安贺拉滴眼液治疗兔干眼症病理学
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【摘要】目的观察安贺拉滴眼液应用于兔干眼症治疗的免疫病理学变化，初步探讨安贺拉滴眼液治疗干眼症的可能机制。方法新西兰白兔20只，制作碱烧伤干眼模型，随机分为对照组和安贺拉组，分别滴生理盐水和安贺拉滴眼液。用药4周后应用印迹细胞学和免疫病理学方法检测结膜杯状细胞密度、MUC5AC阳性细胞率和炎性细胞浸润密度。结果对照组结膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组，安贺拉组杯状细胞密度和MUC5AC阳性细胞率均大于对照组（P<0.05）。结论安贺拉滴眼液可以降低兔眼表的炎症反应，促进杯状细胞增殖，在干眼症治疗方面具有一定的应用前景。【关键词】安贺拉滴眼液；干眼症；兔；免疫病理学Abstract:ObjectiveTodiscussthemechanismofketorolactromethmineeyedropsinrabbitsdryeyewithalkaliburnsinconjunctivabyobservingtheimmunopathologicprocessafteritwasused.MethodsTwentyrabbitmodelswereestablishedbyburningwithalkaliinconjunctiva,andthendividedintotwogroupsrandomly:theexperimentalgrouptreatedwithketorolactromethmineeyedropsandthecontrolgrouptreatedwithsaline.Byusingimmunopathologictechniquesandimpressioncytologytest,densityofgobletcell,positiverateofMUC5ACanddensityofinflammatorycellinconjunctivawerestudiedthe4thweekafterdrugused.ResultThedensityofgobletcell,andpositiverateofMUC5ACinexperimentalgroupwashigherthanthatofcontrolgroupandlowerinthedensityofinflammatorycell（P<0.05）.ConclusionKetorolactromethmineeyedropscanreduceocularsurfaceinflammationandincreasethenumberofgobletcellsinrabbits,suggestingitisvaluabletodryeye.Keywords:ketorolactromethmine；dryeye；rabbit；immunopathology干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常,导致泪膜不稳定和(或)眼表面的异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。干眼的主要症状有眼部干燥、异物感、视疲劳、畏光及视力下降等,轻者影响工作和生活,严重者可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿孔,严重危害视功能［1］。干眼作为最常见眼表疾病有日趋增多的趋势，其药物治疗方法多种［2］：泪液替代疗法、黏液溶解药、局部自家血清、抗生素等。随着干眼发病机制的深入研究，现已认识到由炎症介质介导的炎症反应参与几乎所有类型干眼的病理生理过程。本研究采用新型药物——安贺拉滴眼液作用兔干眼模型，研究其疗效及可能的作用机制。1材料与方法1.1主要仪器与试剂LeicaMEL53型眼科手术显微镜（瑞士WILDLEITZ公司），YZ5CSI型裂隙灯显微镜（苏州医疗仪器厂），Olympus10AK照相显微镜（日本欧林巴斯光学公司），低温恒冷切片机（美国Leica公司）,安贺拉滴眼液（Acular,美国Allergan公司产品），16mm×6mm的滤纸条，1mol/L的NaOH（广州化学试剂厂），1%荧光素钠溶液，1%虎红溶液（广西梧州制药股份有限公司），免疫组化试剂盒和MUC5AC抗体（美国Sigma公司）。1.2动物选择与分组健康成年新西兰白兔20只，雌雄各半，体质量2.0～2.5kg。随机分为实验组和对照组，每组10只，右眼为实验眼。购自广东省医学实验动物中心，合格证号:SCXK(粤)2003-0002，粤监证字2006A001。1.3实验方法50mg/2mL盐酸氯丙嗪＋100mg/2mL氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右眼第三眼睑，并用2张16mm×6mm的滤纸条蘸1mol/L的NaOH溶液置于距兔角膜缘上方2mm的结膜上，90s后立即用100mL生理盐水反复冲洗结膜囊。术后对照组局部应用生理盐水滴眼，每日3次；实验眼局部应用安贺拉滴眼液,每日3次。用药4周后行结膜印迹细胞学检查，并取病变区结膜行组织病理学检查和免疫组化染色检测特异性黏蛋白MUC5AC的表达。1.3.1印迹细胞学检查及PAS染色将孔径为0.2μm的醋酸纤维膜剪成3mm×3mm大小，浸入蒸馏水3～4h，以消除滤纸表面活性，取出晾干高压消毒备用。检查前结膜囊先滴1％爱尔卡因1滴，5min后，滤纸吸去穹隆部泪液，将醋酸纤维膜的粗糙面贴于距上方角膜缘2mm的球结膜表面，轻轻加压，3～5s之后撕下，然后于其左右相邻的区域再各贴一张，φ=95％乙醇固定10～30min，然后依次用0.5％高碘酸氧化，过碘酸希夫染色剂（periodicacidSchiffstaining，PAS）染色，偏重亚硫酸漂洗，苏木素复染，二甲苯透明，中性树脂封片，置于双目光学显微镜下观察上皮细胞的连接，胞核胞浆的颜色，核浆比例（N/C），上皮细胞角化以及杯状细胞密度。1.3.2组织病理学检查用药4周取病变部位球结膜，生理盐水冲洗干净后放入10%甲醛固定液固定。流水冲洗固定组织过夜。依次进行乙醇梯度脱水，φ=70%乙醇15s，80%、90%、95%、100%乙醇各3h。二甲苯透明3次，每次10min。从低熔点石蜡到高熔点石蜡浸蜡共3次，每次1h。将浸蜡后的组织放入包埋盒内，倒入熔化的高效切片石蜡，待凝固后取出石蜡块。将石蜡块安装在切片机的组织固定架上用，调节切片厚度在4～6μm每个石蜡块切2～3张切片。1.3.3免疫组织化学染色将组织片放入20℃温水中展开，贴于玻片上，放入烘箱内烘干5min，依次放入二甲苯脱蜡和95%乙醇各2次，每次1min。PBS（0.01mol/L，PH7.4）漂洗3min×3；4℃1%TrisTriton100通透5min，用PBS漂洗3min×3；加20μL即用型过氧化物酶阻断剂于室温下孵育10min，用PBS漂洗3min×3，以消除内源性过氧化物酶的活性；加20μL非免疫动物血清于室温孵育5min，以减少非特异性背景染色；倾去血清吸去多余液体，滴加一抗（MUC5AC）于4℃孵育12h，用PBS漂洗3min×3；加20μL生物素标记的二抗，于室温下孵育10min，用PBS漂洗3min×3；加20μL辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于室温下孵育10min，用PBS漂洗3min×3；加新鲜配制的DAB显色液显色，显微镜下观察结果，1～2min水洗终止反应；苏木素复染核15～30min，染色过深者用盐酸酒精漂洗；每一批实验均设有阳性及空白对照，阳性对照：采用已知阳性的胃癌切片（由试剂公司提供）；空白对照：以PBS代替一抗。1.4结果判定1.4.1印迹结膜杯状细胞观测分级根据NELSON’s分级标准进行分级［3］：0级：结膜上皮细胞形态正常，层次大小一致，胞浆蓝绿色，N/C为1∶2，杯状细胞密集分布；1级：结膜上皮细胞轻度扩大，胞浆蓝绿色，N/C为1∶3，杯状细胞开始减少密度下降；2级：所有结膜上皮细胞均扩大，变扁平，胞浆蓝绿色或粉红色，N/C为1∶4或1∶5，轻度角化。杯状细胞明显减少；3级：结膜上皮细胞浆内出现颗粒状物质，核固缩崩解，上皮细胞胞浆呈粉红色，N/C为1∶6或1∶8，出现不同程度的角化，杯状细胞完全丧失，视野下不见杯状细胞。结膜杯状细胞计数方法：计算每个动物所取3张标本中共10个高倍镜（400×）下杯状细胞数目总数的平均值。[1][2][][]1.4.2MUC5AC阳性细胞检测MUC5AC阳性细胞内有棕黄色颗粒，随机统计100个结膜上皮细胞中阳性细胞数。1.4.3结膜炎性细胞浸润程度判定苏木素复染核显示炎性细胞胞核，以每高倍视野下炎性细胞数目来判定结膜结缔组织中炎性细胞的浸润密度。1.5统计学处理应用SPSS10.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析（onewayANOVA）及均数多重比较检验分析观察期各指标的变化及组间各指标平均值的差异，以P<0.05为差异有显著性。2结果用药4周后，对照组结膜杯状细胞为2级，安贺拉组为1级；对照组结膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组，杯状细胞密度、MUC5AC阳性细胞率均小于安贺拉组（见表1，图1，图2）。表1两组结膜病理学检测指标比较（略）Tab.1Comparisonofpathologicchangesinconjunctivabetweentwogroups与对照组比较：*P<0.05;**P<0.01图1安贺拉组结膜杯状细胞MUC5AC免疫组织化学染色（×200）（略）Fig.1MUC5ACimmunohistochemicalstainingofgobletcellinthegrouptreatedwithketorolactromethmine(×200)图2对照组结膜杯状细胞MUC5AC免疫组织化学染色（×200）（略）Fig.2MUC5ACimmunohistochemicalstainingofgobletcellinthecontrolgroup(×200)3讨论干眼症患者因杯状细胞减少，不能不断地产生和分泌黏液，使结膜囊保持的润滑度下降，眼睑与眼球间活动的摩擦力升高，泪膜的更新和稳定下降，无法维持结膜和角膜的生理性潮湿和润泽，从而出现一系列眼部不适的症状和体征。长期在空调开放、空气不流通的环境里工作或经常从事注意力集中的工作或活动,如长时间使用电脑,在荧光屏前工作、阅读的人容易引起干眼症。研究表明，所有类型的干眼均与炎症有关［4］。干眼所促发的是一类非感染性、免疫相关性的炎症反应，是在各种致炎因素的刺激下，眼局部出现的防疫性反应［5］。安贺拉是一种新型非甾体抗炎药，其通过抑制环氧化酶而阻断花生四烯酸来抑制前列腺素的合成；稳定肥大细胞，抑制组织胺、前列腺素等化学介质的释放；阻断炎性介质对眼部的刺激和损害，发挥较强的抗炎作用。本研究应用安贺拉滴眼液治疗兔干眼模型，研究其疗效及可能的作用机制。泪膜由外至内分为3层:脂质层、水液层和黏蛋白层。黏蛋白层对于泪膜的形成起着至关重要的作用。黏蛋白有极强的亲水性,它主要的功能是覆盖角膜上皮,从而赋予了角膜的可湿润性。眼表的黏蛋白包括角结膜上皮分泌的跨膜蛋白MUC1、2、4，杯状细胞上皮分泌的分泌型蛋白质MUC5，以及由泪腺分泌的水溶型分泌性蛋白MUC7。MUC5AC是构成泪膜黏蛋白层的最主要成份。这些黏蛋白,尤其是MUC5AC,被认为对于促进泪膜在眼表的分布、维持泪膜的稳定性至关重要［6］。本研究结果显示，用药4周后，安贺拉组MUC5AC阳性细胞数明显多于对照组，且其炎性细胞浸润程度远远小于对照组。印迹细胞学检查是一种简便易行、无创伤、可重复性好的眼表细胞学检查方法，间接反映杯状细胞的分布和数量。通过印迹细胞学检查，用药4周后，安贺拉组结膜上皮细胞轻度扩大，N/C为1∶3，杯状细胞为1级；而对照组结膜上皮细胞扩大变扁平，N/C为1∶4或1∶5，轻度角化，杯状细胞为2级；安贺拉组杯状细胞密度也大于对照组。综上所述，安贺拉滴眼液可减轻眼表的炎症反应，在干眼的治疗方面具有一定的应用前景。本研究结果提示安贺拉滴眼液可能对杯状细胞有作用。但这种作用是安贺拉滴眼液本身促进杯状细胞增殖，还是因为眼局部炎症反应减轻，改善细胞外环境而使杯状细胞增殖，有待于进一步研究探索。【参考文献】［1］刘祖国,杨文照.干眼的发病机制［J］.眼科,2005,1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