皮生长因子抗体对肝癌放射增敏作用
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【关键词】肝肿瘤;放射疗法;抗VEGF单抗;放射增敏
Radiosensibilityofhumanhepatocellularcarcinomaxenograftsenhancedbyantivascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibody
【Abstract】AIM:Toinvestigatetheinhibitingeffectsofcombiningantivascularendothelialgrowthfactor(VEGF)monoclonalantibody(mAb)therapywithradiotherapyonthegrowthofhepatocellularcarcinomaxenograftsinvivo.METHODS:Humanhepatocellularcarcinomacellline,SMMC7721,wasimplantedscinmice.Themicewithxenograftsweredividedinto4groups,radiation(RT)20Gygroup,RT20GyplusmAbgroup,RT30GyplusmAbgroupandcontrolgroup.AntiVEGFmAbwasinjectediponalternatedaysforatotalof6injectionsatadosageof50μg/mouse.Singleradiationdosesweregiven24hafterthe4thinjectionofmAb.Tumordiametersweremeasuredandtumorvolumewascalculated.Miceweresacrificed2wkafterthe6thinjectionandtheintratumoralmicrovesseldensitywasdeterminedbycountingthestainedvesselswithimmunohistochemistry.RESULTS:Radiationsignificantlyreducedthegrowthandthemicrovesseldensityoftumors.TheinhibitoryeffectsweremoresignificantwhenradiationwascombinedwithantiVEGFmAb,andRT30GyplusmAbwasmoreeffectivethanRT20GyplusmAb.ForRT20Gygroup,RT20GyplusmAbgroupandRT30GyplusmAbgroup,theinhibitoryratesoftumorweightwere75.3%,83.9%and94.7%,respectively.CONCLUSION:AntiVEGFmAbenhancestheradiosensibilityofhumanhepatocellularcarcinomaxenografts.Thestrategyisoneoftheapproachesforhepatocellularcarcinomatreatment.
【Keywords】hepatocellularcarcinoma;radiotherapy;antiVEGFmAb;radiosensibility
【摘要】目的:观察抗血管内皮生长因子抗体(VEGFmAb)与不同剂量放射联合对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法:将SMMC7721肝癌细胞种植于裸鼠皮下,成瘤动物分为单纯放射20Gy组、放射20Gy+抗体组、放射30Gy+抗体组和对照组,腹腔给予抗VEGFmAb50μg/只，隔日1次,共6次,放射剂量一次性给予.测量肿瘤直径并计算瘤体积,抗体给药结束后2wk处死动物,免疫组化法测肿瘤微血管密度(MVD).结果:放射能抑制肿瘤生长,减少肿瘤MVD,放射与抗体结合对肿瘤生长的抑制作用更显著，且放射30Gy+抗体比放射20Gy+抗体效果更好.单纯放射20Gy组、放射20Gy+抗体组和放射30Gy+抗体组的瘤质量抑制率分别为75.3%,83.9%和94.7%,差异有统计学意义.结论:抗VEGFmAb对放射治疗肝癌移植瘤有增敏作用,是肝癌综合治疗的有效途径之一.
【关键词】肝肿瘤;放射疗法;抗VEGF单抗;放射增敏
0引言
放射治疗肿瘤的目的是尽可能提高肿瘤的放射剂量以杀灭瘤细胞,但同时正常组织和器官所受辐射量也相应提高,增加了放射治疗的副反应,因而限制了通过提高放射剂量来控制肿瘤的作用.肝癌是放射欠敏感肿瘤,而正常肝组织对放射线较敏感.单纯放射治疗肝癌的疗效并不理想［1］.有报道［2］抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)抗体可以抑制肝癌裸鼠移植瘤生长,我们观察抗VEGFmAb与不同放射剂量联合对肝癌移植瘤生长的抑制作用,以了解两者联合应用的机制与方法.
1材料和方法
1.1材料Balb/cnu/nu小鼠20只(南方医科大学实验动物中心),5～6wk龄,雄性,体质量19.0～22.0g,SPF层流柜分笼饲养;SMMC7721人肝癌细胞株（武汉大学中国典型培养物保藏中心）;MonoclonalantiVEGFantibody,producedinmouse,clone26503.11（Sigma公司）;培养箱（37℃,50mL/LCO2）,倒置显微镜(XDP1,上海光学仪器厂),Varian23EX医用直线加速器（美国）,RPMI1640细胞培养液（含100mL/L胎牛血清,青霉素1×105U/g,链霉素100mg/L）,胰蛋白酶,免疫组化SABC法相关试剂（武汉博士德公司）.
1.2方法
1.2.1癌细胞培养SMMC7721人肝癌细胞株于25mL培养瓶中繁殖传代,细胞贴壁长满瓶壁后移入250mL培养瓶继续传代繁殖,取指数生长期细胞胰酶消化,2000r/min离心2min,收集细胞用生理盐水悬浮,显微镜下以细胞计数板计算细胞密度,生理盐水定容细胞密度为2×1010/L.
1.2.2癌细胞种植参考文献［3］方法,裸鼠于饲养环境适应1d后种植癌细胞,取裸鼠右后肢大腿外侧皮下为种植点,1mL注射器抽取0.2mL细胞悬液（含4×106个细胞）注入种植点皮下.
1.2.3动物分组及肿瘤生长观察肿瘤种植后1wk,可观察到全部动物有明显皮下肿块形成,第10日肿块直径约5mm.将动物随机分为4组,即单纯放射20Gy组、放射20Gy+抗体组、放射30Gy+抗体组和对照组,每组5只.用游标卡尺测量肿块长径（a）及横径（b）,隔日测量1次,肿瘤体积(V)=a×b2/2.
1.2.4抗体给予及放射治疗以0.2μm针式滤器过滤除菌的PBS液溶解抗VEGFmAb至100mg/L,于肿瘤种植后10d分组后腹腔注射抗VEGFmAb,50μg/只,隔日1次,共6次.单纯放射组及对照组同样途径给予等体积量PBS.第4次给予抗VEGFmAb后的第2日行放射治疗,放疗机房紫外线消毒,受照动物四肢以细绳固定在小木板上,照射野大小3cm×3cm,源皮距100cm,6MeV电子线,剂量率4Gy/min,单纯放射组剂量20Gy,放射+抗体组剂量分别为20Gy和30Gy,全部放射剂量一次性给予.
1.2.5瘤体称质量抗体给药结束后继续观察肿瘤生长2wk,于肿瘤种植后34d处死动物,仔细分离肿块周边皮肤及非肿瘤组织,瘤体称质量,瘤质量抑制率(%)=（1－实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100.
1.2.6免疫组化微血管密度(MVD)测定将肿瘤组织切成3mm厚片状,40g/L甲醛固定24h,脱水石蜡包埋,切片厚5μm.免疫组化SABC法:一抗为多克隆兔抗鼠CD34抗体,工作浓度1∶100稀释.即用型HighSABC免疫组化试剂盒,具体操作按试剂盒说明进行,DAB染色,苏木素复染,树胶封片.选血管内皮细胞染色密集区于高倍镜(×200)下计数染色细胞,每片计数5个视野取平均值.
统计学处理SPSS10.0统计分析软件,应用重复测量数据方差分析处理肿瘤体积变化数据,多个独立样本非参数检验处理瘤质量抑制数据和MVD数据,P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1放射和抗VEGFmAb对肿瘤生长的抑制作用SMMC7721人肝癌细胞培养时增殖及传代能力强,裸鼠皮下种植成瘤率高,20只动物全部成瘤.种瘤后10d动物分组时各组肿瘤体积无显著性差异,放射治疗前给予抗体4次,肿瘤生长呈现减慢趋势,但与非抗体组差异不显著.放射治疗后,单纯放射组及放射20Gy+抗体组肿瘤仍缓慢生长,但放射30Gy+抗体组肿瘤生长完全被抑制,肿瘤缩小.种瘤后20d单纯放射组、放射20Gy+抗体组和放射30Gy+抗体组肿瘤体积显著小于对照组,且放射与抗体联合组优于单纯放射组,此显著性差异一直持续至动物处死(种瘤后34d),放射30Gy+抗体组肿瘤体积小于放射20Gy+抗体组（表1）.
表1放射和抗VEGFmAb对肿瘤生长的抑制作用(略)
bP＜0.01vs对照组;cP＜0.05vs单纯放射组;eP＜0.05vs放射20Gy+抗体组.
2.2瘤质量抑制率和MVD单纯放射组、放射20Gy+抗体组和放射30Gy+抗体组在动物处死时的瘤质量抑制率分别为75.3%,83.9%和94.7%,均有明显抑制肿瘤质量增长作用.放射30Gy+抗体组瘤质量明显低于单纯放射组和放射20Gy+抗体组.各处理组MVD低于对照组,放射与抗体联合较单纯放射组MVD低,MVD在放射20Gy+抗体组与放射30Gy+抗体组之间差异无统计学意义(表2).
表2瘤质量抑制率与微血管密度(略)
bP＜0.001vs对照组;cP＜0.05vs单纯放射组;eP＜0.05vs放射20Gy+抗体组.
3讨论
SMMC7721肝癌裸鼠移植瘤细胞的形态和结构与人肝癌细胞特性类似［3］,移植瘤生长迅速,未经治疗的肿瘤生长速度快,单纯放射治疗能延缓其生长速度,联合抗VEGFmAb后抑制肿瘤生长效果更明显,但单纯放射或放射20Gy加抗体组肿瘤仍呈逐渐加速的生长趋势.虽然放射和抗VEGFmAb均能抑制肝癌移植瘤生长,但实验结果显示放射30Gy加抗体是较好的联用方式,瘤体生长停滞并有缩小,对瘤质量和瘤体积的抑制都优于低剂量放射组.
放射是以肿瘤细胞为靶点的治疗措施,通过对肿瘤细胞的杀灭来控制其生长.放射在杀灭瘤细胞的同时又诱导肿瘤细胞表达VEGF升高,保护血管内皮细胞抗拒放射线攻击,促进肿瘤血管形成［4］;或通过提高肿瘤细胞基质分解酶活性,增强瘤细胞的侵袭力［5］,因而放射诱导了肿瘤的保护机制,降低瘤细胞对放射线的敏感性.抗VEGFmAb抑制VEGF的表达和血管形成,使肿瘤赖以生长及转移的血管形成不足,本身具有抗肿瘤作用;又能通过降低VEGF表达使血管内皮细胞失去免受放射线攻击的保护,增强瘤细胞的放射敏感性,因而抗VEGFmAb与放射起到了协同抑瘤作用［6］,此协同作用并不是各自作用的简单合并,而是起到了效应的放大.
研究表明［7］,抗VEGFmAb的抑瘤作用是暂时的,停止抗体后肿瘤又会恢复原来的生长活性.因而抗VEGFmAb须与具有细胞毒作用的治疗措施联合才能起到协同作用［8］.抗VEGFmAb放射增敏的机制可能比较复杂,Winkler等［9］发现,抗VEGFmAb能诱导肿瘤血管出现一个“血管正常化的窗口期”,在此期间内,肿瘤血管与正常血管功能相似,肿瘤氧水平高,提高了肿瘤细胞对放射的敏感性,因此在窗口期内给予放射才能起到协同抗肿瘤作用.“血管正常化窗口期”出现在抗体治疗的1wk左右,我们也选择这一时期给予放射治疗,收到了预期的结果.
血管形成是一个复杂的过程,有多种生长因子参与其中;放射治疗又涉及时间剂量分割方式的不同,我们的实验结果只是其中可行性组合之一.放射与抗VEGFmAb联合治疗肝癌取得了较好的实验效果,是肝癌综合治疗方法的一条新思路.
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