人脐静脉内皮细胞体外分离培养及鉴定
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【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带（至少20cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液,一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13min，细胞接种后4～5h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。
【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定
Cultivationandinvitroidentificationofendothelialcellsfromhumanumbilicalvein
〔Abstract〕ObjectiveToexploretheprimaryculturemethodofhumanvascularendothelialcells(ECs)fromumbilicalvein,enhancethesuccessrateofseparatingandculturingECsinvitro,establishthemodelofhumanvascularECs,andprovideanexperimentalmethodforresearchofECs.MethodsTheumbilicalveinsinhumanumbilicalcords,20cmlong,werefixedandfilledthedigestivefluids,0.2%collagenenaseⅡinonecordandthecomplexenzymeof0.25%trypsinand0.1%collagenaseⅠinanother,andthedigestiveresultswerecompared.Allthecellswerecollectedandculturedinfluidwith10mg/mLVEGF,theirprocreationandgenerationwereobserved,themorphologiccharacteristicsofECswereobservedwithlightmicroscopyandimmunohistochemistryunderinvertedmicroscope,andthecellcyclewasobservedbyflowcytometer.ResultsEnoughECswereobtainedfrombothdigestiveliquids,andcollagenenaseⅡwasbetterthancomplexenzyme,theeffectivedigestingtimewas13minutes.theculturingcellsgrewonthewallappearedafter4-5hoursandthemonolayercellswereformedafteroneweek.ⅧfactorintheECsshowedpositivereactionbyimmunohistochemistry.Cellcyclerevealedthat50.6%cellswereatstageofG0/G1.ConclusionTheperfusionwithcolla〔Keywords〕humanvascularendothelialcellinumbilicalvein;cellculture;flowcytometry;cellcycle;separation;identification
血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。新生儿脐带由于取材方便，来源充足，而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。本文利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌注消化法，运用不同的消化酶成功分离了人脐静脉内皮细胞，并用免疫组织化学法进行了鉴定，从而为构建体外研究血管内皮细胞的模型及进一步实验研究打下了基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本来源与采集标本均来自于湖南中医药大学第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带（至少20cm）放入装有培养基的无菌容器中，快速移入实验室，1h内行脐静脉内皮细胞的分离培养。
1.1.2试剂PRMI-1640培养基、类标准胎牛血清（Hyclone)；L-谷氨酰胺（Sigma公司）；VEGF（Sigma公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；胶原酶Ⅰ、Ⅱ（Gibco公司）；兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；青-链霉素（Gibco公司）；其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3仪器水套式CO2培养箱（2300型，SHEL-LAB）；超净工作台（SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术公司）；台式多管自动平衡离心机（TDZ5-WS，长沙平凡仪器仪表有限公司）；倒置显微镜（XD-101型，南京江南光电股份有限公司）；制冰机（AF100型，斯科茨曼公司）；超纯水仪（MaximaScientific，ELGA公司）；电热重蒸水器（ZLSC，上海申安医疗器械厂）；座式自控电热压力蒸气灭菌器(ZDX-35型，上海申安医疗器械厂)；电子分析天平（AB204N型，梅特勒－托力多有限公司）；流式细胞仪（BECTONDickinson）。
1.2方法
1.2.1人脐静脉内皮细胞的原代分离及培养将取来的脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提前盛有预热PBS培养皿中，剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，分成20cm的一段。找出脐静脉（2根管腔较细的是脐动脉，1根管腔较粗的是脐静脉），用带平针头的注射器从一端插入脐静脉，血管钳固定，再用预热的PBS冲洗3次以上，将血迹完全冲洗干净。为防止脐动脉残留的血液混入，可将动脉分离少许用消毒线结扎，用止血钳钳夹另一端。从冲洗的针头中注入0.1%胶原酶Ⅱ使其充盈，另一条以同样的方法注入0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出针头，用止血钳夹住注入端，移入无菌烧杯中，置于37℃培养箱中孵育13min。取出，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1000r/min，离心5min，弃上清，加入RPMI-1640完全培养液（含20%胎牛血清，10ng/mLVEGF。L-谷氨酰胺2mmoL/L,青霉素100U/mL,链霉素100mg/mL）,用巴氏吸管轻轻吹打均匀，按1×106个接种于培养瓶，置于5%CO2，37℃培养箱中培养，24h后更换培养液去除未贴壁的细胞，然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。
1.2.2人脐静脉内皮细胞的传代培养待细胞生长融合成单层细胞后，弃去培养液，加入0.125%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液2～3mL，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆后弃去消化液，加入RPMI-1640完全培养液5～10mL终止消化，用巴氏吸管吹打制成细胞悬液，按1∶2或1∶3比例将细胞悬液接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。
1.2.3人脐静脉内皮细胞的形态学观察及鉴定细胞换液后直接在倒置显微镜下观察细胞的形态及生长特征，并作相差摄影，同时进行常规HE染色观察并摄片。鉴定采用DAB免疫组织化学法，在6孔培养板中放置载玻片，玻片上植入2mL含有1×106的细胞悬液，待细胞贴壁后，取出载玻片，放入-20℃的冷丙酮中固定30min,用PBS冲洗3次，每次2min,滴加3%H2O2室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次2min,以消除内源性过氧化物酶的活性。滴加兔抗人Ⅷ因子相关抗原多抗工作液，放入湿盒内4℃过夜，同时另一盖玻片不加一抗作阴性对照。次日，用PBS冲洗3次，每次2min,滴加辣根酶标记的羊抗兔IgG,37℃孵育30min,PBS冲洗3次，每次2min，用DAB底物混合工作液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后，终止显色，进行复染，脱水，透明，封片，相差显微镜下观察摄影。
1.2.4流式细胞术检测细胞周期将消化所得的细胞悬液1000r/min离心5min，弃去上清，用PBS洗3次，加入-20℃预冷的70%乙醇，调整细胞数量大于106以上，重悬、固定12h以上，取1mL细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1mL的PI染液中，37℃孵育30min进行流式分析，检测细胞周期。
2结果
2.1人脐静脉内皮细胞的形态学观察
相差倒置显微镜下观察，人脐静脉内皮细胞贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富（见图1-B、C）。胞核清晰可见，为圆形或椭圆形。原代培养细胞，于接种后2h开始贴壁生长（见图1-A），传代细胞约0.5h后即开始贴壁生长。原代细胞1周左右可长满，传代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞。
2.2Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定
人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色可见细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆内可见棕黄色颗粒（见图1-D），核周密集，而对照组内未见着色。证实培养的细胞为内皮细胞。
2.3流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞的细胞周期
结果显示S期的细胞约有36.5%，S+G2+M期的细胞约有47.6%活跃于增殖期，而处于G0/G1期的细胞约占有50.6%左右（见图2），台盼蓝排除实验示活细胞的百分比为94.5%，换3个视野算平均值为92.3%。
3讨论
新生儿脐带来源充足，取材、操作方便可行。且脐静脉在许多方面具有与动脉相似的生物学特性。因而，脐静脉内皮细胞成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。成功地获得大量脐静脉内皮细胞，是体外建立血管内皮细胞模型的保证。
在培养细胞的获取上，多采用机械刮取法和酶消化法。机械刮取法是将脐静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有尼龙筛的分离管[1]，但这一方法很难掌握力度，易损伤内皮细胞，而且多混有其它细胞如成纤维细胞等。现多采用酶消化法，胰蛋白酶、胶原酶均可作为消化血管内皮细胞的酶，但胶原酶的性较温和，效果较好。尤其胶原酶Ⅱ可认为是消化脐静脉内皮细胞的理想酶[2]，价格较昂贵。胰蛋白酶价廉，但对细胞有毒性作用。在本实验中我们选用胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰蛋白酶等比混和消化液，消化13min，均成功获取了足够量的血管内皮细胞，但胶原酶Ⅱ获取的细胞数量要稍多于混合消化液，不过混合消化酶也不失为一种可取的消化液。因此选用合理的消化酶并掌握好消化时间，是成功获取内皮细胞的关键之一。同时，标本材料的新鲜程度也影响获得内皮细胞的数量。有研究表明[3]，脐静脉内皮细胞离体后，随着时间的延长，细胞内一些物质的含量会发生变化，如离体超过6h，内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原释放量以及前列环素生长量均随着存放时间的延长而呈下降趋势，时间超过12h后，细胞会出现水肿、变性，活力下降，甚至无法存活。还有研究表明[4]，脐带离体3h内内皮细胞存活率为90%，离体24h后仅有50%存活。本试验于1h内进行消化和原代分离培养，细胞数量多增殖良好。培养基的pH值也是影响细胞生长的因素之一。内皮细胞生长最适pH7.2～7.4，起初可稍低（7.0左右），这样易于贴壁生长。提前用多聚赖氨酸预包被培养瓶也有助于细胞的贴壁。细胞营养液血清的选择也是决定血管内皮细胞能否存活的决定因素。高质量的各种血清均能保证内皮细胞的正常生长，有试验结果显示[5-6]：高质量的胎牛血清对人脐静脉血管内皮细胞的生长有良好的促进作用，是体外成功培养人脐静脉内皮细胞的关键。我们在实验中选用类标准胎牛血清，细胞生长良好。
人脐静脉内皮细胞体外生长能力较差，增殖缓慢，原代培养不易成功，传代培养也只能传3～4代，在内皮细胞培养过程中加入适量的生长刺激因子，这些因子有高效特异的促有丝分裂作用，可明显促进细胞生长[7]。我们在总结失败经验的基础上，在完全培养液中加入10ng/mL的VEGF，成功传代8代后，细胞仍然生长良好。
人脐静脉内皮细胞相对其他血管内皮易分离取得，经济实用，成功获取大量的人脐静脉内皮细胞，为体外研究建立血管内皮提供实验模型，为进一步研究血管内皮的生物学特性及其与各种疾病的关系打下基础。
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