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【摘要】目的建立香连素片的质量控制标准。方法采用薄层色谱法鉴别香连素片中的木香;采用高效液相色谱法测定香连素片中盐酸小檗碱的含量。结果在薄层色谱中检出了木香;盐酸小檗碱的进样量在0.0378~0.378μg范围内呈良好的线性关系(r=0.9997),平均回收率为101.49%,RSD为1.97%(n=6)。结论本方法专属性强、准确、重现性好,可作为香连素片的质量控制标准。
【关键词】香连素片;木香;薄层色谱法;盐酸小檗碱;高效液相色谱法
Abstract:ObjectiveToestablishamethodforqualitycontrolofXiangliansutablets.MethodsRadixAuckiandiaeinthetabletswasidentifiedbyTLC.ThecontentofberberinehydrochlorideinthetabletswasdeterminedbyHPLC.ResultsRadixAuckiandiaecouldbeidentifiedbyTLC.Berberinehydrochlorideshowedagoodlinearcorrelationovertherangeof0.0378-0.378μg(r=0.9997).Theaveragerecoveryofberberinehydrochloridewas101.49%withRSD1.97%(n=6).ConclutionsThemethodisspecific,accurateandreproduciblefortheequalitycontrolofXiangliansutablets.
Keywords:Xiangliansutablets;berberinehydrochloride;HPLC;Radixauckiandiae;TLC
香连素片是广东万年青制药有限公司的产品,具有清热燥湿、行气止痛的功效,临床用于湿热型痢疾、里急后重、腹痛泄泻。其处方为木香500g、盐酸小檗碱75g。原药品标准[1]鉴别木香用试管反应,盐酸小檗碱的含量用紫外分光光度法测定,方法专属性较低且影响因素多。本文采用薄层色谱法鉴别木香、高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量,结果表明操作简便、准确、重复性好,为该品种的质量标准进一步修订提供了依据。
1仪器与试药
1.1试药
香连素片(批号:030801、030802、030803、040701、041002、050601、050802、060601、060602、060603)均为广东万年青制药有限公司产品;木香对照药材(批号:921-9201)及盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200609)均购自中国药品生物制品检验所;硅胶G预制板及硅胶G均由青岛海洋化工厂生产;乙腈为色谱纯;其他试剂与试药均为分析纯。
1.2仪器
LC2010A高效液相色谱仪(日本岛津),UV2501PC紫外分光光度仪(日本岛津),CQ15A超声波清洗器(上海跃进医用光学器材厂)。
2薄层鉴别[2]
取本品2片,研成细粉,加三氯甲烷10mL,超声(功率120W,频率50Hz)处理30min,滤过,滤液浓缩至2mL,作为供试品溶液。另取木香对照药材0.2g、不含木香的阴性样品,同法分别制成对照药材溶液及阴性对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各3μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以三氯甲烷环己烷(体积比5∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%香草醛硫酸溶液,在105℃加热至斑点清晰。置可见光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰,见图1。
3含量测定
3.1色谱条件
色谱柱:phenomenexC18(150mm×4.6mm,5μm)流动相:以磷酸盐缓冲溶液[0.05mol/L磷酸二氢钾和0.01mol/L十二烷基磺酸钠(体积比1∶1),含0.2%三乙胺]乙腈(体积比60∶40),用磷酸调节pH值至3.0为流动相;流速:1.2mL/min,检测波长:266nm,柱温:室温,进样量:10μL,理论塔板数不低于1500。
3.2溶液的制备
3.2.1对照品溶液的制备
取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加乙醇制成每1mL含120μg的溶液,作为对照品溶液。
3.2.2供试品溶液的制备
取本品20片,精密称定,研细,精密称取适量(约相当于盐酸小檗碱60mg),置索氏提取器中,加盐酸甲醇(体积比1∶100)适量,加热回流提取至提取液无色,将提取液(必要时浓缩)移至50mL量瓶中,用少量盐酸甲醇(1体积比∶100)的混合液洗涤容器,洗液并入提取液中,并稀释至刻度,摇匀,精密量取1mL,置10mL量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,即得。
3.2.3阴性对照溶液的制备
按照本品的处方、制法制备缺少盐酸小檗碱的模拟样品,按“3.2.2”项方法制成阴性对照溶液。
3.3专属性试验
分别取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液,按上述色谱条件测定,结果阴性对照对盐酸小檗碱测定无干扰,说明方法专属性强。结果见图2。
3.4线性关系的考察
精密称取盐酸小檗碱对照品适量,用乙醇溶解制成质量浓度为37.8μg/mL的溶液,分别精密吸取1、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定色谱峰面积,以进样量(m)为横坐标,色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,经线性回归,得线性回归方程为Y=2.88725×106m-5586.84,r=0.9997,表明盐酸小檗碱进样量在0.0378~0.378μg范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系
3.5稳定性试验
精密吸取同一批供试品溶液各10μL,按上述色谱条件,每隔1h测1次峰面积,结果表明盐酸小檗碱在24h内稳定,RSD为0.66%。
3.6重复性试验
取同一批样品共6份,分别按“3.2.2”项下方法进行制备溶液,并按上述色谱条件测定盐酸小檗碱的含量,结果RSD=0.90%,表明方法重现性良好。
3.7回收率试验
精密称取已知含量的样品(批号:030802)共6份,分别精密加入对照品适量,按“3.2.2”项下方法制备溶液并按上述色谱条件测定盐酸小檗碱的含量,计算加入量的回收率。结果见表1。表1盐酸小檗碱加样回收率试验(略)
3.8准确度考察
以含量限度下限的50%为范围低限、以含量限度上限的150%为范围高限,考察测定范围的准确度。
精密称取已知含量的样品(批号:030802),按含量范围高、低限折算取样量,各6份,分别精密加入对照品适量,按“3.2.2”项下方法制备溶液并按上述色谱条件测定盐酸小檗碱的含量,计算加入量的回收率。结果见表2。表2准确度试验结果(略)
3.9样品的测定
取10批样品,分别按“3.2.2”项下方法制备溶液,分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,并按上述色谱条件,测定盐酸小檗碱的含量,结果见表3。表3样品中盐酸小檗碱的含量(略)
4讨论
4.1采用薄层色谱法鉴别木香时,分别采用自制板及预制板同时展开、预平衡与未平衡的条件展开,层析结果表明:自制板与预制板的层析结果无差别,两种展开条件均可检出木香特征斑点,但以未平衡的条件展开,结果容易产生边缘效应,故展开时预平衡10min较好。
4.2薄层层析的环境影响
分别在冰箱、室温、相对湿度45%和75%的环境条件下展开,结果表明:在上述环境条件展开,均可检出木香特征斑点,差异不大,故选用以室温、相对湿度45%~75%为展开环境条件,操作简便。
4.3提取方法的选择
参照国家药品标准[1],供试品溶液的制备是经索氏提取后上氧化铝柱洗脱,操作较繁琐。我们对提取方法进行了优化,只经索氏提取后直接测定,并与原提取方法的HPLC测定结果作对比。结果表明:只经索氏提取与原提取方法的测定结果一致,因此样品的提取采用索氏提取法。
4.4测定波长的选择
取对照品溶液,在200~500nm波长范围内进行扫描,在349、266、231nm均有最大吸收,经HPLC试验比较,盐酸小檗碱在266nm波长的峰面积值最大,故选择检测波长为266nm。
4.5流动相的选择
参考文献[3,4],采用磷酸盐缓冲溶液[0.05mol/L磷酸二氢钾和0.01mol/L十二烷基磺酸钠(1∶1),含0.2%三乙胺]乙腈(60∶40),分别用磷酸调节pH值至3.0、3.2、3.5为流动相,经试验,当流动相的pH值为3.0时对照品及样品的峰形对称,重复性好,阴性对照无干扰,故确定流动相为磷酸盐缓冲溶液[0.05mol/L磷酸二氢钾和0.01mol/L十二烷基磺酸钠(1∶1),含0.2%三乙胺]乙腈(60∶40),用磷酸调节pH值至3.0。
4.6耐用性考察
4.6.1柱温的考察
柱温分别为室温、40℃时,色谱峰的分离度、峰形及峰面积基本一致,故以室温作为柱温,操作较简便。
4.6.2流速的考察
分别设定流速为1.0、1.2及1.5mL/min进行测定,结果表明:当流速为1.0mL/min时保留时间太长,当流速分别为1.2及1.5mL/min时色谱峰的峰形及峰面积无甚差别,且前者的保留时间短一些,故选择流速为1.2mL/min。
4.6.3色谱柱的考察
选用3种不同厂牌的色谱柱:phenomenexC18(150mm×4.60mm,5μm)、DiamonsilTMC18(250mm×4.60mm,5μm)和SpherisorbC18(250mm×4.60mm,5μm),测定同一批样品(批号:060602)的含量,结果3种色谱柱测得含量的RSD=0.61%(n=2),表明换用不同厂牌的色谱柱,均可得到满意的色谱图,故本法的耐用性好。
【参考文献】
[1]WS3—B—2572—97.国家药品标准:卫生部药品标准第十三册[S].1997:140.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[S].北京:化学工业出版社,2005:41.
[3]庞小雄,宋粉云,钟兆健,等.HPLC法测定拈痛丸中盐酸小檗碱的含量[J].广东药学院学报,2007,23(3):240-242.
[4]张宇烽,马安霓,陈小玲,等.HPLC法测定芩连葛根片盐酸小檗碱的含量[J].广东药学,2004,14(7):83.