体外循环影响中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶
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【关键词】体外循环
【摘要】目的探索体外循环前后膜结合弹性蛋白酶（MBE）动力学变化，及MBE与术后炎性反应及组织功能之间可能存在的联系。方法连续收集10例体外循环下冠状动脉搭桥手术病人的资料，血样采集时间为开胸前、主动脉开放后、体外循环结束时、停机后3h和6h、术后第一天。分离血样中的中性粒细胞，使用底物分析法测定被分离的中性粒细胞的MBE。通过常规实验方法测定炎性反应和组织功能的生化标记物。结果开放主动脉后，MBE轻度升高，停机时达峰值，在术后第一天恢复到术前水平。与主动脉开放后中性粒细胞在肺内滞留相比，左房与右房血中的MBE没有差异。MBE或MBE总活性与术后炎性反应标记物如C反应蛋白（CRP）及组织功能标记物如乳酸、肌酸磷酸激酶（CPK）、丙氨酸氨基转移酶之间均无相关关系。结论体外循环促使中性粒细胞MBE表达，并在停机时达高峰，但与体外循环后炎性反应和组织功能的生化标记物之间没有特定关联，提示体外循环中还有其他重要机制参与了术后炎性反应和器官功能障碍的发生。
【关键词】体外循环；中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶
EffectofCPBonmembrane-boundelastaseofneutrophils
【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofcardiopulmonarybypass(CPB）onthekineticchangeofmembrane-boundelastase(MBE）anditspossiblelinktothepostoperativeinflammationandorganfunction.MethodsTenconsecutivepatientsundergoneelectivecoronarybypasssurgerywithCPBwererecruitedinthestudy.Bloodsamplesweretakenbeforemediansternotomy,afteraorticdeclmping,attheendofCPB,3hand6hafterCPBandonthefirstpostoperativedayrespectively.MBEwasdeterminedbysubstrateassayfromisolatedneutrophils.Inflammationandorganfunctionmarkersweredeterminedwithroutinelaboratorymethods.ResultsMBEslightlyincreasedafteraorticdeclamping,reachedtoitspeakattheendofCPB,andreturnedtoitspreoperativelevelonthefirstpostoperativeday.Incontrasttolungsequestrationofneutrophilcount,therewerenotranspulmonarygradientofMBEbetweenleftandrightatriumafteraorticdeclamping.NeitherMBEnortotalMBEactivitywaspositivelycorrelatedwiththepostoperativeinflammationmarkerssuchasbloodlactateandC-reactiveproteinandorganfunctionmarkerssuchascreatinephosphokinaseandalanineaminotransferase.ConclusionCPBinducesMBEexpressiononneutrophilswithitspeakattheendofCPB.LackofassociationbetweenneutrophilMBEandclinicalmarkerssuggeststhatmultiplesystemsareinvolvedinthepost-CPBinflammatoryresponseandorgandysfunction.
【Keywords】cardiopulmonarybypass;membrane-boundelastaseofneutrophils
体外循环（CPB）能通过激活循环中细胞与体液成分，引起全身炎性反应综合征［1，2］。激活的中性粒细胞释放出的弹性蛋白酶，被认为是能够降解各种蛋白如弹性蛋白、纤维蛋白、糖蛋白等强有力的蛋白水解酶之一［3］。心内直视手术的病人在转流中和转流后，中性粒细胞均能释放弹性蛋白酶［4～7］，但游离弹性蛋白酶能被体内广泛存在的蛋白水解酶抑制剂(proteaseinhibitor,PI）迅速结合而失去活性［8］。最近发现，中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶(membraneboundelastase,MBE）能抵抗血浆和组织中蛋白水解酶抑制因子的作用［9］，而且结合于中性粒细胞膜上的弹性蛋白酶，在攻击血管内皮细胞和引起组织损伤方面，较血浆中游离的弹性蛋白酶具有更强的生物活性［10～12］。本研究的目的就是研究心脏手术病人在转流中和转流后MBE的动力学变化，并试图寻找其与术后炎性反应及组织功能变化之间的关系。
1资料与方法
1.1一般资料2004年11月1日～2004年11月30日，连续10例行择期冠脉搭桥术患者。术前排除标准：（1）存在感染；（2）全血白细胞总数>10000/μl；（3）中性粒细胞计数>7000/μl；（4）红细胞沉降率>20mm/h；（5）C反应蛋白（CRP）>8mg/L。病人的一般资料见表1。
1.2血样采集和临床数据收集于开胸前5min（T0）、体外循环结束时（T3）以及术后第一天8Am（T4）分别抽取桡动脉血15ml,并在主动脉开放后10min从左房（T1）和右房（T2）各抽血15ml。10ml全血用0.2%Na2EDTA溶液0.5ml抗凝后测定MBE，余5ml送检中性粒细胞计数、血淀粉酶、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酸磷酸激酶（CPK）和CRP。
表1一般资料（略）
临床血流动力学和呼吸参数分别于术前5min、停机时、停机后3h和6h以及术后第一天8Am收集。血流动力学参数包括心率(HR）、平均动脉血压(MAP）、左房压（LAP）和中心静脉压（CVP）；呼吸功能参数包括肺顺应性（lungcompliance,LC）和弹性气道阻力(airwayresistance,AR）。
1.3MBE测定
1.3.1中性粒细胞分离10ml全血在4℃下以1500rpm离心10min，收集上层血浆置于-20℃保存。细胞成分用PBS液(phosphatebuffersolution,PBS）按1∶1比例稀释后待用。将4ml密度为1.1026g/ml的74%Percoll-0.9%NaCl溶液注入一个14ml的聚苯乙烯试管，在其上层小心覆盖4ml密度为1.0776g/ml的55%Percoll-0.9%NaCl溶液，将4ml稀释后的血样覆盖在最上层。于4℃下以350×g离心20min后，中性粒细胞聚集于两层不同浓度的Percoll溶液之间。用吸管收集中性粒细胞，加入4℃PBS液洗涤2次，以350×g离心15min后，加入低渗溶液（0.83%NH4Cl，0.0037%Na2EDTA,0.1%KHCO3）,在室温下孵育5min，溶解残留的红细胞。以160×g离心5min，用PBS洗涤后收集中性粒细胞并计数。经Giemsa染色后检查中性粒细胞的纯度，发现纯度＞95%，经苔盼蓝（0.01%浓度）排除法检查细胞活力，证明活度＞95%［13］。
1.3.2中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶的检测将分离、收集的中性粒细胞与含有3%（W/V）聚甲醛和1%戊二醛的PBS液在4℃下混合3min，以PBS液洗涤2次，再次计数并用PBS液稀释至中性粒细胞浓度为2×106/ml，已证明此固定法对MBE的活性没有影响［9］。MBE活性通过底物分析法测定：取50μl中性粒细胞稀释液，加入150μl多肽底物溶液［(1mMN-succinyl-(L-alanine）3-p-nitroanilide,200mMTris-HCl,pH=8.0,Sigma,St.Louis,USA）］，37℃下孵育60min后加入5μl冰醋酸结束反应。在405nm下比色，通过不同浓度的标准弹性蛋白酶溶液(Sigma,St.Louis,USA）与底物反应的关系曲线得出MBE活性,此分析法的敏感度可达0.5ng/106中性粒细胞。使用下列公式将测得值转换成中性粒细胞MBE总活性。
MBE总活性(ng/ml）=MBE（ng/106）×中性粒细胞数量（106/ml）
1.4统计学方法使用成对t检验法检验各时刻间实验室和临床数据有无差异，使用Pearson相关分析检验临床与实验室指标间关系，数据用平均值加减标准差表示，P<0.05示统计学差异显著。
2结果
10例患者转流时间平均(124±35）min,主动脉阻断时间平均(86±27）min。术后多巴胺最大剂量为(11.8±7.4）μg/kg，肾上腺素最大剂量平均(0.02±0.03）μg/kg，术后第一天8Am前外科引流量平均为(612±300）ml，尿量平均为(116±40）ml/h,病人均康复出院，平均住院(14.3±5.6）天，无明显的感染、围手术期心梗或外科出血。
2.1中性粒细胞计数术前中性粒细胞计数为(3720±1039）×106/L，主动脉开放后10min，右房中性粒细胞计数上升至(4950±1964）×106/L（P＜0.05）。右房与左房中性粒细胞计数差异有显著性，分别为(4950±1964）×106/L及(3600±1761）×106/L（P＜0.05）。体外循环结束以及术后第一天，中性粒细胞计数分别为(9920±4081）×106/L（P＜0.01）及(15340±3139）×106/L（P＜0.01）。
2.2MBE活性和MBE总活性（表2）术前MBE活性为(123.7±62.4）ng/106中性粒细胞。主动脉开放后10min，右房和左房内MBE分别增加至(161±120）ng/106及(160.9±88.7）ng/106，但与术前相比统计学无显著差异。体外循环结束时，MBE较术前明显增高，达(205.7±88.0）ng/106（P＜0.01），术后第一天MBE值低于术前水平［（109.6±102.9）ng/106］，但与术前差异无显著性。MBE总活性受中性粒细胞数量影响较大，主动脉开放后右房与左房内MBE总活性分别为（854±700）ng/ml和（658.3±574.9）ng/ml，与术前相比无明显差异，心房间差别也不显著（P=0.318）。体外循环结束时MBE总活性较术前明显升高，分别为（2129.5±1360.4）ng/ml及（448.0±193.2）ng/ml（P＜0.05）。术后第一天，MBE总活性比术前明显升高，达（1755.0±1739.0）ng/ml（P＜0.05）。
表2MBE及MBE总活性变化（略）
注：与术前比较采用成对t检验*P＜0.05，**P＜0.01
2.3组织功能、生化指标、血流动力学及呼吸动力学变化见表3。术后第一天，CPK、血淀粉酶较术前显著升高（P＜0.05），术后第一天CRP较术前差异有非常显著性［（3.25±4.05）mg/L及（77.47±29.83）mg/L］，(P＜0.01）。术后第一天血糖水平较体外循环结束时及术后3h均明显增加（P＜0.05）。血乳酸水平于体外循环后及术后第一天较术前明显增加（P＜0.01）。
表3血流动力学、血液生化检查（略）
注：ND:未检测；与术前比较采用成对t检验*P＜0.05，**P＜0.01
平均动脉压和左房压在体外循环前后差异无显著性。体外循环结束后6h的气道阻力明显低于停机后3h。肺顺应性在停机后3h和6h没有明显差别。使用Pearson相关分析，各时刻MBE总活性和MBE呈正相关(P＜0.05）,未见MBE或MBE总活性与组织功能、生化指标、临床血流动力学或呼吸功能参数之间有相关关系。
3讨论
在体外循环中或结束后所释放的炎性介质中，被激活的中性粒细胞所释放的弹性蛋白酶能作用于不同的蛋白底物，它是最强的蛋白水解酶之一。这种酶储存于中性粒细胞的胞浆颗粒中，体外循环中许多因素诸如肝素抗凝、温度改变、缺血再灌注等都可以激活中性粒细胞，并促使其释放弹性蛋白酶和氧自由基等毒性物质对组织造成损伤［14～16］。但体内存在大量血浆型或组织型蛋白水解酶抑制剂(PI），中性粒细胞释放到血液或组织中游离的弹性蛋白酶与之结合后，其降解蛋白的作用将被抑制。体外循环中血浆弹性蛋白酶与蛋白酶抑制剂复合物在体外循环后数小时内达到高峰，并在术后1周仍保持较高水平［17］。膜结合弹性蛋白酶失去蛋白酶抑制剂结合位点，因此它的活性不受抑制剂的影响，从而能发挥其降解作用［9］。多种细胞因子、内毒素等能诱导中性粒细胞表达膜结合弹性蛋白酶［9～11］。当激活的白细胞与血管内皮细胞黏附时，MBE从中性粒细胞膜上不同部位向中性粒细胞与内皮细胞结合处转移，继而水解内皮细胞间的连接蛋白，有助于中性粒细胞完成向血管外的“游走过程”,这一机制已被体外趋化实验模型所证实［10，12］。因此，MBE在中性粒细胞的出血管过程和组织消化过程中起重要作用，但其在体外循环前后的动力学变化及作用机制仍不为人们所知。
本研究中，我们观察到从体外循环开始至升主动脉开放前，MBE保持在较低水平，体外循环结束时，MBE快速达到高峰，在术后第一天，又回到术前水平。与血浆中弹性蛋白酶-PI复合物的动力学相比，MBE变化时间短，上升和下降的速率快，这一特点使之能更敏感地反映体外循环对中性粒细胞的影响。体外循环后，大量白细胞从骨髓和边缘池进入血循环，但MBE在术后第一天即回至术前水平，说明新释放的白细胞没有MBE异常表达(图1，表4）。
图1体外循环前后体循环中性粒细胞数量和MBE活性的动态变化（略）
T0：手术前；T1：主动脉开放后10min；T2：体外循环结束；T3：手术后第一天。使用配对t检验与T0时刻比较*P<0.05，**P<0.01
表4体外循环前后体循环中性粒细胞数量和MBE活性的动态变化（略）
肺对白细胞的扣押是体外循环激活白细胞后的现象［18］。文献显示，开放主动脉后，左房内氧自由基浓度较右房高，提示肺血管参与了中性粒细胞的激活［18］。本研究中，我们曾假设左房内MBE活性比右房高，然而，结果显示在左房和右房内的MBE活性没有差别，这提示肺在诱导MBE表达方面作用甚微（图2，表5）。
图2主动脉钳开放后10min左房和右房中性粒细胞数量和MBE活性（略）
RA:右房;LA:左房。右房和左房差异使用配对t检验，*P<0.05
表5主动脉钳开放后10mins左房和右房中性粒细胞数量和MBE活性（略）
与MBE相比，MBE总活性真正反映了体内MBE总量。基于上述MBE在中性粒细胞的出血管过程和组织消化过程中所起的重要作用，MBE总活性的改变应与组织损伤生化标记物、器官功能参数变化相一致，MBE总活性减少应伴随诸如C反应蛋白、肌酸磷酸激酶、血淀粉酶等生化标记物的减少及心、肺功能参数趋向好转，但在本研究中未发现这种紧密相关关系。这提示在体外循环导致的炎性反应和组织损伤中，除膜弹性蛋白酶外，尚有其他重要机制参与了这一过程。
4结论
体外循环可诱导中性粒细胞膜上的MBE表达增加，MBE变化时间短，上升和下降的速率快，能更敏感反映体外循环对中性粒细胞的影响。经过肺循环的中性粒细胞，其膜上MBE的表达没有改变，提示肺在诱导MBE表达方面作用甚微。MBE在中性粒细胞的出血管过程和组织消化过程中起着重要作用，但MBE和MBE总活性与CRP等无明显相关，提示在体外循环导致的炎性反应和组织损伤中，除膜弹性蛋白酶外，尚有其他重要机制参与了这一过程。
【参考文献】
1KirklinJK,WestabyS,BlackstoneEH,plementandthedamagingeffectsofcardiopulmonarybypass.JThoracCardiovascSurg，1983，86:845-857.
andysfunctionaftercardiopulmonarybypass.Asystemicinflammatoryreactioninitiatedbytheextracorporealcircuit.IntensCareMed，1987，13:89-95.
3WeissmannG,SmolenJE,KorchakHM.Releaseofinflammatorymediatorsfromstimulatedneutrophils.NewEnglJMed，1980，303:27-34.
4HashimotoK,MiyamotoH,SuzukiK,etal.Evidenceoforgandamageaftercardiopulmonarybypass.Theroleofelastaseandvasoactivemediators.JThoracCardiovascSurg，1992，104:666-673.
5ButlerJ,PillaiR,RockerGM,etal.Effectofcardiopulmonarybypassonsystemicreleaseofneutrophilelastaseandtumornecrosisfactor.JThoracCardiovascSurg,1993,105:25-30.
6SchwartzJD,ShamamianP,SchwartzDS,etal.Cardiopulmonarybypassprimespolymorphonuclearleukocytes.JSurgRes,1998,75:177-182.
7FaymonvilleME,PincemailJ,DuchateauJ,etal.Myeloperoxidaseandelastaseasmarkersofleukocyteactivationduringcardiopulmonarybypass.JThoracCardiovascSurg,1991,102:309-317.
8TravisJ.Structure,function,andcontrolofneutrophilproteinase.AmJMed,1998,84:37-42.
9OwenCA,CampbellMA,SannesPL,etal.Cellsurface-boundelastaseandcatepsinGonhumanneutrophils:anovel,non-oxidativemechanismbywhichneutrophilsfocusandpreservecatalyticactivityofserineproteinases.JCellBiology,1995,131:775-789.
10CepinskasG,SandigM,KvietysPR.PAF-inducedelastase-dependentneutrophiltransendothelialmigrationisassociatedwiththemobilizationofelastasetotheneutrophilsurfaceandlocalizationtomigrationfront.JCellSci,1999,112:1937-1945.
11OwenCA,CampbellMA,BoukedesSS,etal.Cytokinesregulatemembrane-boundleukocyteelastaseonneutrophils:anovelmechanismforeffectoractivity.AmJPhysiol,1997,272:385-393.
12HermantB,BibertS,ConcordE,etal.Identificationofproteasesinvolvedintheproteolysisofvascularendotheliumcadherinduringneutrophiltransmigration.JBiolChem,2003,278:14002-14012.
13HjorthR,JonssonAK,VretbladP.ArapidmethodforpurificationofhumangranulocytesusingPercoll.Acomparisonwithdextranesedimentation.JImmunolMethods,1981,43:95-101.
14PiconeAL,LutzCJ,FinchC,etal.Multiplesequentialinsultscausepost-pumpsyndrome.AnnThoracSurg,1999,67:978-985.
15GuYJ,SchoenP,TigchelaarI,etal.Increasedneutrophilprimingandsensitizationbeforecommencingcardiopulmonarybypassincardiacsurgicalpatients.AnnThoracSurg,2002,74:1173-1179.
16YurewiczEC,ZimmermanM.CytechalasinB-dependentreleaseofazurophilgranuleenzymesfromhumanpolymorphonuclearleukocytes.Inflammation,1977,2:259-264.
17RiegelW,SpillnerG,SchlosserV,etal.Plasmalevelsofmaingranulocytecomponentsduringcardiopulmonarybypass.JThoracCardiovascSurg,1998,95:1014-1019.
18RoystonD,FlemingJS,DesaiJB,etal.Increasedproductionofperioxidationproductsassociatedwithcardiacoperations.Evidenceforfreeradicalgeneration.JThoracCardiovascSurg,1986,91:759-76
