灯盏花素磷脂对鼠脑缺血灌注损伤

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【摘要】目的观察灯盏花素磷脂复合物(BerPC)对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的影响。方法复制大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型，观察缺血后大鼠神经功能障碍情况，测定再灌注后缺血侧脑梗死范围及脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)的活性及丙二醛（MDA）的含量。结果BerPC剂量依赖性减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能障碍，减少脑梗死面积，拮抗缺血脑组织MDA含量的增加，提高脑组织SOD、GSHPX活性。结论BerPC对脑缺血再灌注损伤大鼠具有明显的保护作用，具有良好的新药开发前景。

【关键词】灯盏花素磷脂复合物；脑缺血；再灌注；大鼠

Abstract:ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsofbreviscapinephosphatidylcholinecomplex(BerPC)againstbraininjuryinratsundergonefocalischemiareperfusion.MethodsWistarratsweretreatedwithBerPCfor14daysandweresubjectedtofocalischemiareperfusionbymiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)usingintraluminalthread.After2hoursofMCAOreperfusionwasallowedbyretractingthethread.Thenervesymptomswereobservedafter1hourofreperfusionandtheinfractedarea,thelevelofMDA,theactivityofSOD,andGSH-PXinischemicbraintissuewereobservedafter24hours.ResultsBerPCcouldimprovebehaviordisorderinducedbyMCAOandreducebraininfractedareathroughincreasingtheactivityofSODandGSHPX,decreasingthelevelofMDAinbraintissue.ConclusionBerPCcouldprotectagainstfocalbraininjuryinducedbyreperfusioninjuryinmiddlecerebralarteryofratsandcouldbeapromisingproduct.

Keywords:Breviscapinephosphatidylcholinecomplex；cerebralischemia；perfusion;rat

灯盏花素(Ber)是从菊科植物短葶飞蓬中提取的有效活性成分，是治疗心脑血管疾病的常用天然药物。它能有效清除氧自由基和过多的NO，防止脑缺血造成的细胞膜离子转运紊乱，阻止细胞内钙超载，保护脑细胞，增加脑血流量，改善脑血管循环等［1，2］。但其结构特点决定其口服不易吸收，生物利用度较低［3］。因此笔者将灯盏花素与磷脂(PC)复合，形成灯盏花素磷脂复合物(BerPC)，以提高生物利用度，改善临床疗效。本实验研究BerPC对大鼠脑缺血再灌注(IR)损伤的保护作用，并与Ber进行比较，旨在为新药开发提供药效学依据。

1材料与方法

1.1药物与试剂

Ber（云南植物药厂，批号000908），PC（上海试剂二厂，批号031104）。BerPC由武汉俊民医药研究所提供，批号010311，其制备方法为：取Ber溶于丙酮中，加温至60℃促溶，以质量比1∶1.6比例加入大豆磷脂，搅拌2.5h后，挥除有机溶剂，残余物室温减压干燥10h后得磷脂复合物。三苯基氯化四氮唑(TTC)染液（中国医药集团上海化学试剂公司，批号010411）。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号030307），超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒（批号030704），谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)测定试剂盒（批号030715），丙二醛(MDA)测定试剂盒（批号030715）均为南京建成生物工程研究所产品。

1.2动物

Wistar大鼠，雄性，体质量300～350g，10～12月龄，由武汉大学医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2003-0002。

1.3仪器

754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司分析仪器厂），BPS130电子分析天平（北京赛多丽斯天平有限公司），电热灼烧器（上海医疗器械八厂生产）。

2实验方法

2.1分组及给药

取上述大鼠70只，随机分为7组，每组10只，即单纯缺血再灌注(IR)组及假手术（Sham）组；Ber200mg·kg-1组；BerPC50、100、200mg·kg-1组（剂量以Ber计）；PC320mg·kg-1组（相当于BerPC200mg·kg-1组中PC的量）。其中Sham组及IR组均给予等体积的0.5%CMC（10mL·kg-1）溶液。动物每天灌胃给药1次，连续给药14d。

2.2大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的制备［4］

末次给药后1h，大鼠称重，腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液1mL·kg-1麻醉，仰卧固定于恒温手术台上。颈部皮肤正中切口，分离左侧颈总动脉及其分支。将直径为0.26mm，头端灼烧膨大且光圆的尼龙线经颈总动脉插入颈内动脉入大脑中动脉分支处，进线深度均距颈内、颈外动脉分叉18mm处，阻断左侧大脑中动脉血流2h，拔出尼龙线予以再灌注24h，Sham组仅手术分离，不插尼龙线。

2.3对大鼠神经功能的影响

大鼠清醒后，观察其行为学变化，神经症状按文献［4］5级4分制评分。评分标准：无神经损伤症状为0分；不能完全伸展右侧前爪为1分；向右侧转圈为2分；行走时向右侧倾倒为3分；不能自发行走或意识昏迷为4分。

2.4对大鼠脑梗死面积的影响

各组大鼠再灌注24h后，开颅取脑，取梗死侧脑组织冰浴上（4℃以下）冠状切成5片，迅速将脑片置于2%TTC染液中，37℃染色20min，10%（φ）甲醛固定。经染色后非缺血区脑组织呈玫瑰红色，梗死区呈白色，将白色组织挖下称重。以梗死区脑质量与总切片脑质量的百分比作为梗死范围。

2.5对SOD、GSHPX活性及MDA含量的影响

各组大鼠于再灌注24h后，取缺血侧同一部位脑组织用0.9%冰氯化钠溶液制成10%脑组织匀浆，将匀浆以3000r·min-1离心10min，取上清液，按试剂盒说明书操作，分别测定SOD、GSHPX活性及MDA含量。以牛血清白蛋白为标准品，用考马斯亮蓝法测定各样品中蛋白质含量。

2.6统计学处理

实验数据以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有显著性。

3结果

3.1对神经功能评分的影响

与Sham组比较，IR组大鼠出现明显的神经功能障碍。腹腔注射BerPC50、100、200mg·kg-1，连续14d，可剂量依赖性降低大鼠神经功能评分，且100、200mg·kg-1组与IR组比较，差异具有极显著性（P<0.01）。与Ber组相比较，BerPC200mg·kg-1组作用明显强于相同剂量的Ber组（P<0.01），见表1。

表1对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响略

3.2对脑梗死面积的影响

与Sham组比较，IR组大鼠脑梗死面积百分率显著增加（P<0.01），显示缺血再灌注引起脑组织明显坏死。腹腔注射给予BerPC50、100、200mg·kg-1，连续14d，可剂量依赖性缩小脑梗死面积，且50、100、200mg·kg-1组与IR组比较，差异具有极显著性（P<0.01）。且BerPC200mg·kg-1组作用明显强于相同剂量的Ber组（P<0.01）。见表2。

3.3对SOD、GSHPX活性及MDA含量的影响

与Sham组比较，IR组SOD、GSHPX活性明显降低，MDA含量显著升高(P<0.01)。与IR组比较，Ber组、BerPC3个剂量组SOD活性显著升高，差异有显著性（P<0.05或P<0.01），且BerPC200mg·kg-1组作用明显强于相同剂量的Ber组（P<0.05）。与IR组比较，Ber组、BerPC3个剂量组GSHPX活性显著升高，差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。与IR组比较，所有给药组MDA含量均显著降低，差异有极显著性（P<0.01）。见表3。

表2对大鼠脑梗死面积的影响略

表3对SOD、GSHPX活性及MDA含量的影响(略)

4讨论

在缺血性脑损伤的过程中，由于大量自由基产生，导致膜脂质发生过氧化，破坏了膜脂质的代谢和结构，从而改变酶蛋白的微环境。另一方面，自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸残基，引起酶蛋白构象改变，使酶失活。GSHPX在细胞质中直接参与清除H2O2，SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。大鼠脑缺血后，SOD和GSHPX活性明显低于正常，清除自由基能力下降，导致脂质过氧化产物MDA生成增多。从本文结果看：预先给予BerPC可明显减轻大鼠缺血后的行为障碍，减小脑梗死体积百分比，明显降低SOD和GSHPX的活性抑制，减少MDA的生成，与文献［2］报道Ber药理作用基本一致，显示BerPC对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与其抗脂质过氧化有关。细胞膜离子转运紊乱，细胞内钙离子超载是引起脑缺血再灌注的重要因素，BerPC对细胞内钙离子的影响，我们将另行研究。

灯盏乙素是Ber的主要有效成分之一，为黄酮木脂素类化合物，其结构决定Ber溶解度较低，口服不易吸收，这在一定程度上影响了其疗效的发挥。磷脂为体内细胞膜的基本组成物质，与细胞膜的亲合力强。文献［5］报道，磷脂在一定条件下与天然活性成分药物进行复合,得到天然活性成分磷脂复合物(phytosomes),其理化性质和生物特性较原化合物均有不同程度的改变。phytosomes以磷脂作载体，可以使黄酮类化合物很容易透过细胞的脂质膜，显著地改变其生物有效性。本文实验证实了BerPC的药理作用明显强于等剂量的Ber，且PC无明显的药理作用，提示Ber和磷脂形成一种全新的复合化合物，可能提高了Ber的生物利用度。

【参考文献】

［1］万海同，王玉.灯盏花素治疗脑缺血作用的研究进展［J］.浙江中医学院学报，2006，30(1)：101-103.

［2］何蔚，曾繁典.灯盏花素治疗缺血性脑血管病的药理作用和临床研究［J］.中国临床药理学杂志，2002，18(6)：458-461.

［3］葛庆华，周臻，支晓瑾.灯盏花素在犬体内的药动学和绝对生物利用度研究［J］.中国医药工业杂志，2003，34(12)：618-621.

［4］ZEALONGAEL，WEINSTEINPR，CARLSONS,etal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyintherats［J］.Stroke，1989，20(1)：84-88.

［5］凌沛学，汤漩，王凤山，等.药物与磷脂复合物研究近况［J］.中国药学杂志，2005，40(6)：401-402.