ADM2 在心肺肾等重要脏器的生物学效应
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利用基因转录、放射免疫、免疫组化法和免疫印迹等检测方法，先后有学者证实ADM2在人类和啮齿动物的很多部位中都有表达，如心血管系统、肾脏、胃(尤其胃粘膜肌层)、空肠、脑部(尤其下丘脑、脑垂体前叶和中部)、皮肤、颌下腺、胰腺、肺、脾、胸腺、卵巢，不在睾丸和肾上腺表达。血浆中也检测到了ADM2的表达，学术界大多数观点认为其来源于脑垂体。另外在血浆中还检测到了ADM2前体肽原的表达，这说明部分成熟ADM2的形成是在细胞外进行的。同ADM和CGRP一样，中性肽链内切酶可能参与了ADM2的降解[4]。ADM2与ADM、CGRP结构类似，通过与降钙素受体(calcitoninreceptor，CTR)和降钙素受体样受体/受体活化修饰蛋白复合物(calcitoninrece-ptor-likereceptor/receptoractivity-modifyingproteins，CRLR/RAMPs)结合发挥作用[2]。CRLR在机体各系统中广泛表达，为G蛋白偶联受体，通过激活Gs蛋白介导的腺苷酸环化酶升高细胞内cAMP水平，发挥其生物学效应。而CRLR本身没有活性，需要结合RAMPs后才具有受体功能。RAMPs有三种亚型：RAMP1、RAMP2和RAMP3，各组织器官中均有分布。它们作为分子伴侣将CRLR从内质网和高尔基体转运到细胞膜，并参与CRLR配体特异性的识别。CGRP优先与CRLR/RAMP1结合，ADM优先与CRLR/RAMP2，3结合，而ADM2与三个受体亚型的结合没有选择性，这提示在机体中ADM2可能有着比CGRP和ADM更为强大和广泛的生物学效应。
肾上腺髓质素2的生物学效应及机制
ADM2的心脏保护作用及机制1)抗心肌纤维化。心肌纤维化指各种致纤维化因素使心肌胶原纤维不成比例增多，表现为心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞增殖。血管紧张素Ⅱ是强有力的心肌纤维化诱导因子，在其诱导的心肌纤维化模型中发现，大鼠心肌成纤维细胞中ADM2的生成和分泌下调，CRLR、RAMP2和RAMP3的mRNA表达水平上调，对ADM2和RAMP1无影响。采用[3H]-胸腺嘧啶和[3H]-脯氨酸掺入法检测细胞DNA复制和胶原生成，发现ADM2干预后可抑制心肌成纤维细胞[3H]-胸腺嘧啶和[3H]-脯氨酸掺入，减少胶原合成，降低反映心肌纤维化水平的α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)含量，增加cAMP含量，起到抗心肌纤维化的作用[5]。有研究结扎大鼠左冠状动脉前降支诱导心肌纤维化模型，与假手术组相比，手术组存活大鼠的心功能降低，心肌梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增加，左室ADM2及其受体系统表达上调。另外，ADM2浓度依赖性地拮抗了醛固酮诱导的心肌成纤维细胞增殖[6]。血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞肥大模型中，细胞ADM2的mRNA表达、分泌和合成明显下调，而其受体系统mRNA表达上调。ADM2与同浓度的ADM作用相仿，能够有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的细胞肥大效应，并浓度依赖性地提高cAMP含量。因此，ADM2可能通过cAMP/PKA途径发挥了抗乳鼠心肌细胞肥大效应[7]。2)抗缺血再灌注损伤。目前，学者们对于心脏缺血再灌后内源性ADM2的变化情况观点并不一致。有研究发现大鼠心脏左前降支缺血30分钟后再灌注早期，缺血区域的ADM2表达显著减少，而非缺血区ADM2表达升高，其受体系统均上调。通过ADM2对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护机制，研究者认为缺血区ADM2的降低可能加剧了心肌的损伤[8]。但也有学者报道，与对照组相比梗死心肌ADM2mRNA和蛋白表达水平上升，受体系统RAMP3、RAMP3mRNA相继表达升高，RAMP1没有变化。ADM2含量与舒张压呈正相关，与脉压呈负相关。ADM2干预后脉压下降，梗死区周围中性粒细胞浸润受抑制，血浆肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性下降，心肌缺血再灌后损伤得到明显改善[9]。ADM2作为心血管保护因子，外源性给予ADM2可拮抗心肌缺血再灌引起的内质网应激、氧化应激反应，并发挥抗细胞凋亡作用保护心肌。研究证实，ADM2通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)信号传导通路抑制心肌内质网应激，起到了保护心肌的作用[10]。心肌缺血再灌后引发严重的脂质过氧化损伤，外源性给予ADM2可激活细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)1/2通路，降低大鼠血浆丙二醛含量和心肌乳酸脱氢酶活性，提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，减少还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase，NADPHoxidase)亚基蛋白表达，使活性氧产生减少，从而改善了心肌氧化应激损伤[11]。
目前，在人主动脉内皮细胞、平滑肌细胞、心脏微血管内皮细胞和成纤维细胞系中发现ADM2及其受体系统的表达，1nmoll-1ADM2可拮抗1mmoll-1H2O2和缺血再灌引发的氧化应激作用，提高细胞生存率[12]。此外，ADM2通过Akt/GSK-3β途径抑制线粒体介导的心肌凋亡，使心肌梗塞面积减小，凋亡指数、caspase3活性降低、由线粒体到胞浆的细胞色素c转位受抑制，凋亡抑制基因B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2，Bcl-2)的mRNA和蛋白表达上升，Bcl-2/Bax比值升高[13]。3)改善心脏功能。有研究表明在大鼠左心室乳头肌上，ADM2通过内皮源性一氧化氮(nitricoxide，NO)发挥负性肌力作用[14]。ADM2使正常心肌内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)丝氨酸磷酸化水平增加3倍，使与NO/cGMP通路相关的心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiactroponinI，cTnI)磷酸化水平增加，发挥负性肌力作用且无显著松弛心肌效果。而应用缩窄主动脉或给予eNOS抑制剂的方法增加心脏后负荷后，心肌eNOS磷酸化基线水平已经增高，ADM2不使其继续增加。主动脉缩窄组与cAMP/PKA通路相关的磷酸化PLB增加。ADM2呈浓度依赖性地发挥正性肌力和松弛左室乳头肌的作用。据此，研究者推断心肌对ADM2的不同反应是由于后负荷增加后eNOS系统发生损伤引起的[15]。但也有学者提出：在离体的大鼠心室肌细胞中，ADM2通过激活PKA和增加钙瞬流发挥正性肌力作用。而在心脏离体灌流模型中，心脏缺血后NO合成受损，ADM2降低左室舒张末压，负性肌力作用减弱且不产生正性肌力作用，不改善缺血后心功能的恢复[16]。给麻醉状态下猪的冠状动脉左前降支灌注ADM2(0.81~204.1pmol/min)，在心率和动脉压保持不变的情况下，其冠脉血流增加，心脏功能增强。ADM2的这种效应可能与其自身受体系统和β2-肾上腺素能受体介导的NO合成和释放有关。在培养的猪冠状动脉内皮细胞上进一步研究证实，ADM2通过cAMP途径激活ERK、PKB和p38，增加内皮型一氧化氮合酶磷酸化，使NO生成增多[17]。
ADM2对血管的调节作用1)对血压的影响。研究发现自发性高血压大鼠心肌组织、主动脉、血浆中ADM2及其受体复合物CRLR和RAMP1/2/3的蛋白和mRNA水平上调，cAMP表达增加，预先加入CGRP8-37或ADM22-52均不能减弱这种作用[18]。这提示心血管组织中ADM2及其受体参与了自发性高血压大鼠病程的发生发展。以往的研究表明向大鼠侧脑室注射ADM2可持续显著地升高平均动脉压和心率，其效应明显强于ADM，与CGRP相当[19]。越来越多的研究证明，通过外周途径给予ADM2可舒张血管，降低血压。如给予清醒大鼠静脉注射ADM2(1nmol/kg)后，其肾脏、肠系膜和尾动脉血管舒张，血压下降，心率加快，同等剂量的ADM2降压效应强于ADM。此效应可被NO合成抑制剂阻断，不受KATP通道阻断剂U-37883A的影响[20]。低盐饮食的羊输注血管紧张素Ⅱ伴或不伴ADM2(33ng/(kg•min))后发现，ADM2同ADM一样，能够拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的升压效应，扩张外周阻力血管，降低主动脉压。但ADM2降低血压的同时伴有心输出量和心率增加，且不像ADM一样影响血管紧张素Ⅱ对醛固酮的作用[21]。2)抑制血管钙化。血管钙化是慢性肾病晚期、甲状旁腺功能亢进等疾病的主要并发症。研究发现ADM2可抑制血管平滑肌细胞转化为成骨样细胞，抑制血管钙化。用尼古丁灌胃和肌肉注射维生素D3的方法建立大鼠血管钙化模型，可见大鼠血浆和主动脉中ADM2表达减少，ADM2受体系统表达上调，管壁钙质沉积和碱性磷酸酶活性增加。皮下埋植渗透泵连续给予钙化大鼠ADM2(100ng/(kg•h))28天后，ADM2明显降低了钙质沉积和血浆、血管中碱性磷酸酶活性，并在离体培养的血管平滑肌细胞中得到进一步验证。血管钙化后血管平滑肌细胞标志蛋白下调，如平滑肌-22α(smoothmuscle-22alpha，SM-22α)、α-SMA和钙调蛋白，而ADM2可以使上述蛋白表达水平恢复正常，抑制血管平滑肌细胞特征蛋白的丢失；ADM2上调钙化抑制蛋白基质γ-羧基谷氨酸结合蛋白(matrix-carboxyglutamicacid(Gla)protein，cMGP)，下调钙化转录因子核心蛋白结合因子α1(corebindingfactorα1，Cbfα1)基因表达、抑制了果蝇Mad基因1/5/8哺乳动物类似基因(mammalianhomologsoftheDrosophilaMadgene1/5/8，Smad1/5/8)信号通路，对骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白的表达没有明显的作用[22]。因此，内源性ADM2参与了血管钙化的发生发展，ADM2作为血管保护因子通过增加cMGP蛋白表达水平，抑制血管钙化。3)抗动脉粥样硬化。高脂血症是动脉粥样硬化的重要危险因素。ADM2能够降低ApoE-/-小鼠血中总胆固醇、低密度脂蛋白，显著升高高密度脂蛋白水平，缩小主动脉斑块面积，增加管壁厚度，从而减轻动脉粥样硬化发生发展[23]。进一步研究发现ADM2可以增加类脂磷酸酶PETN(phospha-taseandtensinhomologdeletedonchromosometen)蛋白表达，降低介导泡沫细胞形成的清道夫受体AmRNA和蛋白表达，这样巨噬细胞对LDL摄取减少，细胞内脂质含量减少，进而阻碍泡沫细胞形成，改善ApoE-/-小鼠体内动脉粥样斑块形成[24]。4)调控血管生成。研究发现ADM2是一个新的促血管生成因子。培养在基质胶上的人脐静脉内皮细胞，外源性给予的ADM2与其上CRLR/RAMP1、CRLR/RAMP2受体结合，5分钟后血管内皮生长因子受体2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGF-R2)磷酸化水平即上调，18小时后细胞VEGFmRNA表达水平显著上调，这表明ADM2的促血管生成作用可能部分与血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)信号通路有关[25]。用腺病毒转染的方法使局部缺血的大鼠后肢高表达ADM2，和对照组相比，ADM2高表达组大鼠后肢的毛细血管和小动脉密度明显增加。在培养的内皮细胞上证实，ADM2通过ERK，Akt/NOS/NO和VEGF/VEGFR-2途径诱导细胞迁移、管腔形成，从而促进血管生成[26]。近来有学者证实，ADM2稳定内皮细胞构架，通过调节血管内皮钙粘蛋白(vascularendothelialcadherin，VE-cadherin)，与VEGF协同作用，修剪畸形毛细血管丛，促进血管增生，形成有功能的血管网络。其中，MAPK/ERK1/2仅参与了ADM2的扩张管腔作用，而PI3/Akt与ADM2的扩张管腔、减少出芽作用均有关。
在体肿瘤模型中发现，阻断ADM2后，可抑制肿瘤生长。这可能是由于缺少ADM2的情况下，肿瘤块中血管生成紊乱，有效血供减少所导致[27]。5)调节内皮屏障作用。ADM2通过不同机制调节不同部位内皮屏障作用。有研究表明人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)中ADM2与CRLR/RAMP2结合通过cAMP途径加强细胞间连接，拮抗凝血酶诱导的内皮高通透性，维持内皮细胞屏障的稳定性[28]。亦有研究证实，大鼠冠脉微血管内皮屏障的稳定性与RhoA/Rock通路和Rac1活性有关，ADM2使此通路失活，致细胞微丝骨架排列紊乱，VE-cadherin丢失，破坏了内皮屏障作用；而HUVEC的稳定性不受RhoA/Rock通路调节[29]。
ADM2的肺脏保护作用及机制ADM2能够稳定培养的人肺微动脉内皮的屏障功能，降低小鼠机械通气引起的肺血管高通透性，改善机械通气相关性肺损伤[30]。在缺氧诱导肺微血管高通透性模型中，小鼠肺匀浆中ADM2和ADM转录水平升高，且这一现象在原代培养的大鼠微血管内皮细胞、小鼠心房肌细胞系HL-1、小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3、小鼠神经母细胞瘤细胞系NS20Y中得到了验证，其中仅大鼠微血管内皮细胞ADM2mRNA/ADMmRNA比值升高。进一步研究证明，ADM2表达增高可能是由于缺氧诱导因子1α增加了ADM2基因启动子活性。在人肺微血管内皮细胞中发现，ADM2通过与自身受体结合激活PKA途径浓度依赖性地降低内皮高分子通透性，亦可拮抗凝血酶诱导的内皮高通透性。在小鼠肺离体灌注模型中，ADM2可以降低毛细血管滤过系数，改善压力诱导的内皮高通透性，发挥稳定肺血管内皮屏障作用[31]。
ADM2的肾脏保护作用及机制研究证实肾脏中ADM2mRNA水平在皮质中表达最高，而自发性高血压大鼠肾皮质中ADM2mRNA水平显著低于WKY大鼠。施行了5/6肾脏切除术的大鼠，余肾的ADM2表达显著下降，而其受体系统表达增加。这表明ADM2作为内源性调节肽，在肾脏损伤的进程中起重要作用[32]。有研究用超声微泡造影剂介导的质粒转染方法使大鼠缺血再灌的肾脏高表达ADM2后，发现大鼠肾脏的超氧化物歧化酶显著升高，而丙二醛、髓过氧化物酶、细胞间细胞黏附分子1、内皮素-1、P-选择蛋白表达显著下降，肾组织凋亡细胞数目减少，这表明ADM2通过抗炎抗凋亡、抑制缩血管物质产生、减少机体氧化应激等作用保护了肾脏缺血再灌注损伤[33]。
结语
小分子活性肽肾上腺髓质素2已成为新的内源性保护因子，在心血管、肾脏、肺脏等重要脏器发挥着广泛而强大的生物学效应，参与机体内环境稳态的调节，并在高血压、心肌缺血、心功能衰竭和肾功能衰竭等多种疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用。除此之外，肾上腺髓质素2可能在其他系统和肿瘤疾病中有着更为广泛的生物学作用，更加深入地了解其生物学效应及作用机制，找到更多肾上腺髓质素2的功能拮抗物质，有助于我们对降钙素基因相关肽超家族更为全面的认识，并对今后相关的基础和临床研究提供重要的指导作用。
作者：谢静综述曾强审校单位：解放军总医院国际医学中心
