大鼠脊柱种植性肿瘤模型

前言：本站为你精心整理了大鼠脊柱种植性肿瘤模型范文，希望能为你的创作提供参考价值，我们的客服老师可以帮助你提供个性化的参考范文，欢迎咨询。

【摘要】目的采用瘤块种植法制备脊柱肿瘤动物模型。方法将SHZ-88大鼠乳腺癌细胞株接种雌性SD乳鼠,成瘤后植入去胸腺SD大鼠腰椎内,制成大鼠脊柱种植性肿瘤的动物模型。结果瘤块植入术后15d病变节段大体标本见椎体表面有明显隆起的软组织肿块形成,包裹部分椎体表面;矢状面见椎体骨质凹陷,为肿瘤组织呈鱼肉样,肿瘤组织向周围骨质浸润;病理切片证实肿瘤形成。模型组成瘤率80%。结论瘤块种植法可构建大鼠脊柱种植性肿瘤模型。

【关键词】脊柱疾病;脊椎肿瘤;疾病模型,动物

ABSTRACT:ObjectiveToestablishaspinaltumormodelwiththetumorsegmentplantmethod.MethodsSHZ-88mammarycancercelloftheratwasasubcutaneousinjectedintofemalenewbornrattoproducesubcutaneouslump.Thentumorsegmentswereplantedintothelumbarvertebralofthefemalethymectomizesrats,toestablishratspinaltumormodel.ResultsTheinvolvedvertebralbodieswasobservedencapsulatepartsofthevertebralbody,at15daysafterthesurgery.Bonedefectcanbeseeninthesagittalplane,tumortissueappearsgray-whiteincolorandinfiltrationintothevertebralbody.Themodelofspinaltumorwasestablishedin80%rats.ConclusionSpinaltumormodelinratsimulatedthemalignanttumorcharacter,whichhasgreatsignificationinthestudythecharacterofthemetastasisspinalneoplasms,andcomparisonsofthecurativeeffectsofdifferenttherapies.

KEYWORDS:spinaldisease;spinalneoplasms;diseasemodels,animal

良好的肿瘤动物模型要具备以下特点:相似性、可重复性、可靠性、适用性、可控性、易行性及经济性等［1］。目前常用的骨肿瘤动物模型方法有诱导法和移植法［2］,其中通过移植法建立骨肿瘤模型具有特性明确、生长一致性好、实验周期短,可反复复制等特点,因此广为采用。在临床上脊柱肿瘤多为转移性,且病期较晚［3］。建立脊柱转移性肿瘤的动物模型,有助于研究脊柱转移性肿瘤的相关特性,比较各种治疗方法的疗效。笔者采用SHZ-88大鼠乳腺癌细胞株接种雌性SD乳鼠,成瘤后植入去胸腺SD大鼠腰椎内,初步建立大鼠脊柱种植性肿瘤模型。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与动物

SHZ-88大鼠乳腺癌细胞(中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研究所)。SD大鼠(清洁级)由福建医科大学实验动物中心提供［许可证号SCXK(沪)2007-300-5］,体质量(420±20)g。

1.1.2主要试剂

PBS缓冲液(美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),FCS-1640培养液(美国Gibco公司),0.25%胰蛋白酶Trypsin(美国Gibco公司),水合氯醛(上海山浦化工有限公司)。

1.1.3主要仪器

生物洁净工作台(AIR-TECHBCM-1000A型,苏州安泰空气技术有限公司)。CO2培养箱(3111型,美国ThermoForma公司)。1×70荧光倒置式相差显微镜(日本Olympus公司)。光学显微镜(BH-2型,日本Olympus公司)。显微外科手术器械、玻璃培养瓶、培养皿、X线摄片机(美国Kodak公司)。

1.2方法

1.2.1乳腺癌细胞培养

SHZ-88大鼠乳腺癌细胞培养于含10%胎牛血清的FCS1640培养液,隔天换液,2~3d传1代。

1.2.2建立脊柱肿瘤动物模型

1.2.2.1皮下肿瘤模型

取处于对数生长期的细胞消化后,用无血清的培养液稀释成1×107mL,各取0.3mL注入8只7日龄雌性SD大鼠右腋皮下,并用棉签局部压迫1min,防止悬液漏出。每日观察肿瘤生长情况。瘤块增大至约1.5cm×1.0cm,取肿瘤组织用10%福尔马林溶液固定,作病理切片,H-E染色。

1.2.2.2去胸腺模型

参照文献［4］方法去除SD大鼠的胸腺。

1.2.2.3脊柱肿瘤模型

将去胸腺SD大鼠20只,随机分为模型组与对照组,每组10只。10%水合氯醛麻醉、固定、消毒。取腹部正中切口,逐层进入腹腔,暴露腹腔后壁。以旋髂深动脉为定位标志,打开后腹膜,显露第6腰椎,用磨钻在椎体上开口,并在椎体中磨造出一个口小底大的空腔(图1)。取皮下肿瘤瘤体,置于无血清培养液中,剪成直径约0.5mm瘤块。将瘤块填入模型组椎体空腔内,对照组不填入瘤块,用骨蜡封闭开口,逐层缝合。每日观察大鼠生长情况,第2周X线摄片检查肿瘤生长情况,处死后取出椎体标本,病理切片,H-E染色检查。

2结果

2.1大鼠乳腺癌细胞

SHZ-88大鼠乳腺癌细胞呈单层贴壁样生长,光镜下见细胞为多边形,少数梭形,树枝样突起,细胞大小不一,可见多倍体细胞,核分裂相易见,并出现病理性核分裂。SHZ-88大鼠乳腺癌细胞培养于含10%胎牛血清的FCS1640培养液中,细胞增殖迅速,2~3d即可贴满瓶壁。

2.2皮下肿瘤模型

细胞接种当天局部可见由细胞悬液形成的液泡,第2日液泡吸收,局部变平整。接种5d后可触及皮下结节,其后瘤块生长迅速,接种12d左右后瘤块可增大至约1.5cm×1.0cm,成瘤率100%。肿瘤组织呈鱼肉样,并可见坏死,病理切片H-E染色见肿瘤细胞交织排列,大小不一,形态不规则,异形性明显,细胞核大小不一,深染,病理性核分裂像易见。

2.3去胸腺模型

为提高成年SD大鼠的成瘤率,先行胸腺摘除,破坏其自身免疫系统。分离胸腺两叶下极时,切口即与胸腔相通,出现气胸症状,应迅速游离下极摘除胸腺,收紧缝线,关闭切口,并立即对右胸腔穿刺抽气,症状可迅速缓解。大鼠胸腺分为左右两叶,应仔细检查取出的胸腺组织是否完整,若不完整,则不能作为去胸腺鼠模型。脊柱肿瘤植入手术在术后5d后进行,以恢复大鼠对后续手术的耐受力。

2.4脊柱乳腺癌种植瘤模型

术中、术后均无死亡。术后3d内,在饮水中加入适量抗生素,预防切口感染。2组切口愈合较好,未见明显感染者。部分出现左下肢跛行,可能系术中剥离腰大肌时神经牵拉引起,于术后5~10d内均恢复正常。术后15d时X线检查见植入部位椎体前缘凹陷,瘤块植入组椎体骨质密度较对照组略有改变,但不明显(图2)。处死后,显露肿瘤植入椎体,模型组8只见椎体表面有隆起的软组织肿块,其余未见肿瘤生长。对照组均未见肿瘤生长。15d2组均未见明显神经功能改变。暴露病变节段的椎体,模型组8见椎体表面有软组织肿块形成,成瘤率为80%,而对照组中未见肿瘤形成。

2.5肿瘤病理学

病变节段大体标本见椎体表面有明显隆起的软组织肿块形成,包裹部分椎体表面,矢状面上见椎体骨质凹陷,为肿瘤组织呈鱼肉样,已填满空腔。镜下见肿瘤周围骨质吸收,形成的骨质缺损较原有的空腔大,肿瘤组织向周围骨质浸润,形成一半环形浸润带。椎体中央见一肿瘤组织,并向周围骨小梁中浸润生长(图3),但未突破椎体后壁。

3讨论

3.1本脊柱肿瘤动物模型的特点

SHZ-88大鼠乳腺癌细胞株是南京铁道医学院于1987年用7,12-二甲基苯蒽(DMBA)在雌性SD大鼠上诱导形成后,将癌组织体外培养传代后形成［5］。SHZ-88细胞生物学特性稳定,具备快速生长的恶性肿瘤细胞特点,在同种动物体内具有致瘤性,是研究肿瘤特性的良好体外实验模型［6］。在本实验以SHZ-88细胞接种于雌性SD乳鼠中,成瘤率达100%。乳腺癌是最容易发生脊柱转移的癌症之一,因此采用乳腺癌细胞作为种子细胞制备脊柱转移性肿瘤动物模型能提高模型制备的成功率,及临床生物学特性的相似性。本实验中为进一步提高实验的成功率,所有待移植乳腺癌瘤块的SD大鼠均先期行胸腺摘除术,降低大鼠的自身免疫力,提高模型成功率。

瘤块植入以后位于腹腔内,无法直接观察肿瘤的生长,由于大鼠的脊柱骨质较少,即使有肿瘤病变,在X线下的表现也不甚明显。判断肿瘤的生长情况主要还是依据处死后取出的病理标本判断。在处理组中成瘤率达80%,说明该模型有较高的成功率。大体标本显示为肿瘤组织呈鱼肉样,已填满空腔,周围骨质吸收,形成的骨质缺损较原有的空腔大,肿瘤组织向周围骨质浸润,在椎体中形成一半环形与周围正常骨组织不同浸润带,说明该肿瘤模型的生长特性与人类肿瘤相似。人类脊柱肿瘤的一个重要临床特点是椎体骨质破坏后,椎体压缩造成脊髓压迫症状。Mantha等报道应用大鼠乳腺癌细胞株CRL-1666建立大鼠移植性脊柱转移瘤的方法中,在瘤块植入10~15d后,植入组出现下肢功能的障碍［7］。但在本组实验中并未出现脊髓压迫引起的下肢功能障碍。究其原因可能有:(1)大鼠为爬行动物,脊柱的受力与人类不同,椎体破坏后,沿椎体纵轴的压缩力较小,尚不能引起椎体压缩;(2)SHZ-88细胞侵袭较弱,无法在短时间内突破椎体后壁,侵入椎管内压迫脊髓;(3)骨蜡与椎体表面骨组织的结合力差,椎体磨造的开口用骨蜡封闭后可能脱落,导致肿瘤向前方阻力小的方向生长。此不足有待日后实验中近一步改进。

3.2制作脊柱肿瘤模型的常见并发症及预防

瘤块植入手术可能出现的并发症:(1)腹部大血管损伤。瘤块植入后需缝合两侧腰大肌防止瘤块脱出,腹部的大血管多位于左侧腰大肌前方,易损伤,在缝合时最好先将大血管适当分离,向左侧牵开。(2)腰神经损伤。在分离附着于椎体表面的腰大肌时可能造成腰神经的牵拉损伤,术后出现跛行症状,于术后5~10d内均可恢复正常。(3)脊髓损伤。用磨钻在椎体上磨造容纳瘤块的空腔时,应注意控制深度,以防穿出椎体后壁,损伤脊髓。术后可能出现的并发症有切口感染,腹腔内感染等,注意手术过程中的无菌操作,术后给予适当的抗感染治疗等措施,可避免。

【参考文献】

［1］郝光荣.实验动物学［M］.上海第二军医大学出版社,2002:198-199.

［2］GuoYJ,MazarAP,LebrunJJ,etal.Anantiangiogenicurokinase-derivedpeptidecombinedwithtamoxifendecreasestumorgrowthandmetastasisinasyngeneicmodelofbreastcancer［J］.CancerRes,2002,62(16):4678-4684.

［3］唐焕章,徐皓,符臣,等.病变椎体切除并重建治疗脊柱转移性肿瘤［J］.实用医学杂志,2006,22(1):676-678.

［4］熊海波,夏穗生,温浩.去胸腺大鼠模型的建立及改进［J］.中华器官移植杂志,2004,25(4):214.

［5］苏宁,张晓明,韩月明,等.SHZ-88大鼠乳腺癌细胞系的建立及其生物学特性观察［J］.癌症,1991,10(5):378-381.

［6］苏宁,尹科祥,黄穆涵,等.SHZ-88大鼠乳腺癌细胞系生物学特征［J］.南京铁道医学院学报,1995,14(3):143-147.

［7］ManthaA,LegnaniFG,BagleyCA,etal.Anovelratmodelforthestudyofintraosseousmetastaticspinecancer［J］.JNeurosurgSpine,2005,2(3):303-307.