HPLC法测定土牛膝腺苷含量

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【摘要】目的测定广东土牛膝中腺苷的含量。方法采用反相高效液相色谱法，色谱柱：DiamonsilTMC18柱，流动相：甲醇磷酸盐缓冲溶液（体积比12∶88），流速：1.0mL·min-1，检测波长260nm，柱温30℃。结果腺苷的平均回收率为99.5%，RSD值为1.69%;方法精密度试验RSD值为1.15%(n=6)。结论该法可用于广东土牛膝中腺苷的含量测定。

【关键词】广东土牛膝；腺苷；hplc；含量测定

Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentofadenosineinRadixEupalorriChinenseLinnbyRPHPLC.MethodsSampleswereanalyzedonaDiamonsilTMC18column（250mm×4.6mm，5μm）usingCH3OHNaH2PO4·Na2HPO4(12∶88)asmobilephase.Theflowratewas1.0mL·min-1andthedetectionwavelength260nm.ResultsThemethodexhibitedgoodlinearityfrom0.0396to0.6336μg.Theaveragerecoveryforadenosinewas99.5%andRSD1.69%(n=6).ConclusionThemethodcouldbeusedtodetermineadenosinecontentinRadixEupalorriChinenseLinn.

Keywords:RadixEupalorrichinenseLinn;adenosine;RPHPLC

广东土牛膝（RadixEupalorriChinenseLinn）为菊科植物华泽兰的干燥根及根茎，广东土牛膝资源丰富，分布较广，在民间沿用历史悠久，具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛的功效［1,2］，临床上常用于治疗各种咽喉炎、扁桃腺炎等。为评价广东土牛膝的内在质量，本文以腺苷为指标成分［3］，建立了广东土牛膝中腺苷含量测定的高效液相色谱法，该法具有分离效果好，简便、准确等优点，可用于该药材的初步质量控制。

1仪器和试药

1.1仪器

日本岛津高效液相色谱仪(LC10ATvp溶剂输送泵，SPD10Avp紫外可见检测器，CTO10Asp柱温箱)，HW2000色谱工作站（南京千谱软件公司）。

1.2药材来源及处理

土牛膝样品（批号20051102，东莞国药集团中药饮片有限公司，产地广东；批号20060109，东莞国药集团中药饮片有限公司，产地广东；批号0500201，佛山康泰和医药有限公司中药饮片加工厂，产地广东），由广东药学院生药学教研室刘基柱副教授鉴定为菊科泽兰属植物华泽兰(EupalorrichinenseLinn)的根及根茎。将其粉碎，于60℃下干燥4h，置干燥器内备用。

1.3药品与试剂

腺苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号879-200202，供含量测定用）；甲醇为色谱纯，水为双蒸水，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为分析纯。

2实验部分

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液

取本品粉末（过3号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%（体积分数）的甲醇20mL，称定重量，超声处理45min，放冷，再称定重量，用50%（体积分数）甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.1.2对照品溶液

精密称取腺苷对照品9.90mg，置50mL量瓶中，加50%（体积分数）的甲醇适量，振摇使溶解，再加50%（体积分数）的甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为198μg·mL-1的腺苷对照品贮备液。

2.2色谱条件及系统用性试验

色谱柱：DiamonsilTM(钻石)C18柱（250mm×4.6mm，5μm，迪马公司）；流动相：甲醇磷酸盐缓冲溶液［取0.01mol·L-1磷酸二氢钠68.5mL与0.01mol·L-1磷酸氢二纳31.5mL混合（pH＝6.5）］（体积比12∶88）；流速：1.0mL·min-1，检测波长：260nm；柱温：30℃。分别取对照品溶液（腺苷浓度为7.92μg·mL-1），供试品溶液20μL注入色谱仪，按上述色谱条件，记录色谱图（图1,2）。腺苷和样品中相邻色谱峰的分离度大于1.5；理论塔板数以腺苷峰计算不低于3000；保留时间约为17.40min。

图1腺苷对照品HPLC图略

图2广东土牛膝药材样品HPLC图略

2.3方法学考察

2.3.1线性与范围

分别精密吸取一定量的对照品贮备液用50%（体积分数）的甲醇稀释成浓度为1.98、3.96、7.92、15.84、23.76、31.68μg·mL-1的对照品溶液，分别取20μL进样测定，以峰面积（A）对对照品质量浓度（ρ）进行回归，得回归方程A=32416.91ρ+1071.34，r=0.9999，试验表明腺苷在0.0396～0.6336μg之间与峰面积线性关系良好。

2.3.2精密度试验

取质量浓度为7.92μg·mL-1的腺苷对照品溶液20μL，连续测定5次，记录峰面积并计算，结果腺苷峰面积的平均值为256682，RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。

2.3.3稳定性试验

取土牛膝供试品溶液（批号20051102），在0、2、4、8、12h分别进样20μL，记录峰面积，结果腺苷峰面积的平均值为229720，RSD为1.69%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.3.4重复性试验

取同一批号（批号20051102）样品6份，按“2.1.1”项下方法制备溶液，分别进样测定，结果腺苷平均含量为0.1406mg·g-1，RSD为1.15%，表明分析方法精密度良好。

2.3.5加样回收试验

精密称取已知含量（批号20051102）土牛膝样品约0.5g，共9份，分别用刻度吸量管精密加入浓度为198μg·mL-1的腺苷对照品溶液0.23、0.23、0.23、0.36、0.36、0.36、0.50、0.50、0.50mL，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20μL进行分析，结果见表1。

表1腺苷回收率试验结果略

2.4样品测定

取土牛膝样品3批，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别取7.92μg·mL-1的对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算腺苷的含量，结果见表2。

表2样品的测定结果（略）

3讨论

3.1提取溶剂的选择分别用不同体积分数（30%、50%、70%、90%）甲醇混合液进行试验，结果腺苷的含量分别为0.1398、0.1408、0.1383、0.1267μg·mL-1，表明用体积分数为50%的甲醇溶剂提取比较完全。

3.2腺苷提取方法选择文献［4-7］主要用超声处理和加热回流方法,本文考察了以50%（体积分数）甲醇为提取溶剂，样品分别超声处理和回流处理，结果腺苷的含量分别为0.1408、0.1385μg·mL-1,并且超声处理45min与60min的结果一致，因此选择45min作为提取时间。

3.3检测波长的选择取腺苷对照品溶液，用50%（体积分数）甲醇溶液做参比，置紫外可见分光光度计仪器中，在210～400nm波长扫描，结果腺苷对照品溶液在260nm处有最大吸收波长,故选择260nm作为检测波长。

3.4流动相的选择曾参考《中国药典》2005年版一部“冬虫夏草”的腺苷含量测定方法［5］，以甲醇pH＝6.5磷酸盐缓冲溶液（体积比17∶3）作为流动相条件，但在试验过程中，我们发现在这种流动相条件下腺苷与其他组分的峰的分离状况并不好，经过对柱温和不同比例的甲醇磷酸盐缓冲溶液流动相的试验，结果以甲醇pH＝6.5磷酸盐缓冲溶液（体积比12∶88），柱温30℃时，土牛膝中腺苷可和其他组分基线分离，并且峰形良好，该法分离效果好，准确，可用于广东土牛膝药材的初步质量控制。

【参考文献】

［1］梅全喜，吴惠妃.广东土牛膝的药用历史及现代研究概况［J］.中医药学刊，2005,23(11):1995-1996.

［2］刘晓燕，曾晓春，江剑东.广东土牛膝抗炎镇痛的研究［J］.中医药学刊，2005,22(8):1566-1568.

［3］叶沛光，龙晓英，卢绮雯，等.复方土牛膝喷雾剂的研制［J］.广东药学院学报，2006，22（3）：249-252.

［4］张敏如，洪亮，郭群.高效液相色谱法测定发酵虫草菌粉和金水宝胶囊中腺苷的含量［J］.中草药，1994，25(2):77.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京：化学工业出版社，2005:7.

［6］邱文炜,翁雪萍.灵芝胶囊质量标准研究及质量评价［J］.中药材,2005,28(9):827-828.

［7］孔令钰,张磊,于治国,等.RP-HPLC法测定苦碟子药材中腺苷的含量［J］.药物分析杂志,2006,26(11):1665-1667.