氯化两面针碱体外肾毒性探讨论文
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【摘要】目的观察氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293的毒性作用。方法采用MTT法检测不同浓度氯化两面针碱对人胚肾细胞293的毒性。结果氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293有一定的毒性作用。结论氯化两面针碱可抑制人胚肾细胞293的增殖，对肾脏有一定的毒性。
中药抗肿瘤是目前医学界研究的一个热点，很多中药成分被证实具有较好的抗肿瘤效果而得以逐步走向临床。氯化两面针碱是两面针制剂的主要有效成分，在抗炎、镇痛、抗肿瘤、心血管系统等方面的作用已有较多报道。氯化两面针碱有较强的抗癌作用，据文献[1]报道，氯化两面针碱对LEWIS肺癌、鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病均有抑制作用，对小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效，而其对肾的毒性问题未见报道,特别是在细胞水平、分子水平都未见报道。作为一个新型的抗肿瘤药物，其肾毒性大小至关重要。本实验中，我们考察了氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293的毒性作用。
1材料与仪器
1.1试药氯化两面针碱标准品(中国药品生物制品检定所);四噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);DMEM(美国GIBCOBRL公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所公司);胰蛋白酶(美国Amresco公司公司);谷氨酰胺(美国Amresco公司);PBS(美国Amresco公司);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司);注射用硫酸链霉素(大连美罗大药厂);HEPES(Sigma公司)。
1.2仪器二氧化碳培养箱(美国FormaScientific公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(芬兰thermo公司);超低温冰箱(日本三洋公司);96孔培养板(美国BIO-RAD公司);6孔培养板(美国BIO-RAD公司);超净工作台(苏州净化设备厂);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)。
1.3细胞株人胚肾细胞293细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)。
2方法
2.1DMEM培养液的配置DMEM培养干粉以1000ml三蒸水充分溶解，加入NaHCO32.0g,HEPES4.766g，加入青霉素、链霉素使其终浓度为100U·ml-1，在超净工作台中过虑除菌，分装成90ml/瓶，-20℃保存备用，临用前加10ml热灭活(56℃，30min)胎牛血清。
2.2梯度氯化两面针碱的制备精密称定氯化两面针碱标准品适量用DMSO溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置成0.78125，1.5625，3.125，6.25，12.5μg/ml浓度梯度的氯化两面针碱系列浓度样品，置于4℃冰箱中保存备用。
2.3细胞培养人正常胚肾细胞293分别培养于含DMEM完全培养液的玻璃培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，定期观察更换培养液。细胞铺满培养瓶底部时传代，用PBS冲洗两次，加入0.25%胰蛋白酶2ml消化液，置37℃约1min，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞间连接消失，表明此时细胞消化适度，吸取上清液，加入完全培养液2ml，反复吹打，将细胞吹打均匀，调整培养瓶中细胞浓度至1×105/ml,加入完全培养液，置于CO2的培养箱。实验中所用细胞均处于对数生长期，活细胞数大于95%。
2.4氯化两面针碱的肾毒性实验(MTT法)取对数生长期的人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，用DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入96孔培养板，每孔190μl，在5%CO2、37℃培养箱培养24h待细胞完全贴壁后，受试孔加入系列浓度受试药物10μl每药3孔，阴性对照孔加入含0.5%DMSO的无血清培养基10μl，空白对照孔加入等量的含药无血清培养基而无细胞，各孔加培养基至200μl，培养箱孵育24，48，72h，加入5mg/ml的MTT10μl，继续在培养箱培养4h，取出96孔板顷去上清液，加入DMSO每孔150μl，在摇床上振动摇匀10min，在酶标仪570nm和630nm的波长下测得各孔OD值。按下式计算药物对293细胞的抑制率。
抑制率(%)=对照组OD值-实验组OD值对照组OD值×100%
实验重复3次，计算平均抑制率。
2.5SOD，MDA，LDH的测定(紫外分光光度法)取对数生长期的人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，用DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入6孔培养板，每孔1.9ml，在5%CO2，37℃培养箱培养24h待细胞完全贴壁后，实验孔加入3.125μg/ml氯化两面针碱0.1ml，另设空白对照组。在药物作用的12，24，48h后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH试剂盒中所述方法进行SOD，MDA，LDH的测定。
2.6统计学软件处理数据数据以±s表示，组间的均数采用方差分析进行两两比较，采用SPSS13.0软件进行处理。采用Bliss法计算IC50值。
3结果
3.1MTT测定结果药物干预组与空白对照组比较，在0.78125～12.5μg/ml浓度范围内，吸收度A值随药物浓度的增加逐渐减小，说明氯化两面针碱对人正常胚肾细胞293有一定的毒性作用，且随氯化两面针碱浓度的增大对细胞的毒性增加。结果见表1。表1MTT法测定氯化两面针碱对293细胞株的毒性作用
3.2SOD，MDA，LDH的测定结果结果见表2。表2紫外分光光度法测定氯化两面针碱对人胚肾细胞293毒性作用
3.3药物作用前后肾细胞的变化正常的肾细胞为不规则多边形，药物作用前的肾细胞在倒置显微镜下观察可见为不规则多边形，胞浆丰富，单核、双核细胞较多见，偶可见多核细胞，细胞核圆、透亮，培养12h后可见细胞开始贴壁，贴壁细胞透亮、呈不规则多角形，边界清晰，胞浆内容物丰富，少许未贴壁细胞浮于液面。培养24h的肝细胞大部分贴壁。见图1。药物作用12h后肾细胞开始萎缩，细胞膜完整,出现发泡现象,并有膜包裹的凋亡小体出现，细胞密度下降。药物作用24h后肾细胞随时间的延长，细胞形态改变和细胞密度下降较明显，出现较多凋亡小体悬浮于培养液中。药物作用48h后肾细胞死亡较多，密度进一步降低，出现较多凋亡小体悬浮于培养液中，培养液出现浑浊现象。结果见图1～4。
4讨论
肾脏是人体重要脏器之一,更是主要的排泄器官。药物在体内经肾脏代谢,多数药物以原形或分解产物形式从肾脏排泄出体外，但许多药物具有肾毒性,如过量使用(尤其在患肾病时),会对肾产生毒性作用,继而引起或加重肾损害。中草药引起的肾损害与用药剂量的大小,持续时间的长短、性别、个体敏感性有关。当剂量达到一定程度后即可引起肾损害。曾有报道一次用木通60g可引起急性肾衰竭。通常认为中药毒性小,用量有日益增大的趋势。故使用中药应遵循少而精的原则,要时刻考虑是否会加重肾脏负担或是否可引起不可逆的肾损害。
考察药物的毒性是确定该药物有无继续研究和开发价值的重要因素，早期发现和掌握药物的有关毒理学资料对于后续研究有着重要的指导意义，因此建立一个良好的实验模型检测药物毒性对于新药的研究与开发具有重要意义。肾为人体重要的代谢器官，所以考察一个药物的毒性大小以肾细胞为对象具有代表性作用。肾毒性检测是研究新化合物毒理学的重要组成部分，而通过体外肾细胞模型进行新化合物的肾毒性研究更是有着自身的众多优点。本实验中，我们选取了人胚肾细胞293为实验对象，考察氯化两面针碱对正常细胞的毒性作用。
通过测定加入药物作用后的6孔板中培养上清液的SOD，MDA，LDH值可以看出，加入药物后，可以抑制肾细胞的增殖，与未加药物作用的值比较，两者具有显著性差异。说明氯化两面针碱具有一定的肾毒性。本实验结果可为临床应用提供参考。超级秘书网：
【参考文献】
[1]杨仓良.毒药本草[M].北京:中国中医药出版社，1993:431
