医学人类胚胎干细胞建立
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摘要：人类胚胎干细胞(HESCs)在人类发育生物学研究及再生医学中具有重要的应用前景。人们在HESCs建系及其分化研究上已取得一些进展，但各个细胞系的生物学特性有一定差异，文章讨论了有关HESCs的标准及相关问题。
作为人类早期胚胎学研究的窗口及其在再生医学中的潜在应用，HESCs研究显得非常重要。一些研究人和动物胚胎系统发生学的分子生物学家对HESCs功能性分析的分子学和细胞学标准作了一些评述，并指出未来一些重要的研究方法和途径。本文讨论了HESCs的研究进展，旨在就HESCs评价标准进行科学讨论。
1HESCs的基本特点
胚胎干细胞(ESCs)有两个比较显著的特征：①可以自我更新并保持多能性和未分化状态；②具有分化为多种特定细胞类型的能力。HESCs来源于人类早期胚泡(受精后5d)的胚胎内细胞团(ICM)。正如鼠胚胎干细胞(MESCs)一样，HESCs具有以下几个基本特点：①核型正常；②体外适宜培养条件下可无限扩增和存活；⑧冷冻和解冻后多数细胞可以复苏；④体内外可以分化为多种细胞类型。HESCs的这些特点已得到了确认，但一些重要问题还有待解决。
2新的HESCs系的建立
许多国家暂停资助用于HESCs研究的国家基金，使HESCs建系研究受到限制，但由于已有经验及其诱人的应用前景，众多科学家及一些私人研究机构都在竞相从事HESCs研究。相信会有更多新的HESCs系的建立。
3HESCs培养条件
目前，分离HESCs的方案均源自于MESCs的相关资料。即用免疫外科法分离得到人类胚泡ICM，无Ca2+-Mg2+培养液离散后培养在经处理以抑制其扩增的MEF或人类饲养层细胞上。资料报道适宜培养条件下HESCs可在体外未分化状态下存活许多代(高达8O代)。
除了特定生长因子需求外，HESCs培养条件与小鼠相似。MESCs需要细胞因子如白血病抑制因子(LIF)，维持其多能性和未分化状态，而HESCs多能性维持则不依赖于LIF，MEF条件培养基是否维持HESCs多能性的信号分子尚未确定。另外，在培养过程中，HESCs同其它人类细胞一样需要成纤维细胞因子促其生长。培养过程中HESCs的长细胞周期影响其对不同培养条件的反应，且在许多方面与MESCs不同。
4HESC自我更新的调节
LIF对MESCs未分化状态的有效维持是通过膜蛋白gpl30和stat3信号途径的激活来实现的。虽然，HESCs不需要LIF保持未分化状态，但(gpl30、JAK／STAT)下游信号途径是否参与维持其未分化状态尚未研究。HESCs和MESCs所共有信号途径的程度将决定MESCs实验方案适用于HESCs的程度。
5所有的HESCs系都相同吗?
HESCs研究的一个相关问题是胚胎中存在多少种干细胞状态?对这些问题的进一步研究需要比较不同HESCs系之间未分化状态下多能性分子标记物以及细胞特点和多潜能性。这些研究在MESCs上已取得了很大进展，但HESCs上尚未开始。目前研究人员用一些MESCs的分子标记对HESCs系进行检测。这些标记物在ESC中普遍表达丰富，我们建议将这些标记物分为两类。I类标记物为明确定义的克隆化标记物，Ⅱ类为需要进一步多方面鉴定的标记物。并非所有的小鼠标记物均在人类细胞中表达。例如：SSEA一3和SSEA-4在HESCs表达，而在MESCs不表达；而MESCs表达SSEA一1，但HESCs不表达。确信，随着对MESCs和HESCs深入研究和分析，会迅速得到许多ESCs标记物，这些特异性表达标记有助于规范HESC定义。
HESCs的分子标记。表1中所列13种分子标记都是鉴定未分化HESCs的。这些标记在未分化HESCs中表达(丰富)，分化后则消失。它们可分为两类：I类，明确定义的克隆化标记物，II类，需多方面鉴定的抗体检测细胞表面抗原。
6HESCs可进行怎样的遗传操作?
已有HESCs成功转染操作基因并表达该基因的大量文献报道。人类反转录病毒载体(例如痘病毒)以及生化策略表明了基因转染HESCs的可能。如果HESCs用于医疗，克隆到病毒载体内的转染基因的随机整合应引起足够重视。MESCs的位点特异性重组(剔除或剔入)功能缺失实验，最近在HESCs上也有了类似报道，使HESC的遗传操作成为可能。
7为何加强HESCs研究?
包括小鼠在内的各种动物构成其于细胞生物学的分子特征我们还不是很清楚，但是MESCs和HESCs间的差异已十分显著。例如培养中的MESCs生长速度明显快于HESCs；参与MESCs自我更新的配体已确认，MESCs通过遗传操作的胚胎获得；而且MESCs更适于作各种体内实验而不受政治和伦理的影响。相反，HESCs很难得到且生长慢；其自我更新的分子机制还不清楚。HESCs也很难进行遗传操作和体内试验。显然，讨论有关HESCs和MESCs的基本问题同样重要。
由于两者存在差异，如果HESCs可应用于临床，非模型系统HESCs研究将很有必要。
8HESCs是怎样进行分化的?
体外，HESCs可分化为三个胚层的多种细胞类型(但不是全部)。培养的HESCs可分化为神经细胞、皮肤细胞、(表明外胚层分化)，血液，肌肉，软骨，内皮细胞以及心肌细胞(表明中胚层分化)，还可分化成胰岛细胞(表明内胚层分化)。另外，HESCs还可形成包括三个胚层的类胚体。虽然，HESCs的体外分化潜能与MESCs相当，但是目前还不清楚，这些分化是发生在正常的胚胎形成过程还是通过其它途径来实现的?
发育决定具有时序性，在具体器官和特定细胞类型形成前，胚胎(包括HESCs)要产生三个胚层：外胚层、中胚层、内胚层。探寻器官形成的分子途径，需要确定哪些活动为特定类型细胞形成所必需。例如：通过特定处理促进HESCs分化为特定内胚层如胰岛细胞。因此，在细胞完成其最终命运前及时分化对于解释细胞生长中的中间历程很重要。理解正常的发育过程有助于我们设计ESCs促分化程序。虽然在动物模型胚胎中存在许多胚层标记物，但在人类胚胎中目前还没有全面分析这些标记物。ESCs被定义为在体内能产生所有3个胚层和生殖系的一种细胞，将标记过的MESCs移植给不同阶段(多为胚泡期)的小鼠胚胎，最终通过标记细胞评价ESC其生成生殖细胞的能力。HESCs体内分化潜能需要严密的检测。由于伦理观念，不可能将HESCs移植到人类胚胎，唯一公开报道的体内分化实验仅是向免疫缺陷小鼠(如NOD／SCID小鼠)皮下注射HESCs，表明其分化特征类似于MESCs。注射后的小鼠形成有3个胚层的畸胎瘤，这有助于评价HESCs的多潜能性，但仍需要其它实验评价HESCs具有产生胚外细胞及生殖细胞系的潜能。
9HESCs分化能力分析
HESCs体内外分析体系的改进对了解与HESCs分化有关的生物学知识非常必要，也是其在再生医学中应用的前提。根据在鱼类、青蛙、鸡和小鼠胚胎组织发育研究的结果已建立了一些离体分析体系。
建立体内分析体系比离体分析体系要困难。依据动物模型建立的经验，设计了两种简单的体内试验，首先，将标记过的HESCs移植入非人类成体或胎儿特定组织的一定部位以检测其与宿主组织整合的能力。类似实验将小鼠于细胞体外分化的运动神经细胞移植至鸡胚，结果表明这些小鼠干细胞源神经细胞参与脊髓形成。已有相关报道表明，人类胎儿和成体神经干细胞以及造血干细胞可移植至小鼠胎儿并能参与多种器官形成。第一个实验检测特定胎儿环境的局部作用，第二个实验则将标记过的HESCs移植入非人类早期胚胎中检测HESCs与宿主组织的整合能力。包括小鼠和鸡胎胚模型系统的HESCs移植有助于评价HESCs参与宿主组织和器官的形成。此类实验应该是短暂的，即在妊娠的不同时期，胚胎可能被排斥；我们意识到第二个实验需要适当的科学制度的支持。
10HESCs研究的基础设施建设
由于生物材料来源限制，HESCs研究的基础设施建设尤为重要。作者建议建立HESCs贮藏库并注册，类似于英国提议的干细胞库，这个贮藏库收集所有HESCs系(包括2001年8月9日后所有建系)，用上述标准对其标准化并保证学术机构研究应用，质量监控和规则可参照一些已建立的中心体系如美国标本培养收藏协会。贮藏库要负责HESCs的收集和供给，这将有助于解决研究者的困境。HESCs贮藏库应包括一个大学机构和研究人员都可获得的网络数据库，此数据库收集所有有关HESCs和人类胚胎的数据。注册点向许多地区提供和获得相关资料，包括微阵列分析结果(原始数据)或一些细胞传代法，HESCs系的生长和培养条件，分化潜能以及鉴定方法。
这需要特别重视两个方面，首先已有资料(如原始微阵列数据)的质量监控必须为一个委员会严格限定和拥有。作者建议这个委员会由一些具有分子胚胎学、高质量数据分析以及生物信息学专业知识的科学家组成。
其次，资料信息的保存和累积需要长期的义务性努力。本文所述仅是一个起点，期望随着有关HESCs和人类胚胎学知识的不断丰富，HESCs标准会更加具体和丰富。
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