医学高效液相色谱

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【关键词】柴胡；,,高效液相色谱

摘要：目的制定柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量测定方法。方法用高效液相色谱蒸发光散射检测法（HPLCELSD）,AlltimaC18色谱柱,流动相甲醇水（80∶20）,速度0.8ml・min1；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度40℃，气压3.5bar。结果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分别在1.908~19.08μg（r=0.9996）和1.804~18.04μg（r=0.9992）范围内线性关系良好,平均回收率分别为98.35%（RSD=1.26%）和97.64%（RSD=1.58%）。结论该方法简便、灵敏、可靠、准确、重现性好,可作为柴胡药材的质量控制方法。

关键词：柴胡；高效液相色谱蒸发光散射检测法；柴胡皂苷

DeterminationofSaikosaponina,dinRadixBupleuribyHPLCELSD

Abstract：ObjectiveTodeterminesaikosaponina,dinRadixBupleuribyHPLCELSD.MethodsHPLCELSDwasusedinthequantitativeanalysisbyusingAlltimaC18chromatographycolumnandmethanolwater(80∶20)asamobilephase.Theflowrateofmobilephasewas0.8ml・min1.Thetubetemperatureofthedetectorwas40℃.Thepressofpureairwas3.5bar.ResultsThelinearrangesforsaikosaponinaanddwere1.908~19.08μg（r=0.9996）and1.804~18.04μg（r=0.9992）,theaveragerecoverieswere98.35%(RSD=1.26%)and97.64%(RSD=1.58%),respectively.ConclusionThismethodiseasy,sensitive,reliable,accurate,reproducibleandcanbeusedasthequalitycontrolmethodofRadixBupleuri.

Keywords：RadixBupleuri;HPLCELSD;Saikosaponin

柴胡药材来源于伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。为常用中药,在我国已有2000多年药用历史,具有和解表里、疏肝、升阳之功效［1］。其主要有效成分为柴胡皂苷,其中柴胡皂苷a，d的活性较强,具有抗炎、保肝、降低血中胆固醇等药理活性［2］。应用高效液相色谱法测定柴胡皂苷a，d含量的报道较多［3，4］。但由于检测波长在210nm,杂质峰干扰十分严重,检测灵敏度低,影响了含量测定的准确性。本文应用HPLCELSD法同时测定柴胡皂苷a，d的含量,其杂质峰干扰小,分离度好,灵敏度高,出峰时间短,便于操作。

1仪器与试药

高效液相色谱仪：Agilent1100系统，SEDEX75型蒸发光散射检测器；超声波清洗机（中国华南超声波设备厂），工作频率25kHz，功率250w。柴胡皂苷a，d对照品购自中国药品生物制品检定所，含量测定用,批号分别为110777200303和110778200402；甲醇为色谱纯（CALEDONLABORATORIESLSD.），水为重蒸水，其它试剂均为分析纯；柴胡药材经鉴定为柴胡BupleurumchinenseDC.的根。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为AlltimaC18(250mm×4.6mm,5μm);流动相：甲醇水（80∶20）；速度0.8ml・min1，柱温25℃；检测器参数：漂移管温度40℃，气压3.5bar。在选定的条件下，柴胡皂苷a、d对照品与样品中其它组分色谱峰可基线分离，峰形好。按柴胡皂苷d峰计算，理论板数为3000以上。柴胡皂苷a，d对照品，供试品的高效液相色谱图见图1。

1.柴胡皂苷a2.柴胡皂苷da供试品图谱b对照品图谱

图1高效液相色谱图（略）

2.2对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a9.54mg和柴胡皂苷d9.02mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备取柴胡药材粉末（过60目筛）约1g，精密称定，置25ml量瓶中，加入5%氨水甲醇20ml，超声处理40min，放置至室温，加5%氨水甲醇至刻度，摇匀，静置，精密吸取上清液20ml置蒸发皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4线性关系考察分别精密吸取柴胡皂苷a和d的混合对照品溶液2，5，10，15，20μl注入高效液相色谱仪中，分别测定柴胡皂苷a和d的峰面积。以峰面积自然对数值为纵坐标，进样量的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线。柴胡皂苷a在1.908~19.08μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=5.89721.5336X，r=0.9996；柴胡皂苷d在1.804~18.04μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=5.86191.4965X，r=0.9992。

2.5精密度实验精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样5次，测定峰面积，结果柴胡皂苷a和d的RSD分别为1.18%和1.53%，表明仪器的精密度良好。

2.6稳定性实验取样品溶液,按含量测定方法及色谱条件分别置0，2，4，6,8h测定，结果柴胡皂苷a和d的RSD分别为1.29%和1.68%，表明样品溶液在8h内稳定。

2.7重复性实验精密称取同批号样品6份，按含量测定方法及色谱条件进行测定，结果样品中柴胡皂苷a和d的平均含量分别为11.4541，8.3612mg・g1，RSD分别为1.34%和1.82%。

2.8回收率实验采用加样回收法，，取已知柴胡皂苷a，d含量的样品6份，每份约0.5g，精密称定，分别加入柴胡皂苷a对照品6.0544mg和柴胡皂苷d对照品4.4621mg，按含量测定方法及色谱条件进行测定，结果柴胡皂苷a和d的平均回收率分别为98.35%（RSD=1.26%）和97.64%（RSD=1.58%）。

2.9样品测定取不同批号的药材，按上述供试液的制备方法制备供试液。精密吸取对照品溶液5，20μl及供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，按外标两点法测定柴胡皂苷a，d含量，结果见表1。

3讨论

3.1柴胡皂苷a，d为柴胡的主要有效成分,但在提取过程中其结构易发生变化,因此，严格控制提取条件十分重要。本实验比较了甲醇、5%吡啶甲醇、5%氨水甲醇的提取效果。结果表明，5%氨水甲醇溶液超声提取效果最佳。

表1样品含量测定结果（略）

3.2采用5%氨水甲醇溶液超声处理，分别测定了不同提取时间（20，30，40，50min）样品中柴胡皂苷a，d的含量，结果在40～50min内样品中柴胡皂苷a、d的含量基本不变。故文中采用超声40min的方法。

3.3本文采用HPLCELSD法测定柴胡中柴胡皂苷a，d的含量,较采用紫外检测器检测,能明显减少杂质峰的干扰,峰形好,出峰时间短,有利于提高检测的准确度和工作效率。

参考文献：

［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：198.

［2］张本.柴胡属植物药理作用研究概况［J］.吉林中医药，1983，3(1):39.

［3］王鹏，贾凌云，孙启时，等.不同产地柴胡中柴胡皂苷的含量测定［J］.沈阳药科大学学报，2004，21(3):193.

［4］林东昊，茅仁刚，王智华，等.23种国产柴胡属植物中柴胡皂苷a、c、d含量的RPHPLC测定［J］.药物分析杂志，2004，24(5):479.