音标学习计划

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音标学习计划范文第1篇

【关键词】 高血压 趋化因子 单核细胞 基因表达 逆转录聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定

原发性高血压（essential hypertension，EH）是常见的心血管疾病，也是导致心脑血管疾病的重要危险因素。近年来，越来越多的学者认为EH是一种与遗传、环境、代谢极为相关的复杂疾病[1～3]，当EH与其他相关危险因素并存时，单纯的血压控制只能使不到60%的患者获益，而危险因素的干预才能获得更大的益处。因此，积极探讨EH的发病机制及其影响因素，对更有效的控制EH，减轻其危害已成为医务工作者的共识。有学者研究发现，炎症可能在EH的发病机制中起着重要的作用[4]，2007年2月～12月实验检测EH患者外周血单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic protein1，MCP1）蛋白水平及单个核细胞MCP1 mRNA的表达，探讨外周血MCP1的变化与EH的关系。

1 对象与方法

1.1 对象及分组

按《中国高血压防治指南（2005年修订版）》[5]制定的标准，选取心血管科住院和门诊新诊断或未经正规降压治疗的EH患者62例，同时选取血压正常的30例健康体检者作为对照组。排除继发性高血压、血栓出血性疾病、糖尿病、高脂血症、感染、严重肝肾疾病、自身免疫性疾病及肿瘤性疾病，排除近期有手术或外伤史等影响MCP1的因素。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液（上海捷瑞），Trizol试剂（美国Invitrogen），焦炭酸二乙酯（瑞兴），逆转录试剂盒（Promega），PCR试剂盒（Promega），100 bp DNA Ladder Marker、D2000 DNA Marker（天根生化），人MCP1 ELISA 试剂盒（美国R＆D公司）；ULT13863三洋-80 ℃低温冰箱(日本)，5745台式冷冻离心机(德国)，Eppendorff centrifuge 5810R 高速离心机，Amersham核酸蛋白分析仪，PCR仪（PE geneAmp PCR System 2400）（Perkin Elmer），DNA成像分析仪（Gel Doc EQ，BioRad），酶标仪（ELx800，BioTek公司）。MCP1引物设计由上海生工合成，上游引物5' AGGAAGATCTCAGTGCAGAGG 3'，下游引物5' – AGTCTTCGGAGTTTGGGTTTG 3'；βaction：上游引物5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT 3'，下游引物5'GGGCACGAAGGCTCATCATT 3'。

1.2.2 标本采集 受检者空腹12 h，于次日清晨6∶00～7∶00采集肘正中静脉血8 ml，其中4 ml置普通生化管中，室温静置2 h，自然凝固后予离心10 min，1 000 r/min收集上清液置于-80℃冰箱保存待测；另4 ml置于EDTA抗凝试管中摇匀后即刻置40 ℃冰箱冷存，于6 h内提取RNA用。

1.2.3 外周血MCP1蛋白含量测定 用保存待测的血清，依照MCP1 ELISA试剂盒说明书的步骤操作。用酶标仪检测450 nm波长下各孔吸光度，根据吸光度值计算标本中MCP1的浓度。

1.2.4 人血单个核细胞中RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RTPCR） 淋巴细胞分离液提取外周血中单个核细胞后，按照说明书的步骤提取总RNA；按逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA，并用PCR技术扩增目的片段，PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶跑电泳，溴乙锭显色。测定各条带灰度值，以βactin为内参，用MCP1与βactin的灰度比值定量MCP1。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行数据分析处理，数据以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 一般资料

EH组及对照组的一般资料见表1。两组研究对象的年龄、性别、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、空腹血糖和外周血白细胞比较，无统计学差异。表1 EH组及对照组的基本资料注：TC示总胆固醇，TG示甘油三酯，FBG示空腹血糖，LDL示低密度脂蛋白，HDL示高密度脂蛋白，WBC示白细胞。

2.2 MCP1水平及MCP1 mRNA表达

见表2。与对照组比较，EH组外周血MCP1蛋白水平及单个核细胞MCP1mRNA表达均显著增高（P＜0.01)。表2 外周血MCP1水平及单个核细胞MCP1mRNA表达注：（1）与对照组比较， P＜0.01。

3 讨论

EH是最常见的心血管疾病之一。传统观念认为，EH是多种因素引起的血液流变学异常，表现为心搏出量和（或）外周阻力增加，治疗目标也仅限于用药物控制血压。随着对EH发病机制的深入研究，发现在EH发生发展的不同阶段，血管炎症是一个主要的、共同的病理特征，提示EH与炎症关系密切[6]。

MCP1为碱性蛋白，属于趋化因子超家族，可由炎症介质刺激的单核-巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞分泌。MCP1在体内及体外均有强大的诱导单核-巨噬细胞聚集、附壁、游走的功能，是炎症的始动因子及标志[7]。研究发现，原发性高血压患者外周血MCP1蛋白含量升高，认为EH可能是一种慢性炎症过程[8]。本研究显示，EH患者外周血MCP1蛋白水平显著升高，提示MCP1可能参与了EH的病理生理过程。因此，积极探索控制炎症的方法可能是高血压乃至冠心病具有前景的治疗策略之一。

EH患者外周血MCP1升高的机制尚不十分明了，可能来源于与内皮细胞、血管平滑肌细胞等上调表达MCP1 mRNA有关，但外周血MCP1蛋白的升高是否与外周血单个核细胞中MCP1 mRNA表达上调有关尚未见报道。本研究显示，与对照组比较，单纯EH组外周血单个核细胞中MCP1 mRNA表达显著增高，提示外周血单个核细胞的MCP1 mRNA表达上调可能是导致EH患者外周血MCP1蛋白含量升高的一个因素，但是否与内皮细胞等其它因素有关，需进一步实验证实。由于MCP1蛋白可能进一步激活CCR2趋化因子受体，介导趋化活性，使单核细胞和巨噬细胞发生移行，黏附于血管内皮细胞，进一步损伤血管内皮[9]，使其产生更多的炎症因子，加速血管重构，使血管壁顺应性下降，从而使血压升高。因此，针对炎症的治疗，或许对控制血压有一定意义。

参考文献

[1]Lillie EO，Daniel T，Connor O.Early phenotypic changes in hypertension: a Role for the autonomic nervous system and heredity[J].Hypertension，2006(3): 331 - 333.

[2]Bergvall N，Iliadou A，Jodansson S，et al.Genetic and shared environmental factors do not confound the association between birth weight and hypertension:a study among Swedish twins[J].Circulation， 2007(115):2931-2938.

[3]Schillaci，M. Pirro，G. Vaudo， M， et al.Metabolic Syndrome Is Associated With Aortic Stiffness in Untreated Essential Hypertension[J].Hypertension，2005(6): 1078 - 1082.

[4]Sesso H， Buring J， Rifai N， Blake G， et al.Creactive protein and the risk of developing hypertension[J]. JAMA， 2003(290):2945-2951.

[5]刘力生，龚兰生.中国高血压防治指南[M].北京：人民卫生出版社，2005：10-12.

[6]Li JJ， Fang CH， Hui RT.Is hypertension an inflammatory disease[J].Med Hypotheses， 2005(64):236-240.

[7]De Lemos JA，Morrow DA，Sabatine MS，et al. Association between plasma levels of monocyte chemoattractant protein1 and longterm clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes [J]. Circulation， 2003(107):690-695.

音标学习计划范文第2篇

【摘要】 目的 构建细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组表达质粒ferritin/pET-28a，表达、纯化出重组蛋白，并对重组蛋白的免疫学特性进行初步研究。方法 将目的基因亚克隆至表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG对其进行诱导表达。通过Ni2+的His-bind树脂柱纯化出重组蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，获得抗血清，通过western-blot及ELISA对重组铁蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果 表达并纯化出分子量约19kD重组铁蛋白，western-blot显示重组蛋白免疫制备的抗血清可识别纯化的重组蛋白及抗原囊液、原头蚴，位置大致相同，约19kD。ELISA结果显示实验组小鼠与对照组小鼠血清中IgG的OD值有统计学意义(P＜0.01)。结论 细粒棘球蚴重组铁蛋白Eg.ferritin具有较好的抗原性及免疫原性，具有成为包虫疫苗候选分子的潜能。

【关键词】 细粒棘球蚴；重组铁蛋白；纯化；免疫特性

铁蛋白(ferritin)是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基蛋白，其作用是储存铁，对生物体内铁含量进行调控，在生物体内铁含量过多时起到解毒作用［1-2］，它的存在保证了生命体的正常活动。本实验中心已构建了重组表达质粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重组蛋白ferritin/GST以包涵体形式存在于细胞中，无法通过亲和层析柱纯化出单一的Eg.ferritin［3］。只能通过切胶纯化的方法获得融合蛋白Ferritin/GST，虽然试验结果说明该融合蛋白具有较好的抗原性及免疫原性，但影响蛋白特性的因素较多，不能很好的反映蛋白的实际特性，因此本次试验将铁蛋白基因重组到表达质粒pET-28a中，pET-28a是个高效表达载体，能纯化变性及非变性的蛋白，通过表达纯化可获得较纯的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，为铁蛋白能成为包虫病候选疫苗提供依据。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌种 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表达载体购自Novagen公司。

1.2 试剂 T4连接酶、限制性内切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自Promega公司；β-巯基乙醇、二甲基亚砜、弗氏完全(不完全)佐剂、过硫酸铵、Tween-20等试剂购自于SIGMA公司；考马斯亮蓝购自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物购自OXOID公司；蛋白预染Marker购自北京赛百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚购自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、质粒DNA提取试剂盒等购自北京华美公司；DNA纯化回收试剂盒购自北京赛百盛生物有限公司；标准蛋白分子量Marker 购自中国科学院上海生物化学研究所；含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒购自Novagen公司；其它常用试剂为国产分析纯。

1.3 实验动物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.4 Eg.ferritin/pET-28a重组质粒的构建及鉴定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株划板接菌［4］，并挑单个菌落进行培养，通过碱裂解法提取重组质粒；同时取适量的表达载体pET-28a，将两者分别用BamH I，Not I进行双酶切处理，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离带有双黏性末端的目的片段和表达载体，切胶，经DNA回收试剂盒纯化目的片段及载体。目的片段与表达载体在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜。继而将连接产物转化到已制备好的感受态菌BL21(DE3)plysS中［5］，经含卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB固体培养基筛选阳性菌株［6］。挑取阳性菌株含卡那霉素的LB培养基中振荡培养，经质粒提取试剂盒纯化重组质粒，用限制性内切酶BamH I，Not I进行酶切鉴定。

1.5 重组铁蛋白的表达、纯化

1.5.1 重组蛋白的表达 将重组菌接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的3mL 的LB培养基中，37℃ 200 r/min 振荡培养数小时，按1∶50接种于50mL培养基中，37℃，220 r/min，培养至OD600=0.5时，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，继续振荡培养6h，4℃ 4000r/min 离心15min，弃上清，收集细菌沉淀，SDS-PAGE观察表达情况。

1.5.2 表达产物的鉴定 将样本与2×SDS-PAGE样本缓冲液混合，经12% SDS-PAGE，180V电压，电泳至溴酚兰指示剂到胶底为止，用0.2%考马斯亮蓝R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脱色液脱色至本底无色。

1.5.3 重组抗原的纯化及制备 对细胞进行裂解，发现重组蛋白以包涵体的形式存在，按照Novagen公司His-bind树脂纯化试剂盒说明书中的包涵体大量纯化方法进行纯化，然后将纯化好的包涵体蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。

1.6 动物免疫及特异性抗血清的制备

1.6.1 动物免疫 ICR小鼠分两组，即免疫组与对照组，每组10只。1)免疫组每只注射弗氏佐剂与重组抗原Eg.ferritin的乳化剂50μg/100μL。对照组注射弗氏佐剂和PBS的乳化剂100μL。根据Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝胶分析系统对纯化的抗原进行定量。2)免疫方法 每组小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基础免疫用弗氏完全佐剂，以后2次为加强免疫均用弗氏不完全佐剂。采用背部皮下多点注射免疫，每次注射量为100μL/只。分别于0、2、4、6周断尾采血，共4次，8周眼眶取血并处死小鼠。

1.6.2 特异性抗血清的制备 将血液4000r/min 离心 10min，提取血清，-20℃保存。

1.7 血清特异性识别 纯化的重组抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原头蚴通过10%分离胶及5%的浓缩胶，180V电压下进行SDS-PAGE电泳 1h。在30mA下对硝酸纤维膜进行印迹转移1h。然后将硝酸纤维膜浸入5%的脱脂奶粉溶液中，37℃ 封闭1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再将硝酸纤维膜剪开分别浸泡于1∶100稀释的Eg.ferritin免疫的特异性小鼠抗血清及对照组鼠血清中，4℃ 过夜。次日将膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后与1∶1000稀释的羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)结合，37℃反应1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的H2O2)37℃显色5min，最后用蒸馏水冲洗终止反应。

1.8 抗血清中IgG的测定 采用ELISA法，用纯化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶标板100μL/孔，4℃过夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封闭100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫组及对照组小鼠血清作为一抗，按1∶100稀释，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG为二抗，按1∶1000稀释，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入显色剂100μL/孔，待对照孔显色时，加入2M H2SO4 50μL/孔 终止反应。以包被抗原及进行牛奶封闭的孔为空白调零，置酶标仪450nm波长处测OD值。

1.9 统计学方法 应用SPSS11.0统计学分析软件，采用两样本t检验的方法对测定的OD值进行分析。

2 结果

2.1 表达质粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鉴定

将构建的重组表达质粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性内切酶BamH I和Not I 双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测到插入片断大小约560bp，与目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空质粒；2.Eg·ferritin/

2.2 Eg.ferritin 的纯化

含Ni2+的His-bind树脂亲合柱纯化Eg.ferritin/pET-28a表达的蛋白，经SDS-PAGE，根据标准蛋白分子量可知，纯化蛋白的分子量约19kD.

2.3 特异性抗血清识别纯化蛋白和天然抗原

纯化Eg.ferritin免疫小鼠制备的抗血清可特异性识别未纯化的重组Eg.ferritin，纯化的Eg.ferritin 及天然抗原(原头蚴、囊液)，识别蛋白条带的位置大致相同约19kD(见图3)。

2.4 小鼠血清IgG水平变化

根据对小鼠血清IgG水平在0～8周变化趋势的检测及对免疫组和对照组小鼠血清IgG的比较发现，小鼠血清中IgG的水平随着免疫次数及时间的延长呈上升趋势，免疫4周以后同一时期的免疫组小鼠血清中的IgG水平明显高于对照组(P＜0.01)。表1 两组小鼠免疫不同时间血清IgG水平变化

3 讨论

本实验将细粒棘球蚴铁蛋白基因重新克隆到表达载体pET-28a上，主要考虑：① pET-28a表达载体具有高效表达的能力［7］；② pET28a质粒在插入目的DNA后表达的蛋白N 末端含6个组氨酸，它作为His标签蛋白，可与Ni2+鳌合，使得重组融合蛋白在变性或非变性状态下均可被含Ni2+的His-band 树脂亲合柱纯化，即使被纯化的重组蛋白含量很低也能被有效地纯化出来。克服了本中心已经构建的重组表达质粒ferritin/pGEX-6p-1表达的重组蛋白ferritin/GST不能通过GSTTrapTMFF亲和层析柱纯化的弊端［3］；③重组蛋白是标签蛋白His和目的蛋白共同组成的融合蛋白，为获取目的蛋白，本应通过相应的剪切酶将标签蛋白剪切下来，但由于N-末端组氨酸所表达的蛋白分子量很小，它的存在不改变目的蛋白的活性，所以无须去除。这不仅能减少实验步骤，降低纯化蛋白在酶切过程中的损失，同时还可节省用来购买剪刀酶的费用，为后续研究提供了较好的实验材料。基于此我们得到了一个高效表达且易于纯化重组蛋白的基因工程菌株，并得到了较纯的重组蛋白，进行动物实验。通过实验说明Eg.ferritin作为抗原可诱导动物产生较强的的体液免疫应答，证明其有良好的抗原性；免疫血清与细粒棘球蚴天然抗原(囊液和原头蚴)的Western blot实验结果显示，免疫血清能够较好地识别天然抗原中位于19kD处的条带，说明Eg.ferritin具有较好免疫原性，由此推测中国大陆株细粒棘球蚴铁蛋白基因具有作为包虫疫苗候选分子的潜能，为进行重组铁蛋白对宿主的免疫保护性及保护性机制等方面研究的可能性提供了依据。

参考文献

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［5］ FM奥斯伯，RE金斯顿，JG塞德曼，等.精编分子生物学实验指南［M］.第4版.北京：科学出版社，2005：27.

音标学习计划范文第3篇

【关键词】 颅脑损伤/分型;急性期;血炎性细胞因子/外周血

脑外伤患者急性期常伴有外周血炎性细胞因子表达变化[1-2],不同分型脑外伤患者上述指标表达也有明显差异。笔者检测了89例不同分型脑外伤患者急性期外周各血炎性细胞因子,现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2007年1月至2009年5月在盘锦市第二人民医院神经外科住院治疗的脑外伤患者,纳入标准:①发病后6 h内来本院首诊。②年龄≥18岁。排除标准:①合并有其他严重躯体性疾病患者。②脑卒中史及再发脑外伤患者。③脑外伤后有严重的视觉和听觉障碍表现。④有精神疾病或精神疾病家族史。⑤初中以下文化程度。脑外伤患者入选89例,男53例,女36例,年龄22～75,平均(45.80±7.44)岁。全部入选对象根据入院时GCS评分分为2组:轻型颅脑损伤组(GCS评分13~15分,55例),中、重型颅脑损伤组(GCS评分≤12分,34例)。

1.2 方法

1.2.1 格拉斯哥昏迷评分及血清炎性因子测定方法 ①格拉斯哥昏迷评分(GCS)包括运动、语言和睁眼3大部分指标,将3部分得分相加,即得到GCS评分,得分越低代表病情越重,评分时间在入院后6 h内进行。②血清炎性因子测定 入选患者均于入院1 d和7 d清晨空腹抽静脉血6 ml,立即离心分离上清液,置-70℃冰箱保存,成批量统一检测血清、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8含量。测定血清IL-1、IL-6和IL-8含量采用ELISA法,试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供;测定TNF-α用放射免疫法,试剂盒由北京东亚生物技术研究所提供。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS 10.0分析软件对收集到的数据进行处理,观察和统计数据用均数±标准差(x±s)表示,用t检验进行组间显著性分析。

2 结果

不同分型脑外伤患者急性期外周血清炎性细胞因子变化比较见表1。

表1

不同分型脑外伤患者急性期外周血清炎性细胞因子变化比较(μg/L,x±s)

分组TNF-αIL-1

第1天第7天第1天第7天

轻型脑外伤组(n=55)1.06±0.09a1.03±0.10b0.17±0.02a0.26±0.04b

中、重型脑外伤组(n=34)1.15±0.121.31±0.170.24±0.030.38±0.06

作者单位:124000盘锦市第二人民医院神经外科

分组IL-6

IL-8

第1天第7天第1天第7天

轻型脑外伤组(n=55)0.10±0.02a0.29±0.04a0.12±0.03b0.31±0.04b

中、重型脑外伤组(n=34)0.14±0.030.31±0.070.18±0.050.49±0.06

注:与中、重型脑外伤组比较:aP

3 讨论

随着汽车交通时代的提前到来和交通事故急剧增多,颅脑外伤也成了日常生活中的常见病和多发病。炎性反应是该病患者重要的病理生理过程,脑组织损伤后也有类似外周器官的免疫激活,释放大量免疫调节物质,导致了创伤后粘附分子表达、细胞渗透、炎性表现均显著增强。一般认为[1-2],急性颅脑损伤后外周血清炎性细胞因子变化主要来自于肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL)-1、6和8的大量增加,促进炎性细胞的聚集和激活,增强嗜中性粒细胞及单核细胞的粘附作用,导致脑血管结构和血脑屏障的破坏,从而进一步加剧了颅脑损害。本研究以血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8为测试指标,选择了89例脑外伤患者为观察对象,并根据急性期格拉斯哥昏迷评分分组,观察不同病情脑外伤患者住院后第1天和第7天外周各血炎性细胞因子表达,结果表明中、重型脑外伤组第1天和第7天血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8浓度均明显高于轻型颅脑损伤患者。一些文献[3-4]解释这些表现常与脑外伤后脑组织水肿高峰期一致,伤后1周内血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8高水平表达提示脑损伤程度严重和预后差,而上述指标持续不降则说明继发性脑损伤改变加剧,这些现象提示炎性细胞因子在脑外伤后继发性脑损害经过中扮演重要角色。

鉴于不同分型脑外伤患者急性期常出现不同程外周血炎性细胞因子表达,后者还常被作为判断脑损伤程度和预后的重要参考指标,同时抑制或减少颅脑损伤后炎性细胞因子的含量,还可作为治疗中、重型颅脑损伤患者的可靠方法。因此监测颅脑损伤后患者血清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8浓度指标较为重要,对于临床诊断、预后判断以及指导颅脑损伤各时相遏制炎性反应干预治疗,提高颅脑损伤救治水平都具有十分重要的意义。

参 考 文 献

[1] 高玉松,袁绍纪,刘正义,等.颅脑损伤程度与血清中IL-6、TNF-α含量水平的关系.中国实用医药,2006,1(1):18-20.

[2] 杜笥凤,吴挺前,王丰,等.急性颅脑损伤患者IL-1β、TNF-α含量变化与预后的关系.中国临床神经科学,2006,14(3):307-308.

音标学习计划范文第4篇

【摘要】

目的探讨川芎嗪对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)中血小板源生长因子（PDGF）表达的影响。方法培养大鼠主动脉VSMC，以 10-7mol/L AngⅡ刺激作为AngⅡ组 ，AngⅡ刺激前分别应用不同浓度川芎嗪预处理做为高、中、低剂量组，以正常的VSMC为对照组，测定VSMC增殖活度，免疫细胞化学法检测培养24h时VSMC PDGF-B的表达。结果AngⅡ组VSMC增殖活度与 PDGF-B表达显著高于对照组(P

【关键词】 川芎嗪 血管紧张素Ⅱ 血管平滑肌细胞 血小板源生长因子

经皮冠状动脉腔内成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狭窄一直是冠心病治疗领域的一大难题，血管平滑肌细胞(vascular　smooth　muscle　cell，VSMC)异常增殖是PTCA术后再狭窄的一个重要病理改变［1］。有文献报道，血管紧张素II(angiotensin II，AngⅡ)、血小板源生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）在VSMC增殖中作用明显［2，3］。本研究以体外原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞为模型，观察AngⅡ与PDGF-B表达的关系以及川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)对其影响，探讨TMP对VSMC增殖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

体重120～150 g的健康雄性SD大鼠 （河南省实验动物中心）。盐酸川芎嗪注射液（无锡市第七制药公司），DMEM培养基干粉（Sigma）、细胞培养器材、胎牛血清、胰蛋白酶购自华美生物工程公司；AngⅡ（Merck公司），PDGF-B抗体（博士德），sm-actin免疫试剂盒（Santa Cruz），其它试剂为分析纯产品。

1.2 细胞培养与鉴定

将大鼠断头处死，无菌条件下迅速打开胸腔，取出胸主动脉，按组织贴块法在细胞培养箱内以含20%胎牛血清的DMEM培养。光镜下以及倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形，生长至融合状态时呈现特有的峰与谷特点，同时经sm-actin免疫细胞化学染色鉴定，细胞纯度达95%以上。选择4-6代VSMC进行实验。

1.3 实验分组

①对照组(control)：不加特殊试剂，仅给予无血清DMEM培养；②AngII组：AngII 10-7mol/L培养；③TMP低剂量组：20 mg/L TMP预孵育30 min后，加AngⅡ培养；④TMP中剂量组：200 mg/LTMP预孵育30 min，加AngⅡ培养；⑤TMP高剂量组：2 000 mg/L TMP预孵育30 min，加AngⅡ培养。

1.4 检测细胞增殖活度

采用MTT法。按上述方法接种于96孔培养板中培养48 h后终止，换无血清DMEM培养24 h，分组（同前）继续培养24 h，每孔加入MTT溶液20 μl，吸去培养上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜振荡；选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值（A值）。

1.5 免疫细胞化学法检测

PDGF-B的表达0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为5×104/L，接种于内置有盖玻片的6孔培养板中培养48 h，无血清DMEM培养24 h，分组（同前）继续培养24 h。培养细胞爬片用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%过氧化氢中孵育10 min；滴加复合消化液后滴加封闭血清，37℃，30 min，滴加PDGF-B一抗（1∶200），4℃过夜，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min。DAB 显色，中性树胶封片。

1.6 计算机图像分析

每一张涂片400倍显微镜下随机选择5个视野，计算其平均灰度值，数值越大表示抗原表达量越小。

1.7 统计学处理数据用±s表示

计算机统计软件分析SPSS11.0，采用One-way ANOVA分析，两两比较LSD检验。

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2 结 果

2.1 TMP对AngⅡ刺激的VSMC增殖活度的影响

AngⅡ组细胞增殖活度明显高于对照组（P

2.2 TMP对AngⅡ诱导的VSMC PDGF-B表达的影响

显微镜下观察，PDGF-B阳性表达为VSMC胞浆与胞核呈棕黄色反应，主要为胞浆表达。与对照组相比，AngⅡ刺激24h后，VSMC表达PDGF-B显著增强(P

3 讨论

TMP是从中药川芎中分离提纯的有效成分，其化学结构为四甲基吡嗪。广泛用于高血压病、冠心病等的防治。研究表明TMP具有扩张冠状动脉、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注损伤降低血压、降低肺动脉高压以及抑制血管平滑肌细胞增殖等多种心血管药理作用［4］。TMP可能通过抑制VSMC增殖发挥抗血管再狭窄作用，但其具体分子机制尚不清楚。

我们先前的研究表明［5］，血管损伤后再狭窄时血浆AngⅡ水平显著升高，血管壁PDGF-B表达显著增强。PDGF是由血小板、平滑肌细胞等分泌的一种糖蛋白，其家族目前至少有4个亚基，即PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D。其中由PDGF-A，PDGF-B形成的同源二聚体具有强烈的促进有丝分裂及细胞趋化作用，在体外可刺激心肌细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等多种类型细胞的肥大或增殖。PDGF与其膜表面受体结合，激活受体的内源性酪氨酸激酶活性，通过磷酸化胞浆中的信号分子，最终将信息传递到核内，导致VSMC增殖［6］。

本实验结果显示，AngⅡ诱导的VSMC PDGF-B表达水平显著高于对照组，同时VSMC增殖活度增强。提示AngⅡ可以通过上调PDGF-B表达、增强PDGF-B介导的细胞信号通路进一步促进血管平滑肌细胞增殖；不同剂量的TMP作用后，AngⅡ诱导的VSMC PDGF-B表达水平显著下调，VSMC增殖活度显著减弱。说明TMP能抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖，该效应与抑制PDGF-B表达有关；在相同培养时间内，随着TMP浓度增加，细胞增殖活度及PDGF-B表达水平逐渐降低，说明TMP的抑制作用具有量效关系。

综上所述，川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMC增殖有显著抑制作用，其作用机制与抑制PDGF介导的信号转导有关。

参考文献

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音标学习计划范文第5篇

【关键词】 关节炎，类风关巴布剂；大鼠；核转录因子-κβ；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β

类风湿关节炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病，其病理基础为关节滑膜的过度增生，诱导异常增生的滑膜组织发生凋亡可能成为治疗RA的有效途径。滑膜的增生与凋亡之间的平衡受多种因素的制约，细胞因子是其因素之一。在众多细胞因子中，肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β扮演着重要的角色。研究表明，TNF-α抑制细胞发生凋亡的机制受核转录因子-κβ(Nuclear factor-κβ，NF-κβ)的调控[1]， Yamasaki等[2]研究认为NF-κβ可能是治疗RA的目标分子。本实验通过对牛Ⅱ型胶原(BcⅡ)诱导关节炎(CIA)大鼠不同组合穴位贴敷类风关巴布剂，观察其对大鼠滑膜细胞NF-κβ表达的影响，并初步探讨经络腧穴在其中的作用。

1 实验材料

1.1 动物

Wistar大鼠，清洁级健康雄性，80只，体重(120±15)g，购

于上海斯莱克实验动物有限责任公司，正常饲养。

1.2 药物与试剂

雷公藤、白花蛇舌草、乳香、没药；BcⅡ，Chondrex公司(美国)；完全弗氏佐剂，Sigma公司(美国)；IL-1βELISA kit购于Biosource公司(美国)；TNF-α ELISA kit购于Biosource公司(美国)；NF-κβ购于santa cruz Biotechnology，inc(美国)；多聚赖氨酸玻片100张，EiVision＋PolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6 mL。

1.3 仪器

显微镜OLYMPUS(日本)，低温高速离心机BECKMEN(美国)，酶标仪Bio-rad680(美国)。

2 实验方法

2.1 类风关巴布剂的组成及制作方法

雷公藤、白花蛇舌草、乳香、没药等，共12味，按固定剂量配伍(其中雷公藤占总药量的28%)，晒干，研粉，过20目筛，用80%乙醇渗漉提取，然后过滤取液，经低温低压(50 ℃，-0.8个大气压)蒸馏去乙醇后得浸膏。将浸膏按一定比例加入事先配制的巴布剂基质(主要成分明胶、甘油、聚丙烯酸钠等)中，并加入0.5%的促渗剂(氮酮)、一定比例的乳化剂及防腐剂等，充分溶合，均匀涂布于无纺布上，覆盖聚乙烯薄膜，切成3 cm×3 cm的方块(重量1 g)，密封包装，阴凉处储存备用。

2.2 造模和分组

随机从100只大鼠中选出10只为正常对照，其余90只用于造模，参照文献[3]方法配制成Ⅱ型胶原乳剂。具体方法为：在无菌条件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解BcⅡ，浓度为4 mg/mL，置4 ℃冰箱过夜后，与弗氏完全佐剂等体积混合、振荡乳化，制成BcⅡ乳剂(即每0.5 mL含1 mg BcⅡ)。置4 ℃冰箱保存备用。注射方法：于大鼠背部及尾根分5点行皮内注射，每点0.1 mL，总量0.5 mL(含1 mg BcⅡ型胶原)。15 d后同法分2点皮内激发注射。正常对照组予以生理盐水同法注射。初次免疫25 d后参照关节炎指数评分标准[1]对造模效果进行评估，评分达6分以上的大鼠被用于继续实验。将造模成功的大鼠随机分为4组，即类风关巴布剂局部穴位贴敷组(局部组)、类风关巴布剂远道穴位贴敷组(远道组)、类风关巴布剂系统穴位贴敷组(系统组)和模型对照组(模型组)各10只。

2.3 给药

根据临床及有关动物实验的取穴方案[4]取穴。系统组：大椎、双侧肾俞、双侧太溪，共5个穴点；远道组：大椎、双侧肾俞，共3个穴点；局部组：双侧太溪，共2个穴点。根据贴敷总面积相同(剂量相等)的原则，系统组每穴贴敷面积为0.15 cm2的圆形巴布剂(半径0.22 cm)；远道组每穴贴敷面积为0.25 cm2(半径0.28 cm)；局部组每穴贴敷面积为0.375 cm2 (半径0.35 cm)。在穴位处脱毛后贴敷，每3 d贴敷1次，共5次，每次雷公藤甲素剂量约为3.8 μg[5]。正常组和模型组模仿局部组贴敷不含药物的巴布剂基质。15 d后各组同时处死取标本。

2.4 取材

大鼠称重，用2%戊巴比妥纳腹腔麻醉，仰位固定，沿着左侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出膝关节位中心约3 cm×3 cm的区域。沿髌骨上缘约0.3～0.4 cm处向下切割至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见由髌骨下极向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科直镊轻轻夹住其中央，用眼科剪完整剪下，置10%的中性甲醛中固定，用于检测NF-κβ的免疫组织化学染色。同法取右侧滑膜，滑膜取出之后，用生理盐水1 mL冲洗关节腔，收集关节腔液和关节滑膜组织，用于IL-1β、TNF-α的检测。

2.5 检测指标

2.5.1 细胞因子的检测

IL-1β、TNF-α活性测定采用ELISA法，按照所附说明书测定关节滑膜组织溶浆的活性。先加入标准品和待测样品，设置阴性对照，加入生物素结合的一抗(IL-1β、TNF-α)，37 ℃温箱孵育2 h，然后用洗涤液充分洗涤4次，向滤纸印干。加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液25 ℃孵育1 h，再用洗涤液充分洗涤4次，向滤纸印干。加入显色液25 ℃孵育30 min后加入终止液。上机检测吸光度值。

2.5.2 滑膜组织核转录因子-κβ的免疫组化ABC染色

准备组织切片(石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片和细胞培养片用适当方法固定)；抗原修复(微波加热法，适用石蜡切片)，将切片置于耐高温容器中，注入抗原修复液，使切片位于液面以下。置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98 ℃之间并持续5 min，取出容器，室温冷却，30～50 min后降至室温。用TBS 冲洗切片4～5次，甩干，擦净，加20 μL 3% H2O2-甲醇溶液(Reagent F)，于室温湿盒中封闭30 min。取出切片，用TBS冲洗4～5次，甩干，擦净。用封闭液(Reagent B)20 μL覆盖，室温湿盒孵育30 min。用吸水纸将封闭液吸去，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗。37 ℃孵育1～2 h或4 ℃过夜。TBS冲洗4～5次，甩干，擦净。滴加生物素标记二抗(Reagent C)20 μL，室温湿盒孵育1～2 h。TBS冲洗4～5次，甩干，擦净。滴加酶标亲和素(Reagent D)20 μL，室温湿盒孵育30 min。TBS冲洗4～5次，滴加DAB工作液(Reagent E)约30 μL/片，着色后迅速(约1 min内)冲洗干净。20 μL苏木精(Reagent G)复染。冲洗干净脱水封片，镜检。

2.5.3 核转录因子-κβ积分[6]

在滑膜组织中NF-κβ表达阳性的滑膜组织细胞核呈橘黄色或棕黄色，每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率，计数3个视野，标出每个视野平均阳性细胞占有率，并按阳性细胞占有率分为5级：“0”为无阳性细胞，“+”为阳性细胞0～25%，“++”为阳性细胞25%～50%，“+++”为阳性细胞50%～75%，“++++”为阳性细胞75%～100%。0级积分为0，“+”积分为1，以此类推。

2.6 统计学方法

用SPSS11.0统计软件，若数据为正态分布总体比较采用多组单因素方差分析，组间比较用q检验(Newman- Keuls法)，否则用秩和检验的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法，P

3 结果

(见表1、表2)表1 各组大鼠滑膜细胞NF-κβ的表达(略)注：与模型组比较，P

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4 讨论

NF-κβ是1986年由Sen和Baltimore首先报道[7]，并发现B细胞核提取物中有一种核蛋白能与免疫球蛋白K轻链基因增强子κβ序列特异结合，促进了K轻链的表达，被称为NF-κβ。越来越多的证据表明，在RA发病的过程中，NF-κβ做为转录因子家族成员参与了滑膜组织的过度增生和炎症过程[8]。NF-κβ在胞浆中与其抑制亚单位Ⅰ-κβ结合而处于未活化状态，并可被TNF-α、IL-1β等不同的信号所激活，其活化则有赖于胞浆中Ⅰ-κβ的降解。在正常滑膜，NF-κβ的表达量很低[9]。在RA的滑膜中，免疫活性NF-κβ蛋白p50和p65大量表达于衬里层细胞和血管内皮细胞中[10]。NF-κβ的活化在RA早期滑膜炎症和增生的过程中起中心罪犯作用[11]。

在正常细胞构成性表达活化的NF-κβ仅见于成熟B细胞、浆细胞和某些神经元中，而其他大多数细胞的NF-κβ需在外界的刺激诱导下发生激活。许多细胞外因素可诱导NF-κβ的活化，如炎性细胞因子TNF-α、IL-1β等，但最终都通过IKK使Ⅰ-κβ降解而与NF-κβ解离，暴露NF-κβ的NLS，使NF-κβ经核孔进入核内，与DNA靶序列结合，发挥转录调控效应；而NF-κβ的活化导致了许多基因的表达，以直接或间接的方式调节机体的生理和病理反应。在此过程中，TNF-α、IL-1β等前炎细胞因子在NF-κβ作用下生成增加，它们作为外界刺激因子进一步活化NF-κβ信号通路，产生正反馈放大作用，这是NF-κβ迅速动员、反应灵敏的重要条件。然而，由于NF-κβ活化导致大量细胞因子、酶等生物活性物质的产生，它的过度活化必然导致机体的病理反应和损伤，正常细胞内NF-κβ的活化是在细胞内外通路的正、负反馈的精细调节下，使NF-κβ的活化保持在适当的水平。正、负两种反馈调节往往同时进行，NF-κβ是否处于活化状态则取决于何种调节占优势。

CIA的产生和发展与RA有着很多的相似性，二者都依赖于自身反应性T细胞和B细胞的激活，并能产生类似类风湿因子的抗体。Seetharaman等[12]在CIA大鼠的研究表明，对于Ⅰ型和Ⅱ型T细胞依赖的免疫应答而言，抗体诱导NF-κβ的活化主要导致T细胞依赖的免疫应答，抑制NF-κβ信号通路，使血清TNF-γ、IgG2a抗Ⅱ型胶原(CⅡ)抗体水平明显下降而IgG1水平不变，CD8+T细胞减少，CIA发病率及严重性明显减少和减轻。因此，本实验选用CIA大鼠为模型。

RA属于中医学“痹证”范畴，近年来，大量研究认为雷公藤对CIA大鼠有效，并有采用含雷公藤的复方中药穴位贴敷治疗CIA大鼠的研究[13]。我们将以雷公藤为主药的复方中药制剂与针灸穴位有机结合，研制类风关巴布剂，并进行了毒理、制剂学及临床的研究，在大鼠佐剂性关节炎穴位贴敷研究中，证明相同的给药剂量(贴敷面积)不同的穴位组合作用有差异，以系统组(远近配穴)最佳[14]。另据研究，雷公藤甲素可以下调CIA大鼠滑膜细胞TNF-α的表达，同时还可以有效抑制NF-κβ的表达与活性[15]。本实验中，造模后NF-κβ积分水平明显升高，治疗后各组都有所下降，以系统组最接近正常，同时治疗后各组滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平也有明显下降。因此，类风关巴布剂穴位贴敷能够有效打破NF-κβ与TNF-α、IL-1β之间的正反馈调节的恶性循环。

在本次实验中，除了药物的疗效外，合理用穴也是关键要素，一方面，通过经络腧穴给药对药效的放大作用来提高疗效，另外，远近配穴可能通过标本兼治，多靶点起效，使其整体疗效优于单纯远道取穴或局部取穴。

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