酶法工艺头孢丙烯中酶蛋白残留的检测

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[摘要]目的：建立一种酶法工艺制备的头孢丙烯中酶蛋白残留的新检测方法。方法：采用考马斯亮蓝法，配制标准蛋白线性溶液建立标准曲线，取考马斯亮蓝G-250染液加入到10%碳酸氢钠溶液溶解的头孢丙烯供试品溶液中，混匀反应10分钟后使用紫外分光光度计测定吸光度，采用标准曲线法计算得到供试品溶液中的蛋白浓度，并计算出供试品所含酶蛋白残留含量。结果：酶蛋白在25~1000μg/mL(相当于供试品0.05%~2.0%)浓度范围内与吸光度呈良好线性关系(r=0.9976)；精密度RSD(n=12)为4.5%；平均回收率(n=12)为98.9%。结论：本方法简单便捷、重复性好、快速准确，适用于酶法工艺制备的头孢丙烯中酶蛋白残留的含量测定。

[关键词]头孢丙烯；酶法；蛋白残留；含量测定

头孢丙烯是美国百时美-施贵宝公司研制的第二代非酯型口服头孢菌素类广谱抗菌药(图1)，也是FDA批准的第一个可有用于治疗儿童中耳炎和鼻窦炎的口服头孢菌素类抗生素，临床上主要用于敏感细菌引起的呼吸道、皮肤和软组织等感染[1]。目前已报道的合成头孢丙烯的方法主要是采用化学合成法[2-3]，该合成法反应过程多，使用有机溶剂量大，产生的危险废物多，对环境不友好。近年也有新的绿色环保的酶法合成头孢丙烯制备工艺报道[4-6]。酶法合成相对化学合成，使用的有机溶剂少，路线简单，能克服现有的化学合成法成本高、大量使用有毒试剂、生产周期长的不足，满足经济、环境和社会进步的需要。但是酶法合成头孢丙烯的工艺中，使用到合成酶，其结构以蛋白质为主。如若较多残留至成品中，服药后有可能导致患者过敏等不良反应。因此，为了更好地控制酶法工艺制备的头孢丙烯的药品质量，有必要建立一种检测方法，以检测酶法制备的头孢丙烯最终产品中酶蛋白的残留量，从而保证用药的安全性。目前，蛋白质的定量测定有多种方法，如考马斯亮蓝(Bradford)法[7]、福林酚(Lowry)法[8]、凝胶过滤(GFC)法[9]、荧光法[10]、质谱法(MS)等[11]。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量是通过染料结合进行的，在游离状态下呈现红色，最大光吸收波长在488nm，当考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变成蓝色，该蛋白质-色素的结合物在595nm吸收波长下有最大吸收，其吸光度值与蛋白质的含量成正比[7]。其作为一种通用型方法，只需加一种检测试剂就可以实现快速、简单、方便的测定；灵敏度高，约为福林酚法的4倍；受干扰的物质少，优点突出，可以作为蛋白质含量测定的首选。牛血清白蛋白是极为常用的标准参照蛋白，一般蛋白质含量检测方法所选取的稀释剂多以水为主，而头孢丙烯的溶解特性为微溶于水，因此需要选取合适的溶剂，既不能让残留的蛋白质变性，又能充分溶解头孢丙烯，使酶蛋白残留的检测结果准确、可靠。本文采用考马斯亮蓝法，通过考察选择合适的溶剂、建立了酶法工艺制备头孢丙烯酶蛋白残留的检测方法，快速、简便、经济，并已用于实际样品酶蛋白残留的测定。

1仪器与试剂

1.1仪器。紫外分光光度计(岛津UV-1800)、电子天平(梅特勒托利多)

1.2试剂。牛血清白蛋白：生物技术级96%，阿拉丁；考马斯亮蓝G-250：上海绿鸟科技；磷酸：阿拉丁；乙醇：上海凯沃生物；碳酸氢钠：广州化学试剂厂；实验用水：实验室超纯水一体机自制纯化水；头孢丙烯供试品：自制样品S190701、S190702、S190703。

2方法与讨论

2.1溶液配制。考马斯亮蓝G-250染液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL乙醇中，加入磷酸100mL，用纯化水稀释定容至1000mL。10%碳酸氢钠溶液：取碳酸氢钠10g，加水100mL溶解，即得。

2.2空白溶液配制。取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入200μL10%碳酸氢钠溶液，密封混匀，放置10min后，即得空白溶液。

2.3标准曲线溶液及供试品溶液配制。取牛血清白蛋白适量，用纯化水溶解定容，得到标准蛋白储备溶液，取上述储备溶液适量，以10%碳酸氢钠溶液进行稀释，即得标准蛋白线性溶液；另取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入标准蛋白线性溶液200μL，密封，混匀；放置10分钟后，即得标准曲线溶液。取头孢丙烯供试品(批号：S190703)500mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加10%碳酸氢钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入200μL供试品溶液，密封混匀，放置10分钟后，作为供试品测定溶液。

2.4检测条件紫外检测波长：595nm

2.5稀释溶剂的选择。因蛋白质在酸、碱、丙酮等物质中均易变性，实验考察了多种溶剂如不同浓度的磷酸、冰乙酸、碳酸钠、碳酸氢钠等溶剂，分别配制牛血清白蛋白标准溶液和供试品溶液，结果在上述溶剂中10%碳酸氢钠溶液不但紫外响应高、吸光度与浓度亦呈现较好的线性关系，而且对头孢丙烯的溶解度很大，较好地满足了酶蛋白残留的检测要求。通过比较与选择，最终选定了10%碳酸氢钠溶液作为溶剂。

2.6放置反应时间的选择。考马斯亮蓝法中染液与蛋白质结合时间较短，几分钟内可完成，结合以后的颜色可保持1小时稳定。选定溶剂后对放置时间进行了考察，结果显示在5~20分钟内吸光度结果相对稳定，综合测定的快速性、反应充分性和结果的稳定性，最终选定放置10分钟。

3验证结果

3.1标准曲线的建立。称量牛血清白蛋白适量，用纯化水溶解定容至50mL容量瓶中，得到浓度约为2500μg/mL的标准蛋白储备溶液。按下表分别取适量，以10%碳酸氢钠溶液进行稀释，共得7份标准蛋白线性溶液；各取10mL考马斯亮蓝G-250染液，分别置7个西林瓶中，分别加入下表1各标准蛋白线性溶液200μL，密封，混匀；放置10min后，即得7份标准曲线溶液。紫外分光光度计在595nm波长下，经过空白溶液校正后，取该7份标准曲线溶液分别放入紫外分光光度计读取吸光度值，检测结果如下表2：以蛋白溶度为横坐标，以吸光度为纵坐标，采用吸光度对蛋白溶液溶度以最小二乘法做线性回归(图1)，得线性回归方程：y=0.000538852x+0.0244872(r2=0.9952)。结果表明标准蛋白溶度在24.8~993.5μg/mL的范围内与吸光度线性关系良好，可适用于标准曲线的建立。

3.2精密度。3.2.1分析重复性按3.1建立标准曲线，取供试品，按2方法测定其蛋白残留，供试品蛋白残留浓度为22.76μg/mL，酶蛋白残留0.045%；取同一供试品平行配制6份供试品溶液，按照标准溶液加入法，分别取10mL考马斯亮蓝G-250染液，分别置6个西林瓶中，分别加入100μL标准曲线中的相当于供试品0.2%的线性溶液以及100μL上述供试品溶液，均密封混匀，放置10min后，得到6份分析重复性溶液，取这6份分析重复性溶液测定吸光度值，通过标准曲线计算得到分析重复性溶液中所含蛋白浓度；分析重复性溶液的蛋白浓度减去对应供试品溶液所含蛋白浓度，得到实际加入的线性溶液的蛋白浓度，实际加入的蛋白浓度与理论加入的蛋白浓度的比值为回收率。如下表3所示，各分析重复性溶液的平均回收率为102.6%，RSD为4.6%，本方法的分析重复性良好。3.2.2中间精密度在不同日期不同实验员按照3.2.1进行供试品蛋白残留测定，供试品蛋白残留浓度为22.66μg/mL，酶蛋白残留0.045%；按照3.2.1平行配制6份中间精密度溶液测定并计算回收率。如下表4所示，各中间精密度溶液的平均回收率为97.6%，RSD为3.0%，本方法的中间精密度良好。综合12份溶液平均回收率为100.1，RSD为4.5%，本方法的精密度良好。

3.3回收率。按3.1建立标准曲线，取供试品，按2方法测定其蛋白残留为22.76μg/mL。准确度溶液1配制：取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入100μL标准曲线中的相当于供试品0.05%的线性溶液以及100μL上述供试品溶液，密封混匀，放置10min后，得到准确度溶液1；平行配制3份；准确度溶液2配制：取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入100μL标准曲线中的相当于供试品0.2%的线性溶液以及100μL上述供试品溶液，密封混匀，放置10min后，得到准确度溶液2；平行配制3份；准确度溶液3配制：取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入100μL标准曲线中的相当于供试品1.2%的线性溶液以及100μL上述供试品溶液，密封混匀，放置10min后，得到准确度溶液3；平行配制3份；准确度溶液4配制：取10mL考马斯亮蓝G-250染液，置西林瓶中，加入100μL标准曲线中的相当于供试品2.0%的线性溶液以及100μL上述供试品溶液，密封混匀，放置10min后，得到准确度溶液4；平行配制3份；取上述12份准确度溶液测定吸光度，通过标准曲线计算得到准确度溶液中所含蛋白浓度；准确度溶液所含的蛋白浓度减去供试品溶液所含蛋白浓度，得到实际加入的线性溶液的蛋白浓度，实际加入的蛋白浓度与理论加入的蛋白浓度的比值为回收率。如下表6所示，各准确度溶液平均回收率为98.9%，RSD为4.1%，回收率的95%置信区间在96.3%~101.5%，表明该方法测定头孢丙烯酶蛋白残留准确、可靠。

3.4样品检测。按3.1建立标准曲线，取各供试品，按2方法配制供试品溶液并测定其蛋白残留，如下表7所示。

4结论

本论文中，我们采用考马斯亮蓝法，使用10%碳酸氢钠溶液作为溶剂对酶法工艺制备头孢丙烯中酶蛋白残留进行了测定。在此条件下，方法简便、灵敏度高、重复性好、结果快速准确，适用于酶法工艺制备头孢丙烯中酶蛋白残留的测定，为头孢丙烯药物研发、生产样品的质量控制提供了参考。

作者:李庆 关晴 刁富城 单位:广州白云山医药集团股份有限公司白云山化学制药厂