论芝麻白绢病病原菌的生物学特征

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致病性测定依据Koch法则，将菌株Sr－1的菌核在PDA平板上28℃培养10d，待产菌核。分别用菌饼（直径5mm）和菌核刺伤、自然无伤接种健康芝麻植株根部［3］，即取菌饼和菌核分别贴于根部人工十字划伤处和自然无伤处，以接种PDA培养基为空白对照，并外加浸有无菌水的棉球保湿，置于自然环境下培养（25～30℃）。每处理3次重复，共接种15株。3d后观察发病情况，并描述症状。将发病的植株带回实验室，剪取前沿病部组织，保湿培养，诱导菌核产生。然后将菌核用75％酒精处理10s，0．1％升汞消毒3min，无菌水冲洗3次后置于PDA平板上28℃培养，获得再分离菌株，观察再分离菌株的菌落与菌核形态，并与原接种菌株Sr－1在相同培养条件下进行比较。

病原菌鉴定

形态学鉴定将菌株Sr－1的菌核接种在PDA平板上，28℃培养3d，观察菌落形态。继续培养10d后，用数显游标卡尺随机测量100粒成熟菌核的直径，并记录菌核形成过程的形状、大小、色泽等，光学显微镜下观察菌丝形态。

分子鉴定DNA的提取按以下方法进行：将菌株Sr－1的菌核接种在PDA平板上，28℃下培养3d，用5mm的打孔器在菌落边缘切取菌饼，移接至100mL马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，28℃静止培养5d。将菌丝体用灭菌漏斗（内垫3层灭菌擦镜纸）过滤，去除液体培养基，并用灭菌水冲洗菌丝体2～3次。用SDS法提取菌株Sr－1的基因组DNA：挑取适量菌丝体于灭菌的研钵中，加入适量SDS裂解液［配方：200mmol／LTris－HCl（pH7．5）、25mmol／LEDTA（pH8．0）、250mmol／LNaCl、0．5％SDS］充分研磨（研磨过程尽量不起泡），转移适量菌丝体研磨液于EP管中，65℃水浴50min，每隔10min上下颠倒数次；加入5mol／L的醋酸钾，4℃、12000r／min离心10min，取上清；加入1／2上清体积的Tris饱和酚（北京索莱宝科技有限公司生产）振荡后静置30～60s，再加入1／2体积的氯仿振荡，4℃、12000r／min离心10min，取上清，用等体积氯仿重复抽提2次；加入0．6倍体积异丙醇和0．1倍体积的醋酸钠充分振荡，放置冰箱－20℃沉淀30min之后，4℃、10000r／min离心10min，弃上清。用75％乙醇清洗沉淀2次，无水乙醇清洗1次，开口放置3～4h。晾干后加入50μL的双蒸水溶解沉淀，置于－20℃冰箱备用。用真菌核糖体基因内转录间隔区（rDNA－ITS）通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）（由大连宝生物有限公司合成）对菌株Sr－1的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系（总体积50μL）：ddH2O19μL、ITS1与ITS4各2μL，DNA模板（菌株Sr－1基因组DNA）2μL，2×PCRMasterMix［天根生化科技（北京）有限公司生产］25μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；54℃退火40s；72℃延伸45s，32个循环，最后72℃延伸10min。取5μLPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，以200bpDNALadder（天津博美科生物技术有限公司生产）作为DNA分子量标准，5V／cm电泳后，用溴化乙锭染色20min，于凝胶成像系统（型号：GelDocXR，美国Bio－Rad公司生产）中观察、记录电泳结果。委托上海英骏生物技术有限公司对扩增的菌株Sr－1的rDNA－ITS片段进行纯化和测序后，通过NCBI网站（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／）上的BLAST程序与相关真菌的rDNA－ITS序列进行同源性比较，并用软件MEGA5．1Beta2构建基于rDNA－ITS序列的系统发育树，对菌株Sr－1进行分子鉴定。

生物学特性测定

温度对病原菌生长及菌核形成的影响将菌株Sr－1的菌核接在PDA平板上28℃培养3d后，用内径5mm的打孔器从菌落边缘切取菌饼，接于PDA培养基平板中央，将PDA平板分别放置于4℃、7℃、10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃的系列温度梯度下培养，每处理设3个重复。3d后用十字交叉法测量菌落直径，并计算3个重复的平均值，平均值减去5mm作为病原菌实际生长的菌落直径。10d后记录产生的菌核数量，并用数显游标卡尺（GB／T14899－94，桂林广陆数字测控股份有限公司生产）测量菌核直径。

方法将菌株Sr－1接于pH为4．0、4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0的100mLPDB液体培养基中［4］，28℃下静止培养5d，真空抽滤去掉培养液，40℃烘干12h后称菌丝体干重。每处理3次重复。

碳、氮源对病原菌生长及菌核形成的影响基础培养基配方：磷酸二氢钾1g、氯化钾0．5g、硫酸镁0．5g、硫酸铁0．01g、琼脂粉17g、水1000mL。测试不同碳源时，在1000mL基础培养基中加入2g硝酸钾作为氮源，再分别加30g不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D－海藻糖、甘露醇、木糖醇、鼠李糖、L－阿拉伯糖、D－果糖、D－山梨糖、D－半乳糖、可溶性淀粉、菊糖）；测试不同氮源时，在1000mL基础培养基中加入20g葡萄糖作为碳源，再分别加入2g不同氮源（甘氨酸、L－组氨酸、脲、L－胱氨酸、DL－丙氨酸、氯化铵、硝酸钠、磷酸二氢铵）。按1．4．1方法将菌株Sr－1转接至含有不同碳、氮源的培养基平板中央，28℃下培养3d，用十字交叉法测量菌落直径，并计算3个重复的平均值，平均值减去5mm作为病原菌实际生长的菌落直径。10d后统计菌核数量并测量其直径，每处理3次重复。天然培养基对病原菌生长及菌核形成的影响供试4种天然培养基分别为PDA、肉汁胨培养基（牛肉膏3g、蛋白胨8g、蔗糖10g、琼脂16g、自来水1000mL）、玉米粉琼脂培养基（玉米粉300g、琼脂16g、自来水1000mL）、燕麦片琼脂培养基（燕麦片30g、琼脂16g、自来水1000mL）。供试菌株与测试方法同1．4．3。

结果与分析

病害发生与症状芝麻白绢病主要发生在芝麻主茎基部及根部。发病初期植株叶片自下而上渐萎蔫（图1a），湿度大时在近地表茎基部及根部生白色绢丝状物，后期由白色菌丝体发育产生菌核（图1b），幼苗期显症病株一般数日内死亡。纵剖病株主茎基部，可见韧皮部凹陷，木质部发生褐变（图1c），将病根泥土清洗并在室温下保湿5～7d后产生菜籽大小、先白色后黄色、最后为褐色的菌核。在病组织上产生的菌核多为球形或不规则形，直径0．5～1．0mm，内部白色。该病在芝麻苗期至开花结果期均可发生。

病原菌致病性将菌株Sr－1接种芝麻植株后第16d，12株接菌核或菌饼的芝麻植株均发病，并产生与田间自然发病植株相似的症状，而对照植株均无发病症状。发病植株根部有放射状白色菌丝体，后期菌丝集结形成褐色菌核。重新分离得到的菌核与原接种菌株Sr－1的菌核在PDA平板上28℃下培养3d，两者菌落的形态和菌核大小基本一致。表明菌株Sr－1对芝麻植株有致病性。

病原菌形态菌株Sr－1在PDA平板上菌落圆形，菌丝白色绢丝状，并呈辐射状向四周扩展，28℃培养3d即可长满直径70mm的PDA平板，7d左右菌落表面开始形成白色菌丝团，菌核开始形成，10d后菌核大量形成。菌核先为白色，后渐变黄色，最后变成褐色，内部灰白色，球形或不规则形，表面光滑且有光泽，直径为0．5～1．2mm。

分子鉴定用通用引物ITS1和ITS4对菌株Sr－1的rDNA－ITS序列进行扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳后，显示约650bp的单一条带（图2）。产物经纯化、测序后，获得642bp的rDNA－ITS片段（GenBank登记号：JQ982485）。

温度对病原菌生长及菌核形成的影响表1结果表明，该菌的生长温度范围为13～37℃，在31℃下菌落的直径最大，在22～34℃生长较快，且能产褐色成熟菌核。因此，可将22～34℃视为该菌的适宜生长温度，31℃为最适生长温度。低于13℃或高于37℃菌丝停止生长，且低于22℃或高于34℃都不产生成熟菌核。将菌株Sr－1的rDNA－ITS序列与GenBank中已有的相关DNA序列进行比较发现，芝麻白绢病病菌与罗氏阿太菌Atheliarolfsii（无性态：齐整小核菌Sclerotiumrolfsii）有89％～98％的最大相似性。在构建的基于rDNA－ITS序列系统发育树（图3）中，菌株Sr－1与罗氏阿太菌相聚于同一群。结合病原菌的形态特征、rDNA－ITS同源性及系统发育树的分析结果，将菌株Sr－1鉴定为罗氏阿太菌Athelrolfsii（Curzi）C．C．Tu＆Kimbr。

不同酸碱度对病原菌生长的影响菌株Sr－1在pH4．0～9．0范围内均可生长，其中在pH6．5～7．0中生长最好，表明弱酸性至中性有利于芝麻白绢病菌生长。由图4中可以看出，在pH6．5以下的酸性区域中，菌丝体的生长量随pH的增大而平缓上升，而在pH7．0以上的碱性区域中，菌丝体的生长量随pH增高而下降的幅度相对较大。该结果表明，与酸性环境比较，碱性环境不利于该菌生长。

碳、氮源对病原菌生长与菌核形成的影响菌株Sr－1在13种供试碳源培养基上均能生长，但不同碳源对该菌生长及菌核形成的影响程度有明显差异。在以D－海藻糖和D－山梨糖各自作为唯一碳源并配与硝酸盐为氮源的生长条件下，培养3d不仅菌落最大（菌落直径均大于83mm），且培养至第10d形成的菌核数量最多（表2）；其次具有较大菌落生长量且形成菌核的碳源是木糖醇、甘露醇、鼠李糖和D－半乳糖；在以可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L－阿拉伯糖、D－果糖和菊糖作为唯一碳源并配与硝酸盐为氮源的培养基上菌株Sr－1可不同程度地进行营养生长（菌落直径46．5～75．5mm），但培养至第10d观察不到菌核的产生。在不同碳源合成培养基上形成的菌核的平均直径为0．6～0．8mm。8种供试氮源对菌株Sr－1的营养生长和菌核形成的影响也有明显差异（表3）。该菌在以L－组氨酸、硝酸钠、DL－丙氨酸作为唯一氮源并配以葡萄糖为碳源的合成培养基上生长速度最快，培养3d菌落直径大于51mm，但培养至第10d仍不产生菌核；而在以磷酸二氢铵或氯化铵为氮源的培养基上，虽然培养3d菌落直径小于50mm，但培养至第10d时可产生菌核。在不同氮源合成培养基上形成的菌核的平均直径为0．6～0．7mm。

不同天然培养基对病原菌生长及菌核形成的影响菌株Sr－1在4种不同的天然培养基（燕麦、肉汁胨、玉米、PDA）上均可生长且形成菌核，其中在PDA和燕麦培养基上培养3d菌落直径最大（大于71mm），在PDA上培养至第10d产生的菌核数量最多（平均284粒／皿），平均菌核直径最大（1．2mm），而在燕麦培养基上产生的菌核数量最少（平均15粒／皿）。在玉米培养基上的菌落生长量及形成的菌核数仅次于PDA，在肉汁胨培养基上形成的菌核数介于玉米培养基和燕麦培养基之间。这4种天然培养基上形成的菌核的平均直径为0．9～1．7mm（表4），均大于各种碳、氮源合成培养基上形成的菌核平均直径（0．6～0．8mm）。

结论与讨论

关于芝麻白绢病菌的分子鉴定及生物学特性研究，很少见有文献报道。但对齐整小核菌（Sclerotiumrolfsii）引起的其他作物白绢病的报道较多。该菌可侵染62科200多种植物［5］，如草莓［6］、山楂［3］、花生［7］、辣椒［8］、韭菜［9］、油茶［10］、白术［11］、苜蓿［12］、茉莉［13］、烟草［14］等，在不同地区引起不同作物的白绢病。根据柯赫氏法则对芝麻白绢病菌的致病性进行测定，根据病原菌的形态特性及rDNA－ITS序列，将供试菌株Sr－1鉴定为罗氏阿太菌Atheliarolfsii（无性态：Sclerotiumrolfsii，异名：Corticiumcentrifugum）。关于芝麻白绢病，国内文献记载台湾、广西及湖北有分布［2］。该病在河南及其以北省份未见发生报道。本次调查，首次确认河南省有芝麻白绢病的分布，并在国内首次用分子技术对该病的病原菌进行鉴定。Atheliarolfsii属土传性病原菌，腐生性强。Nalim等［15］从花生田分离获得25个菌丝亲和组（MCG），组内的分离株菌丝间有亲和性，同一株花生可以分离到1～5个MCG，但一个MCG只能侵染一株植株。该菌适宜生长温度为22～34℃，并易形成菌核，抵抗不良环境，随着温度的降低其生长的强度也降低，这与田间高温时白绢病害发病严重的情况相符合。芝麻白绢病菌与韭菜白绢病菌［9］同属于一个种，因此，生物学具有一些相同之处，如两者生长的最适温度均为31℃，其次芝麻白绢病菌在pH4．0～9．0范围内均可生长，韭菜白绢病菌菌丝生长pH范围为2．0～9．0，这均与前人报道的病菌在pH4．05～8．97范围可生长基本相符［6］。但由于病原菌寄主的差异，芝麻白绢病菌的最适生长pH值为6．5，这与韭菜白绢病菌生长的最适pH3～4不同。

研究表明芝麻白绢病菌能广泛利用碳氮源，但对不同碳氮源的利用有较大差异。在13种测试碳源中，最大菌落与最小菌落平均直径的差异高达41．5mm；8种测试氮源中，最大菌落与最小菌落平均直径相差11．0mm，说明不同碳源对该菌生长的影响明显大于氮源。姚圣海等［16］报道了碱性肥料（尿素、碳酸氢铵、碳酸钾）和中性肥料（硝酸钙、硝酸钾）能抑制菌核的萌发。Gubitz等［17］和Sachslehner等［18～20］的研究发现，花生白绢病菌能够分泌一些分子量大（40～60kDa）、在酸性条件下性质稳定的酶类，如甘露糖甘酶、甘露聚糖酶等，从而使得白绢病菌能够很好地利用碳源，促进其生长。因此，不同酸碱度的肥料的施用对芝麻白绢病发生的影响值得进一步探讨。本次共测试了13种碳源及8种氮源对芝麻白绢病菌生长及菌核形成的影响。在13种碳源中，有7种（可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、L－阿拉伯糖和菊糖）在与硝酸盐作为氮源的组配条件下，芝麻白绢病菌虽然能生长，但不形成菌核；然而，在氮源测试中，病原菌在铵盐与葡萄糖的组合条件下仍可以产生菌核。该结果表明：芝麻白绢病菌的营养生长（vegetativegrowth）阶段与菌核形成（sclerotialformation）阶段对碳氮源组合有着不同要求；在不同氮源中，铵盐属速效氮源，比硝酸盐及其他有机氮更易被该菌用于菌核形成所需的蛋白质。在碳氮源测试中所用的培养基均为成分明确的合成培养基。芝麻白绢病菌在合成培养基上产生的菌核平均数量均低于40粒／皿，且菌核的平均直径均小于0．9mm。而在4种天然培养基中除了燕麦培养基的菌核数量较少之外，其它3种（肉汁胨、玉米、PDA）的菌核数均远多于合成培养基，且天然培养上形成的菌核的平均直径均大于0．9mm。该结果表明，营养全面、充足的天然培养基有利于芝麻白绢病菌形成更多、更大的菌核。

作者：王雅黄思良何朋朋牛小瑞黎起秦单位：．广西大学农学院南阳师范学院生命科学与技术学院