGF-β和PDGF介导的信号转导通路等）传递，在某些转录因子的作用下，转导信号入核，从而启动 DNA复制、转录及翻译表达过程，实现 HSC活化、增殖、转型并分泌细胞外基质（ECM），最终导致肝纤维化的发生［1，2，3］。其特点表现为：以胶原蛋白为主的细胞外基质各成分合成增多，降解相对不足，过多沉积在肝内。肝纤维化进一步发展引起肝小叶改建、假小叶和结节形成，最终致肝硬化。Safadi等［4］ 研究表明肝纤维化在去除损伤因素后尚有逆转的可能。目前，学者们普遍认为HSC是肝脏合成ECM 的主要细胞［5］，HSC的活化与增殖是肝纤维化形成的中心环节［6，7］，该环节包括细胞增生并合成 ECM、释放胶原酶及其抑制物等过程。

1 HSC的一般性质和功能［8］

1876年德国Von Kupffer首次描述星形细胞，肝星形细胞又称肝贮脂细胞(fat-storing cells，FSCs)、脂细胞(1ipocyte)、维生素A贮存细胞(vitaminA-storing cells)、窦周细胞(pericyte)和伊东细胞(Ito cel1)等，是肝脏的一种非实质细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的窦周间隙(Disse间隙)内。正常情况下，HSC约占肝细胞总数的8%～13％，占非实质细胞的33％。其形态不规则，胞体呈卵圆形或不规则形，常伸出数个树枝状突起包围窦壁，其星形伪足包绕5～6个肝细胞，因此得名为肝星形细胞。HSC胞质内有 1～14个直径为 1 μm ～2μm的富含维生素 A和三酰甘油的脂滴。

正常情况下，HSC具有以下生理功能：1） 储存脂肪，为肝细胞提供能源；2） 储存和代谢维生素A，储存体内80％左右的维生素A，对体内维生素A的稳定起着重要调节作用；3） 合成和分泌胶原、蛋白多糖、中间丝、结蛋白 、细胞因子和生长因子等成分；4）合成基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)；5） 调节肝窦内微循环。

2 HSC的活化

正常情况下HSC处于静止状态。在各种肝损伤因素刺激下，HSC可经历从静止HSC到具有增殖性、成纤维性和收缩性的肌成纤维样细胞(MF)的转化过程。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，邻近的细胞如肝细胞、库普弗细胞、窦内皮细胞和血小板等通过旁分泌作用可分泌多种细胞因子，如TNF-α、TGF-β、IGF-1 (胰岛素生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、PDGF、ET-1 (内皮素-1)等。使HSC出现肌成纤维母细胞样表型转化，激活并导致细胞增殖、ECM合成增加。激活后的HSC可自分泌TGF、PDGF、ET等细胞因子使活化得以持续，此时即使除去原发因素，其纤维化过程仍会持续。

细胞因子、炎症介质、ECM成分、过氧化物、乙醛等与相应HSC膜受体结合，激活效应细胞内信号传递分子，最终导致基因表达所发生的变化是多条细胞内信号传导通路控制的结果。其中促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是近年来发现的一类特殊的细胞信号传导蛋白。经上游激酶作用后发生苏氨酸、丝氨酸双位点磷酸化而激活［6，9］ ， MAPK信号传导通路被认为是许多信号通路的共同通道，其活化与HSC的增殖密切相关。PDGF是HSC最强烈的有丝分裂原，通过PDGF受体酪氨酸激酶介导的信号细胞传导作用促进HSC增殖。瘦素（Leptin）能通过激活JAK/STAT通路及H2O2依赖的ERK1/2通路激活HSC，并产生大量TIMP-1，促进纤维化进程。

活化后的HSC其特征发生一系列改变：1) 形态学上表现为脂滴消失，胞体增大，伸出细长的伪足，呈现星形外观。胞质中储存的脂滴和维生素A 减少或消失。胞质内粗面内质网增加、高尔基体发达，具有旺盛的蛋白质合成能力；2) 增生频率增加，细胞大量增生，并且向肝损伤部位迁徙；3) 表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白及结蛋白。Niki等［10］采用免疫印迹法研究发现，波形蛋白及结蛋白在HSC原代培养的第2～6d开始表达，α-SMA在原代培养的13 d内其表达持续增加；4) 收缩性增强。HSC收缩与内皮素(ET)和P物质等收缩因子有关，舒张与一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)等舒张因子有关。肝脏损伤时内皮细胞及活化的HSC合成ET增加，作用于HSC表面的特异性内皮素受体(ETR)，引起细胞收缩，使肝窦血管阻力升高，致肝硬化门静脉高压进一步发展； 5) 细胞外基质产生增多。活化的HSC可分泌I、Ⅲ、Ⅳ型胶原，板层素（LM），纤维连接蛋白(FN)，层连蛋白(LN)，腱蛋白(tenascin)和粗纤维调理素（undulin）等糖蛋白成分以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸(HA)等蛋白多糖，这些蛋白多糖是生成ECM 的主要物质；6)分泌趋化因子及细胞因子，参与炎症反应及趋化作用。活化的HSC生成单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)、肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor， HGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor，CTGF)、胰岛素样生长因子(insulin-1ike growth factor，IGF)及IL-6、IL-10等。同时表达多种受体：如TGF-β及其 I 型受体；PDGF及其受体；内皮素(ET)及其受体等［11］。上述细胞因子和受体构成细胞因子的网络调控(network of cytokines)系统；7) TIMP合成和分泌增加。活化的HSC是MMP及TIMP的主要来源细胞。HSC激活后所分泌的TIMP-1、TIMP-2增加，抑制了MMP对ECM的降解；8) 分泌基质降解素及明胶酶，降解基底膜，破坏肝血窦；同时，肝血窦内皮细胞的窗孔消失，导致肝窦毛细血管化。

3 HSC在HF恢复期的作用

在HF的恢复阶段，活化HSC的数目减少导致TIMP-1、TIMP-2下降［12，13］，从而使MMP的活性恢复，ECM 降解多于沉积。此外，包绕在活化HSC周围的整合素ανβ3配体的降解，可降低与活化HSC表面整合素ανβ3的连结作用，抑制HSC的增殖，促进HSC的凋亡，并诱导一种可溶性的、分泌MMP的HSC表型出现［14］ 。随着活化HSC的凋亡，与活化HSC相关的系列事件也将改善，HF由此逐渐趋向恢复。

4 HSC的凋亡及其调控

在肝纤维化的逆转过程中，随着肝组织结构完整性的恢复，激活的HSC数量会减少。导致HSC数量减少有两种可能：一是由激活表型转化为静止表型。二是发生细胞凋亡而死亡。研究表明［15］ ，在肝纤维化恢复阶段，主要是表现为激活状态的HSC凋亡而不是表型的转化。

4.1 Fas(CD95／Apo-1)／Fas-L(CD95L／Apo-1-L)介导

HSC凋亡主要通过死亡因子(FasL)及其相应的死亡因子受体(Fas，又称CD95)介导的信号传导途径实现。Saile等［16］在对星形细胞的凋亡及其调控的研究中发现，在HSC活化过程中有凋亡出现，并且随着活化过程的进展其表达Fas和FasL的量不断增加。CD95(Fas)拮抗抗体能完全阻断HSC的凋亡；而 CD95(Fas)激动抗体可诱使高达 95％的活化 HSC进入凋亡状态并表达 p53。表明HSC的凋亡是通过Fas／FasL途径启动的。Gong［17］等的体外培养实验表明，外源性FasL可使原代培养晚期或传代培养的HSC发生凋亡。在HSC的活化过程中，凋亡的调控蛋白bcl-2和P53均有升高，此二者启动细胞凋亡信号。

4.2 p75／NGF（神经生长因子）介导

人和大鼠的HSC表达低亲和性的神经生长因子受体p75 (NGF-R)。p75是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，也是神经营养肽家族的一种受体。NGF是它的典型配体。Trim［18］等发现在静止状态下培养的大鼠其HSC不表达 p75，在活化(7 d)和高度活化 (14 d)状态下则能检测到p75的表达，且表达数量呈进行性增加。Oakley等［19］采用原位杂交和免疫组织化学法所进行的研究表明，在四氯化碳(CCL4)诱导肝脏损伤48 h后肝脏表达NGF出现峰值，与HSC出现最大凋亡率的时间相一致，并且HSC的凋亡程度对NGF重组过程呈现剂量依赖性增加。表明肝脏发生纤维化损伤时所表达的NGF通过与位于HSC表面的低亲和力神经生长因子受体(Low affinity nerve growth factor receptor，LNGFR)P75结合，发挥调控活化HSC凋亡数量的功能。

4.3 PBR(外周苯二氮卓类受体)／PBR-L介导

线粒体渗透性转换孔道(permeability transitionlmre，PTP)包括PBR。PBR的相对分子质量为18000，位于线粒体外膜上。静止的HSC不表达PBR，HSC活化后开始表达 PBR，活化第7～9 d表达达到高峰，HSC的凋亡也达到高峰，3w后检测不到 PBR的表达，HSC因凋亡而大量消失。PBR选择性配体 1-(2-chloropheny1)-N-methyl-N(1-methylpropy1)-3-isoquinolinecarboxamide(PKIII-95)和 4'-chlorodiazazepam(Ro5-4864)呈剂量依赖性地诱导 HSC凋亡。Fischer等［20］研究表明，用选择性PBR配体PKIII95和Ro5-4864可竞争性结合PBR。PKIII95可诱导蛋白激酶 B／Akt、Bad的去磷酸化反应，并能下调凋亡抑制基因 Bcl-2水平，促进 HSC凋亡。

4.4 整合素对 HSC凋亡的调控

整合素(integrin)是一类位于细胞表面的糖蛋白受体分子家族，是介导ECM 和HSC相互作用的主要黏附受体。Iwarmto等［21］研究发现，可溶性整合素识别序列五肽GRGt-(Gly-Arg-Gly-asp-Ser)可拮抗整合素调节的原代培养的小鼠H细胞间的黏附作用，从而干扰整合素介导的HSC与ECM的相互作用，使HSC表达D53的量增加，bcl-2／bax的量下降，促使HSC发生凋亡。

4.5 相关蛋白、促凋亡物质和细胞因子对 HSC凋亡的调控［22］

肝脏损伤过程中产生的某些细胞因子参与凋亡的调控，如TNF-α和TGF-β可通过下调CD95L和p53的表达及上调bcl-xL和p21WAF1的表达减少活化星形细胞的凋亡。γ-干扰素(IFN-γ) 可抑制 HSC合成胶原和非胶原基质，还可通过热休克蛋白70(HSP70)依赖通道促进 HSC的凋亡。实验表明，TIMP-1能直接抑制激活的HSC凋亡。此作用是通过抑制MMP实现的。活化的 HSC可通过自分泌IL-10抑制I型胶原转录过程并刺激产生胶原酶而对HF产生负调控作用。此外，IL-10可通过上调 FasL和Bax的表达、下调 Bcl-2的表达促进 HSC的凋亡。肝细胞生长因子(HGF)通过减少胶原蛋白表达抑制HF。其机制可能为 HGF直接作用于HSC，使纤维化肝脏 中 HSC的结蛋白和 α-SMA mRNA表达减少。研究证实［23］，CCAAT增强子结合蛋白(C／EBPs) 与 HSC向脂肪细胞分化及去分化过程关系密切。并且该基因表达的改变与 HSC的激活有因果关系。过氧化物酶体增殖因子活化受体 (PPARγ) 在正常肝脏的静止 HSC中呈高表达，但在体内、外 HSC激活过程中呈低表达。用PPARγ 的特异激动剂(配体)15 脱氧-12，l4前列腺素J2(15 PGJ2)增强 PPARγ 的活性可以抑制体内、外HSC的增殖和 α1 (I)胶原的表达。这种抑制作用可被 PPARγ 的拮抗剂 GW9662所消除。此外，Bcl -2 家族蛋白、cyt-c、凋亡诱导因子(AIF)等都在HSC凋亡和调控中发挥着作用。

Lang等［24］研究显示，核因子κB(NF-κB)只表达于激活的HSC，能够抑制TNF-α 介导的活化 HSC所发生的凋亡， NF-κB的抗凋亡作用可能与其直接上调凋亡抑制因子、肿瘤坏死因子受体相关因子1、2(TRAF1、2)、锌指蛋白A20、超氧化物歧化酶等抗凋亡基因的表达相关。近年来的大量研究发现，活性氧(reactive oxygen species，ROS)与细胞凋亡关系密切。

Thirunavukkarasu等［25］研究发现，过氧化物可诱导大鼠HSC凋亡，并认为这种作用与其促进细胞色素C释放、使bax表达上调及增加细胞凋亡蛋白酶活性相关，其诱导的HSC凋亡可被细胞凋亡蛋白酶抑制剂DEVD-fmk、抗氧化剂维生素E和过氧化物歧化酶等所抑制。

潘勤等［26］采用荧光染色 、流式细胞术 、原位末端标记法、透射电镜技术对原代 HSC的观察表明 ，一定浓度的生长抑素(somatostatin， SST)可促进活化的 HSC凋亡，且呈明显量效关系 。

瘦素基因小干扰RNA（siRNA）表达载体可减少瘦素表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。

上述各种研究引起的凋亡机制可有效清除活化增殖的HSC，减少ECM合成，有助于肝组织结构恢复到正常状态。

5 目前针对HSC的抗肝纤维化治疗

HSC增殖和凋亡在肝纤维化的形成和逆转过程中起关键作用，抑制 HSC增殖、诱导其凋亡是抗纤维化的重要策略。由于激活的HSC是肝纤维化时ECM的主要来源细胞，以HSC为靶标的治疗措施逐渐成为抗肝纤维化的重要方法，其中主要包括抑制 HSC活化、增殖，诱导 HSC凋亡以及调节胶原合成和降解等方法。目前，抗氧化剂（如半胱氨酸、维生素E、蓬莪术酮、 碘昔芬、S-腺昔甲硫氨酸 、 硫氧还蛋白、卵磷脂等）、TGF-β拮抗剂、信号转导抑制剂、干扰素等可抑制 HSC活化的药物已应用于临床或处于试验阶段。在多靶点抑制 HSC活化的某些抗氧化剂（如腺苷蛋氨酸、小柴胡汤、水飞蓟素、复方861等）可能比单靶点药物更加有效。研究表明，α-干扰素能抑制HSC增殖和胶原合成，下调I、Ⅲ型胶原基因表达，减少I、Ⅲ型胶原沉积，但是其对胶原酶无影响。Lu等［27］的研究表明，α-干扰素可抑制HSC激活，从而达到减轻肝纤维化的目的。卡莫司他甲磺酸盐为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过减少潜在TGF-β结合蛋白的连接，促进活性TGF-β的释放，抑制HSC活化与增殖。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)能通过抑制酪氨酸磷酸化作用而抑制HSC增殖与胶原合成［6］。

中医中药治疗慢性肝炎、肝纤维化主要以活血化瘀为主，疗效显著，毒性小，显示出良好趋势。草药复方861可呈剂量依赖性地有效抑制人HSC增殖，减少星形细胞中α-SMAmRNA的表达，表明其对肝纤维化具有一定的治疗作用［28］。鳖甲煎口服液亦可通过抑制HSC的增殖达到抗肝纤维化作用［29］。研究已证实“益肝康 ”不仅有抑制HSC活化、增殖及促HSC凋亡的作用，还可通过抑制PDGF、TGF等促纤维化细胞因子的表达和加强抗脂质过氧化、促进胶原降解等作用发挥其抗肝纤维化功效［30］。Zhao等［31］研究表明，粉防己碱可抑制星形细胞激活，减少胶原累积，并可通过诱导细胞凋亡蛋白酶活性增加HSC凋亡数量。银杏叶提取物可通过抑制TIMP-1的表达及促进HSC的凋亡减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化。刘成等［32］研究证实“中药血清”能明显抑制损伤肝库普弗细胞对HSC的增殖与I型胶原产生的影响 。杨玲等［33］采用 RT-PCR法发现“抗纤软肝冲剂药物血清”能显著抑制肝星形细胞的 TGFβ1mRNA的表达。王海南等［34］研究发现，“肝纤维化大鼠药物血清”能降低TGFβ1活性。

虽然研究人员在抗肝纤维化方面做了大量的工作，已经研制了许多抗肝纤维化的药物，但多数药物研究仍局限于动物实验或细胞水平 ，应用于肝纤维化临床治疗依然任重道远。

6 展望

肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后修复过程中的炎症反应， ECM在肝内过量沉积，最终导致肝硬化。肝纤维化的形成机制非常复杂，确切机制尚不清楚。HSC作为肝纤维化发病的关键环节正在受到广泛关注。随着对肝纤维化细胞分子生物学机制的进一步研究，以HSC为靶标的治疗措施逐渐成为抗肝纤维化的重要方法。作者认为目前HSC活化、增殖引起肝纤维化以及肝纤维化的逆转机理仍未明确。深入开展肝纤维化时细胞因子、趋化因子、转录因子等对HSC调控作用机制的研究，寻找HSC激活过程中的信号转导通路，研制抑制HSC活化促进其凋亡的药物，对于预防、延缓乃至中断肝纤维化的进程具有良好前景 。

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保险感言范文第3篇

研究发现，具多向分化潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）， 脐带间充质干细胞具有无限增殖和多项分化潜能， 可以向肝细胞分化， 能在体外自我增殖， 并可以定向分化为内、中、外3 个胚层来源的多种细胞， 如骨、软骨、脂肪、神经及类肝细胞等， 有望用于肝脏疾病的治疗。脐带来源广泛，无伦理道德方面的争议。如果能够利用易于获得的MSCs在体内外定向分化为肝前体细胞，则可做为肝细胞移植的一个主要来源。不过脐血中的间充质干细胞含量很少， 如何分离纯化？如何使其较长时间保持干细胞特性？ 如何诱导其向肝细胞分化？ 据研究表明，人脐血间充质干细胞能够贴壁生长， 而体外培养的贴壁细胞是一个异质细胞群， 可能含有多种细胞成分。一般呈现类纤维细胞形态，并可分裂增生， 且同时具有间皮细胞标志的贴壁细胞， 如CD44+ 细胞， 可以初步判断为是MSCs。之前，报道HUCMSCs可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得， 并可冷冻保存； 复苏后在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4 的联合诱导下， 能定向分化为表达CK8&18， 并合成白蛋白和糖原的类肝细胞， 类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用。脐血中存在MSCs， UCBMSc 形态与MSCs相似，倍增时间为48 h ， 传代后形态基本无变化； UCBMS C 不表达CD34及CD45， 强表达CD44及CD166 ， 与MSCs的表面抗原特性一致， 是脐血中区别于造血干细胞的一群处于未分化状态的非定向干祖细胞。本研究先通过对hUCMSCs 的体外培养，对hUCMSCs进行纯化、扩增和鉴定；初步掌握hUCMSCs分离、培养及冻存的技术和方法，探索有效诱导hUCMSCs分化为肝前体细胞的途径；然后，将诱导和未诱导的hUCMSCs在体外与人肝星状细胞（HSC）共培养，为下一步研究其在体内通过不同途径移植到肝纤维化鼠体内，以观察其对肝功能的修复情况及对肝纤维化进程的影响奠定基础。

1 MSCs 体外诱导培养

任红英等[1] 尝试诱导HUCMSCs向肝细胞系分化， 诱导1周后细胞表达肝细胞特异标志物甲胎蛋白（ AFP）、白蛋白（ ALB） 诱导后的肝细胞样细胞能够分泌白蛋白， 具有一定的肝细胞功能， 且诱导后的细胞仍然低表达HLA??DR 抗原，具有低免疫原性的特点。因而认为HUCMSCs呈肝分化后，诱发同种异体免疫排斥反应的程度仍然较低。还有研究者发现在MSCs 单独培养或与肝细胞共培养体系中， 均需要有肝细胞生长因子HGF 、FGF-4 以及表皮生长因子（ EGF） 才出现肝细胞的基因表达[2]。何念海等[3]的实验结果显示UCBMS C 向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞， 表达肝细胞分化的早期标志GATA4 ，CK19和AF P ， 再分化为成熟肝细胞， 表达肝细胞的晚期标志HNF l a ， HNF 3 β ， CK18 和ALB。UCBMSC 在诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。体外一定条件下利用2 步法可诱导成具有肝细胞形态和功能的肝细胞样细胞。第1 步， MSCs 在IMDM 培养基， 内含H GF、bFGF、烟碱中培养7 d。第2 步， 在IM DM 的培养基中加入制瘤素M（ o ncostatin M） 、地塞米松以及ITS+ 的混合物中培养。2 周后培养的MSCs 逐渐出现肝细胞样形态， 随着诱导时间的延长， 细胞质中出现丰富的颗粒物质， 并能持续保留至12 周。2 周时甲胎蛋白（ AFP） 、葡萄糖-6-磷酸酶（ Gluco se-6-pho sphatase） 出现表达， 酪氨酸氨基转移酶 （ty rosine-aminotr ansfer ase） 于4 周开始表达。CK18、白蛋白（ ALB） 以及色氨酸2， 3-过氧化物酶（ tr yptophan 2， 3-dio xy genase） 在培养期间均能检测出。此外， 细胞色素P4502B6、肝细胞核因子-4（ HNF-4） 的表达分别在第4 周和第6 周检测出。功能实验， 肝细胞样细胞还能摄取低密度脂蛋白（ LDL） ， 4 周后贮存糖原， 6 周后合成尿素， 并呈时间依赖方式递增， 胆小管抗原9B2 呈阳性。用此二步法诱导肝细胞样细胞有几点优势： （ 1） 增加细胞来源； （ 2） 过程简单； （ 3） 细胞寿命长；（4） 数量充足； （ 5） 所需时间短。有研究者将诱导培养后的MSCs 消化洗净， 用无血清的DMEM 培养基加0. 05%的牛血清ALB 培养24h， 收集培养的上清液， 用超滤方式浓缩25 倍成为MSCs 的条件培养基（ MSC??CM）[5]。应用此MSC??CM 可减轻由D??半乳糖胺（ D??g alacto sam ine） 诱发的大鼠暴发型肝炎的肝细胞坏死， 减轻肝细胞的凋亡（ 能使凋亡的细胞减少90%） ， 促进受体鼠肝细胞的再生（ 使再生速度增加3 倍） ， 小鼠生存时间明显延长。

保险感言范文第4篇

【摘要】 目的 旨在证实ATP敏感性钾通道（KATP）的开放和内源性一氧化氮合成酶（iNOS）表达上调介导了腺苷(ADO)预处理的延迟保护。方法 实验动物随机分成4组，对照组：心肌缺血前24 h静注生理盐水；ADOA1受体激动剂（CCPA）组：心肌缺血前24 h静注CCPA进行药物预处理；格列苯脲（Gli）组：心肌缺血前30 min静注Gli；CCPA/Gli组：在CCPA组处理的基础上，心肌缺血前30 min静注Gli。采用家兔离体工作心脏模型，各组心肌均缺血30 min，复灌30 min。观察缺血/再灌注前后血流动力学和心功能变化。测定再灌注后冠脉流出液乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CPK）、一氧化氮(NO)和心肌组织三磷酸腺苷（ATP）含量。用氯化三苯基四氮唑(TTC)判断心肌梗死范围。逆转录酶链聚合法测定iNOSmRNA。结果 ①CCPA预处理明显改善心肌缺血/再灌注后心功能的恢复，且这种保护作用被Gli阻断；②CCPA预处理减少心肌缺血/再灌注后冠脉流出液LDH、CPK含量，且Gli可抑制这种保护效应；③CCPA预处理可缩小心肌梗死范围，且被Gli阻断；④CCPA预处理可增加心肌组织ATP浓度，Gli可拮抗这种保护作用；⑤CCPA预处理轻度提高心肌组织NO浓度，此效应不受Gli影响；⑥CCPA预处理上调心肌组织iNOS表达，此效应不受Gli拮抗。结论 iNOS合成的NO通过激活KATP介导ADO预处理的延迟保护效应。

【关键词】 腺苷受体；再灌注损伤；延迟保护

心肌短暂缺血后不仅具有即刻的保护作用，同时具有延迟保护〔1〕。腺苷(ADO)及其受体参与了预处理的早期保护作用，同时也是延迟保护的重要介质〔2〕。KATP阻滞剂5羟基癸酸(5hydroxydecanoate，5HD)可以拮抗ADO预处理带来的心肌保护作用〔3〕。KATP是单磷酰脂A(MLA)预处理诱导心肌延迟保护的主要内在机制。本文拟利用外源性ADO A1受体激动剂预处理家兔以模拟缺血预处理的心肌延迟保护效应，探讨ADO预处理心肌延迟保护的受体后机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

清洁级家兔48只，体重2.5～3.5 kg，雌雄不限。ADOA1激动剂2氯6氮环戊烷基ADO(CCPA) (美国Simga公司)；Trizol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；RTPCR按照试剂盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物购自Promega公司；其他试剂均为国产分析纯。Newport全自动呼吸机和心输出量检测仪，美国；低温离心机Biofuge22R，德国Heraeus公司；超速离心机，Beckman公司；LKB1251生物发光仪和可见紫外分光光度计，上海分析仪器厂。

1.2 动物模型

耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)将兔麻醉后，用肝素500 U/kg抗凝。迅速开胸取出心脏置入改良KrebsHenselert液中，行主动脉和左心房插管，置于灌注架上，以95%O2和5%CO2饱和的KrebsHenselert液经主动脉行Langendorff逆行灌注，温度37℃，灌注压10 kPa。经左心室壁插入压力探头，经压力换能器连接于多道生理记录仪。 Langendorff灌注10 min 后转为工作心状态，即经左房灌注(压力为1.995 kPa)。平衡灌注15 min后，钳闭左心房插管造成全心缺血30 min，然后恢复灌注30 min。灌注完毕，心脏以及再灌注30 min时冠脉流出液标本置-70℃保存。

1.3 实验分组

实验动物随机分为4组：对照组(n=12)：心肌缺血/再灌注24 h前静注生理盐水0.5 ml作为对照；(2)CCPA组(n=12)：心肌缺血/再灌注24 h前静注CCPA(0.1 mg/kg)作为药物预处理；Gli组(n=12)：心肌缺血/再灌注开始前30 min静注Gli(0.3 mg/kg)；CCPA/Gli组(n=12)：CCPA预处理(同第二组)的基础上，在心肌缺血/再灌注开始前30 min静注Gli(0.3 mg/kg)。灌注结束后，各组取6只家兔用于心肌梗死范围测定，另6只用于其他观察指标的测定。各组于平衡灌注15 min时测定血流动力学指标作为基础值，测定再灌注末相关指标为实验值。

1.4 观察指标

1.4.1 血流动力学参数测定

心脏跳动稳定后，记录心率(HR)、冠脉流量(CF)、心输出量(CO)、左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室收缩期峰压(LVSP)。以停灌前工作心功能基础水平为100%，比较复灌末心功能恢复的百分率。

1.4.2 心肌梗死范围测定

灌注结束后，从左心室导管推注2%～3%Evans蓝2～3 ml，2 min后迅速取下心脏，分离缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，将缺血心肌以滤纸吸干，置于天平上称重。再将缺血区水平切成5～6片，每片厚1～2 mm，置入1%TTC磷酸缓冲液(pH7.4)中37℃水浴10～15 min。缺血危险区因脱氢酶还原TTC 而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。

1.4.3 心肌组织超微病理分析

灌注结束后，从心尖部缺血中心边缘区切取1 mm3全层心肌组织数块，放入0.1 mol/L的磷酸戊二醛溶液内(pH7.4)固定，1%锇酸后固定，按电镜要求逐级酒精脱水、EPON812定向包埋、LKBV型超薄切片机切片。醋酸双氧铀及柠檬酸双重染色，用OPTON EM10C型透射电子显微镜观察心肌超微结构并摄片。

1.4.4 心肌损伤指标

收集复灌后30 min的心脏冠脉流出液，取标本2 ml，冷冻储存，24 h内送检。使用全自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)浓度，计算30 min的心肌CK和LDH漏出率，CK(LDH)漏出率=CK(LDH)(U/L)×30 min流出液(L) /心肌总湿重(g)。

1.4.5 心肌组织ATP含量

灌注结束后取左心室心尖部全层心肌组织100 mg，吸干水渍后迅速置入液氮内保存。测定时称重，心肌组织加0.3 mol/L高氯酸0.5 ml冰浴下制成心肌匀浆，吸出组织液置入离心管中，再加0.3 mol/L高氯酸1.5 ml仔细冲洗匀浆器，将此冲洗液加入离心管中，于低温离心机内离心5 min(4 000 r/min)后提取上清倾入另一干净离心管中。用0.5 mol/L KOH调pH至7.6～7.8，再次离心提取上清，在6 h内用荧光素酶法在LKB1251生物发光仪上测定ATP浓度。

1.4.6 冠脉流出液中NO含量的测定

按Griess法测定NO，①取三支试管，空白管加去离子水0.4 ml和Griess试剂A 0.4 ml，测定管加样品0.4 ml和Griess试剂A 0.4 ml，标准管加标准应用液0.4 ml和Griess试剂A 0.4 ml，混匀，室温放置5 min后分别加Griess试剂B 0.4 ml。②混匀，室温放置5 min，选择波长546 nm，空白管调零比色，读取吸光度值。③结果计算：样品NO-2浓度(μmol/L)=测定管吸光度/样品管吸光度×2.5。

1.4.7 iNOS mRNA检测

用Trizol RNA提取试剂盒对保存在液氮中的心肌组织总RNA进行抽提与纯化，然后逆转录为cDNA。RTPCR按照试剂盒说明书进行操作，采用50 μl反应体系。反应条件：94℃变性4 min；94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 40 s，循环35次；最后72℃延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像系统上摄像并分析各条带吸光度值(基因表达值=目的基因/内参照)。本实验设定βactin为内参照。iNOS基因引物序列如下：正义链5′AGCATCACCCCTGTGTTCCACCC3′；反义链5′TGGGGCAGTCTCCATTGCCA3′，扩增片段为218 bp。βactin的引物序列如下：正义链5′GAGCACCCCGTGCTGCTCACCCTAGG3′，反义链5′GTGGTGGTGAAGCTGTAGCCACGCT3′，扩增片段为160 bp。

1.5 统计学分析

数据以x±s表示，非正态分布数据先行对数处理，用SAS软件包做ANOVA及q检验。

2 结 果

2.1 血流动力学

CCPA组家兔HR、CF恢复率与对照组比较无统计学差异(both P＞0.05)，而CO、LVSP和LVEDP的恢复明显好于对照组(P＜0.01)，提示ADOA1激动剂CCPA预处理能促进家兔心脏缺血/再灌注后心脏收缩和舒张功能的恢复。CCPA/Gli组家兔心功能恢复明显不及CCPA组(P＜0.01)，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，而单用Gli组心功能恢复与对照组比较也无显著差异(P＞0.05)，说明Gli本身不影响缺血/再灌注后的心功能恢复，但其可抑制CCPA对心脏收缩、舒张功能的保护。见表1。表1 各组家兔灌注末血液动力学恢复率(略)

2.2 心肌梗死范围

CCPA预处理组家兔心肌梗死范围明显＜对照组(13.4%±2.3%vs 32.1%±4.5%，P＜0.01)，提示CCPA预处理可限制因缺血/再灌注引起的心肌梗死。CCPA/Gli组家兔心肌梗死范围＞CCPA组(30.2%±4.9%，P＜0.01)，与对照组无显著差异(P＜0.01)，而单用Gli组与对照组比较也无显著差异(34.7%±5.4%，P＞0.05)，说明Gli本身不影响家兔心脏的心肌梗死，但可抑制CCPA限制心肌梗死的范围。

2.3 心肌细胞超微结构的改变

正常心肌组织电镜下心肌肌原纤维排列整齐，肌丝清晰；线粒体结构完整，无肿胀和空泡样变性；线粒体间糖原颗粒丰富；细胞核和核仁显示良好，呈黑色。对照组心肌组织肌原纤维排列紊乱，肌丝溶解消失，肌浆网扩张；线粒体肿大、嵴断裂、溶解和空泡样变性；线粒体间糖原颗粒少；细胞核异形变、染色质边集、核内空泡样变和核膜模糊。CCPA组家兔心肌细胞的超微结构改变的损伤较轻。见图1。

2.4 心肌细胞膜损伤

缺血/再灌注对心肌细胞膜的损伤以LDH和CK从心肌细胞的漏出来衡量。CCPA组家兔冠脉流出液LDH和CK的含量明显低于对照组(P＜0.01)，提示ADOA1激动剂CCPA预处理能减轻家兔心脏的缺血/再灌注损伤。CCPA/Gli组家兔LDH和CK的漏出较CCPA组高(P＜0.01)，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)(P＜0.01)，而单用Gli组与对照组比较也无显著差异(P＞0.05)，说明Gli本身不影响缺血/再灌注损伤过程，但可抑制CCPA对心肌细胞膜的保护作用。见表2。表2 各组心肌细胞膜损伤比较(略

)

2.5 心肌组织ATP

CCPA预处理组家兔心肌组织ATP含量明显高于对照组(P＜0.01)，提示ADOA1激动剂CCPA预处理可减少家兔心脏因缺血/再灌注引起的ATP消耗。CCPA/Gli组家兔ATP含量低于CCPA组(P＜0.01)，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，而单用Gli组与对照组比较也无显著差异(P＞0.05)，说明Gli本身不影响缺血/再灌注损伤过程，但可抑制CCPA对心肌细胞能量消耗的保护作用。见表2。

2.6 冠脉流出液NO含量

本文以冠脉流出液NO代表心肌组织中的NO水平。CCPA预处理组家兔心肌组织NO含量略高于对照组(31.4±5.3 vs 24.6±3.3，P＜0.01)；CCPA/Gli组家兔NO含量高于对照组(30.3±4.9，P＜0.01)，与CCPA组比较无统计学差异(P＞0.05)；单用Gli组与对照组比较无显著差异(25.3±3.7，P＞0.05)，这些结果说明Gli不影响家兔心肌缺血/再灌注时心肌组织NO的合成，而CCPA促进NO的合成。

2.7 心肌组织iNOS mRNA的表达

RTPCR法检测了各组家兔心肌组织iNOS mRNA的含量。内参照βactin的扩增产物在各组均相同，因此各组iNOS mRNA表达的差异与RNA提取过程和逆转录过程中RNA的用量无关。结果发现CCPA组心肌组织iNOS mRNA含量高于生理盐水对照组(1.68±0.22 vs 0.96±0.17，P＜0.01)；CCPA/Gli组iNOS mRNA的表达与CCPA组比较无统计学差异(1.71±0.20，P＞0.05)；单用Gli组与对照组比较无显著差异(0.91±0.12，P＞0.05)，这些结果说明CCPA可上调缺血/再灌注心肌组织iNOS的表达，而Gli对iNOS的表达无影响。

3 讨 论

3.1 ADO与延迟保护

ADO通过持久扩张冠脉，改善心肌供氧，促进葡萄糖内流，补充细胞内高能磷酸键池，增强心脏功能，并拮抗儿茶酚胺，使失衡的氧供需和能量代谢重新恢复平衡。此外，ADO还具有抑制内皮素的释放，防止血小板聚集，升高心肌细胞SOD的含量。缺血预处理使心肌在随后持续缺血/再灌注中，对内源性ADO的敏感性增高，ADO受体数目增多并呈高亲和状态，从而增强内源性ADO的作用〔4〕。Baxter等研究发现〔5〕：CCPA(0.1 mg/kg)预处理家兔心脏后24～72 h均可产生心肌保护作用，降低心肌梗死范围约50%。本实验观察到 CCPA预处理的家兔在随后第24小时的缺血/再灌注中尚能产生明显的心肌保护作用，包括缩小心肌梗死范围和促进缺血后心功能的恢复，产生明显的心肌保护作用。

3.2 KATP与延迟保护

KATP的开放具有对抗心肌缺血、缺氧的效应，且ADO的心肌保护作用大多由KATP介导完成。近来研究表明，KATP开放不但介导了ADO预处理的早期保护作用，还同时具有延迟性保护作用〔6，7〕。KATP阻滞剂5HD可消除ADO预处理带来的心肌保护作用。在本实验中，观察到KATP阻断剂Gli可拮抗CCPA预处理诱导的家兔心脏延迟保护作用，提示KATP参与了ADO预处理延迟保护作用的受体后信号转导，或者说KATP是ADO预处理延迟保护作用的效应子。目前多认为线粒体膜KATP的开放在心肌保护中起主要作用〔8〕。细胞膜KATP的特异阻断剂不能抑制预处理的保护作用，而较低浓度开放剂(仅能激活线粒体膜KATP)能诱导心肌的保护作用。

3.3 NO与延迟保护

缺血预处理后小鼠心脏的iNOS基因的表达轻度上调，且其延迟保护效应与NO合成有关。本实验中观察到iNOS在生理盐水组家兔心脏得到表达，且在 CCPA预处理后的家兔中的表达有所上调，而Gli组iNOS的表达水平与生理盐水组无明显差异，提示选择型ADOA1受体的活化可上调iNOS的表达。由于以往的研究多认为iNOS合成的NO可与氧反应生成氧自由基，对心肌组织产生毒性作用〔9〕。其可能原因有：①NO本身对心肌具有保护和毒性的双重作用；②CCPA诱导iNOS的表达仅轻度上调，而NO的毒性作用多在其过度增多有关；③CCPA诱导iNOS表达上调的同时可能促进SOD的合成，因而可以清除NO生成的氧自由基〔10〕。

3.4 KATP和NOS的关系

本研究采用CCPA模拟家兔缺血预处理的延迟性保护，发现NOS和KATP均在其中扮演了重要角色。研究表明，NO能升高细胞内第二信使cGMP水平，然后由cGMP依赖性蛋白激酶激活KATP，触发心肌保护〔11〕。CCPA诱导iNOS表达上调，从而激活KATP以介导延迟性保护，这一细胞内的信号转导通路尚不完全明确，可能与转录因子NFκB有关。

参考文献

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3 Konno T，Uchibori T，Nagai A，et al.2(1Hexyn1yl)adenosineinduced intraocular hypertension is mediated via K+ channel opening through adenosine A2A receptor in rabbits〔J〕.Eur J Pharmacol，2005;518(23):20311.

4 Solenkova NV，Solodushko V，Cohen MV，et al.Endogenous adenosine protects preconditioned heart during early minutes of reperfusion by activating Akt〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;290(1):4419.

5 Baxter GF，Yellon DM.Time course of delayed myocardial protection after transient adenosine A1receptor activation in the rabbit〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，1997;29(5):6318.

6 Testai L，Rapposelli S，Calderone V.Cardiac ATPsensitive potassium channels：a potential target for an antiischaemic pharmacological strategy〔J〕.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2007;5(1):7990.

7 王萌炜，吴 伟.对KATP通道介导缺血预适应心肌再灌注损伤的研究〔J〕.中国老年学杂志，2007；27(4):3235.

8 Mubagwa K，Flameng W.Adenosine，adenosine receptors and myocardial protection：an updated overview〔J〕.Cardiovasc Res，2001；52(1):2539.

9 Kim SJ，Zhang X，Xu X，et al.Evidence for enhanced eNOS function in coronary microvessels during the second window of protection〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007；292(5):21528.

保险感言范文第5篇

【摘要】在肿瘤的基础与临床研究中，一个倍受关注的课题是对于放射性和化疗药物抗拒的肿瘤干细胞的研究。2003年《PNAS》上发表了以CD44+/CD24-为标志从乳腺癌病灶中分离出乳腺癌干细胞，具有这种标志的细胞仅需200个就可在SCID/NOD小鼠身上形成肿瘤，而其余标志的细胞则达上万个亦不能在SCID/NOD小鼠身上形成肿瘤。

【关键词】乳腺癌干细胞、侵袭、转移、化疗、放疗

［1］肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在一小部分的具有干细胞特性的细胞，具有自我更新、无限增殖和多向分化三大特征，在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性作用。［2］乳腺癌中表型为CD44+/CD24-/low的细胞被认为是乳腺癌的肿瘤干细胞，这群细胞有更强的侵袭、转移能力，能耐受常规的放化疗，是乳腺癌患者复发和转移的主要原因。

1 乳腺癌干细胞的生物学特征

［3］Sheridan等对13种乳腺癌细胞系研究发现，乳腺癌干细胞CD44＋CD24-的比例与肿瘤细胞系的侵袭能力正相关，而且比例高的细胞系表达更高水平的促侵袭相关基因。更有意义的是作者从TMD-436 乳腺癌细胞中分离出CD44＋CD24-乳腺癌干细胞与CD44＋CD24＋非乳腺癌干细胞，发现前者体外侵袭能力更强，促侵袭基因IL-8表达水平更高。［4］Marija Balic发现在乳腺癌早期骨转移的微转移灶中含有比例更高的乳腺癌干细胞（CD44+/CD24-），平均高达72%，而相应的原发灶中此种乳腺癌干细胞比例小于10%，支持乳腺癌干细胞在乳腺癌早期的转移中发挥关键作用。从MDA-MB-231乳腺癌细胞形成的脑转移灶细胞株中分离出两群细胞：CD44+/CD24-乳腺癌干细胞和CD44-/CD24+非乳腺癌干细胞，将他们分别注射到小鼠心脏里，28天后取出小鼠的大脑观察形成的微转移灶和大体转移灶的个数，发现接种乳腺癌干细胞的小鼠平均形成微转移灶和大体转移灶的个数分别是59.4个和29.9个，而接种非干细胞组小鼠平均形成微转移灶和大体转移灶的个数分别是44.5个和16.2个。

2 乳腺癌干细胞对临床放化疗的抗拒

［5］Li发现经过化疗后乳腺癌干细胞的比例从化疗前的1%升高到化疗后的3035%，通过化疗虽然杀伤了大部分的乳腺癌细胞，但是对化疗药物抗拒的乳腺癌干细胞却存活了下来，成为以后乳腺癌复发的根源。赫赛汀是临床上常用的用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌患者的分子靶向药物，但是很多乳腺癌患者在开始靶向治疗的一年后就产生了抵抗性，［6］Bedard 的研究认为这一抗药性是由于乳腺癌干细胞的作用造成的，乳腺癌干细胞表面CD44与 hyaluron的相互作用封闭了赫赛汀与相应受体的作用位点，使乳腺癌干细胞得以存活下来，最终导致乳腺癌的复发转移。［7］Phillips研究认为乳腺癌细胞系MCF-7在无血清悬浮培养条件形成的乳腺癌微球体(富含CD44+/CD24-)与贴壁培养的MCF-7相比，经过2GY放射剂量照射后形成的克隆更容易存活，两者的中位存活率相差近20%。［8］Yin的研究发现乳腺癌干细胞较非乳腺癌干细胞显示出明显的放射抗拒，在剂量为2GY时从乳腺癌患者肿瘤组织中分离出的乳腺癌干细胞与非乳腺癌干细胞的生存比率分别是0.47和0.27。

肿瘤是一种多基因变化引起的疾病，所以引起乳腺癌的乳腺癌干细胞必然受到多种基因的调控， ［9］2007年新英格兰医学杂志上发表了关于CD44+CD24-乳腺癌干细胞与正常乳腺上皮细胞基因差异表达的文章，作者的研究发现与正常乳腺上皮细胞相比，乳腺癌干细胞有186个基因的表达有显著差异，并且将这些基因命名为“侵袭性”基因信号，与乳腺癌患者的总生存率和无转移生存率做了关联性分析，结果发现：乳腺癌患者的IGS状态与总生存率和无转移生存率有关，并且两者之间的相关性是独立于肿瘤大小及淋巴结状态的。IGS阳性的乳腺癌患者的10年总体生存率为和无转移生存率分别为62％和54％，而IGS阴性的乳腺癌患者这两个数据分别是98％和82％。作者最后阐明这些侵袭性基因主要是参与肿瘤形成，肿瘤细胞的分化、凋亡等过程的基因。

参考文献

［1］ Weissman IL. Stem cells: units of development, units of regeneration and units in evolution［J］．Cell,2000

［2］ Al-Hajj M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］. PNAS2003

［3］ Carol Sheridan et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis［J］. Breast Cancer Research 2006

［4］ Marija Balic et al. Most Early Disseminated Cancer Cells Detected in Bone Marrow of Breast Cancer Patients Have a Putative Breast Cancer Stem Cell Phenotype［J］. Clin Cancer Res 2006.

［5］ Li X, et al Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy［J］. J Natl Cancer Inst,2008

［6］ Bedard PL. Stemming resistance to HER-2 targeted therapy［J］. J MGBN,2009

［7］ Phillips et al. The response of CD24(-/low)CD44+ breast cancer initiating cells to radiation［J］. J Natl Cancer Inst,2006

［8］ Yin H,. The Phenotypic Radiation Resistance of CD44+/CD24-or low Breast Cancer Cells Is Mediated through the Enhanced Activation of ATM Signaling［J］. PLoS ONE6(9): e24080.