超滤法对绿原酸提取率影响

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摘要：目的考察超滤法纯化金银花提取液的最佳条件。方法采用超滤法（分子截留值5000），采用高效液相色谱法测定绿原酸的含量，筛选超滤压力、药液流速、循环时间3个因素的最佳条件。结果压力控制在0.05～0.07MPa，循环流速控制在2d/s左右，循环时间控制在2h内，最终纯化液干浸膏中绿原酸高达44.10mg/g.。结论本法是纯化金银花药材及其制剂的一种快速有效的方法。

关键词：超滤法；金银花；绿原酸；纯化条件

超滤法是20世纪60年代兴起的一项膜分离新技术。国内已有人将超滤法运用到金银花的提取中，以超滤法与醇沉法相比较,实验结果显示70%醇沉法较超滤法得到的提取物多，但绿原酸得率低，超滤法较水提醇沉法能更有效地保留有效成分［1］。

绿原酸分子量为354.3，采用超滤(分子量截留值5000)可以除去其中的多糖、蛋白质等大分子物质。本实验对高速离心后的水提液进行超滤，用高效液相色谱法测定超滤液中绿原酸含量，以确定超滤程度，避免有效成分的损失。

1仪器与试药

中空纤维超滤膜实验室小设备（北京旭邦膜设备有限责任公司）；RB15蠕动泵（天津纺织工学院膜技术工程公司机械厂）；中空纤维超滤柱CLW003（聚醚砜，50mm×300mm，pH值2～13，截留分子量5000）（北京旭邦膜设备有限责任公司）；美国Agilent1100液相色谱仪系统；AL104型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

绿原酸对照品（中国生物制品检定所提供，批号110753－200212），甲醇、乙腈均为色谱纯试剂，磷酸为分析纯试剂，水为超纯水。药材购自江苏省药材公司，由中国药科大学中药学院生药学鉴定室鉴定为忍冬科植物山银花LoniceraconfusaDC.的干燥花蕾或带初开的花科。

2实验方法

2.1绿原酸含量的测定

2.1.1对照品溶液的制备精密称取在50℃真空干燥至恒重的绿原酸对照品5mg，置10mL棕色量瓶中，加体积分数为50%的甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL，置10mL棕色量瓶中，加体积分数为50%的甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL中含绿原酸50μg)。因绿原酸受热见光易分解，宜用棕色量瓶贮存并置4℃冰箱备用。

2.1.2色谱条件色谱柱YMCPackODS柱（250mm×4.6mm）；柱温：25℃；流动相：乙腈0.4%磷酸（体积比13∶87）；流速为1mL/min；检测波长：327nm。

2.1.3标准曲线的制备精密吸取对照品溶液(50.10μg/mL)1,5,10,20,40μL分别注入液相色谱仪，以绿原酸对照品的量为横坐标(x)，以绿原酸峰面积为纵坐标(y)，计算回归方程为：y=158.69x+2.1483，r=0.99998。结果表明绿原酸在0.0501～2.0040μg范围内呈良好线性关系。

2.1.4样品测定精密吸取样品溶液1mL于10mL量瓶中，相应溶剂定容，摇匀，采用随行标准法。

2.1.5供试品溶液的制备提取液经0.45μm滤膜滤过，即可。

2.2超滤仪的使用

2.2.1初用时的前期处理

①将超滤组件内的保护液放掉，储液箱内加入清洗水，水压不超过0.15MPa，进水通过超滤组件经浓缩液口和超滤液口排出，不得小于10min。

②采用质量分数0.2%～0.5%的氢氧化钠溶液循环清洗30min。清洗时浓缩液口排液量应稍大于超滤液口的排液量。

③蒸馏水清洗超滤组件，至少40min。2.2.2运行样品（经高速离心后）从料液槽中经蠕动泵输入中空纤维超滤柱，其中的大分子杂质从浓缩液出口回到原样品料液槽中，而小分子药液则在压力驱动下透过超滤膜，从中空纤维外腔的透过液出口流出。如此反复循环，直到达到分离和浓缩要求。超滤过程中，压力通过调压阀和蠕动泵的转速来控制，流量通过蠕动泵的转速调节钮控制。超滤完毕，用蒸馏水等压冲洗（关闭超滤液出口）数次，至达到要求。

2.2.3清洗每次运行完毕后，应对整个超滤系统进行清洗：用质量分数为0.2%～0.5%的NaOH溶液,浸泡2h，循环清洗1h;质量分数为0.2%～0.5%的HCl溶液，浸泡2h，循环清洗1h;用纯水清洗至排出液pH值为6～7。

洗涤过程中可正、反向交替洗涤，如果污染较严重则用质量分数为0.1%的过氧化氢进行清洗。

2.3超滤条件的确定

在超滤设备已经确定的情况下，可调整的操作条件主要有操作压力、温度、时间、循环流速等［2］。

2.3.1操作压力的确定当操作压力较低时，膜阻可近似为常数，此时膜通量与膜两侧的压力差成正比，压力过低，通量过低，纯化效率低。随着操作压力的增加，膜通量增加，纯化效率提高。但当操作压力过高时，由于膜的结构比较疏松，这样会使膜产生压实或增厚，其通道变窄，膜阻增大，使溶质对流迁移到膜表面的速度增大，从而部分地或完全地抵消了错流流动的剪切力所产生的在膜表面沉淀的溶质的迁移，膜通量下降。

通过实验得出操作压力对流速影响的曲线见图1。从图1可见，当操作压力在0.05～0.07MPa时，浓缩液的流速是最快的。

图1操作压力对流速的影响（略）

Fig.1Theeffectofoperationpressuretoflowrate

2.3.2循环流速的确定通常操作压力及温度一定时，超滤循环液流速对膜通量的影响十分显著。低流速时，大分子物质趋向于在膜表面沉积，从而增加了浓差极化及凝胶层的形成，此时浓差极化阻力以及凝胶层的阻力远远大于膜阻，膜通量主要受浓差极化及凝胶层的控制。

因此，为减少浓差极化及凝胶层的影响，在条件允许的情况下，应尽可能地提高循环流速。通过实验，选取循环流速2d/s或偏大一些，见图2。

2.3.3循环时间的确定从图3可看出，随着时间的增多，超滤液不断透过，浓缩液中大分子杂质量也在不断地提高，2h之后，浓缩液流速下降迅速。所以为了提高纯化效率，节约操作时间，延长设备使用寿命，超滤2h即可。

图2超滤液流速的确定（略）

Fig.2Determinationofflowrateofultrafitration

图3循环时间的确定（略）

Fig.3Determinationofcircletime

3结果与讨论

3.1本实验选用分子量截留值为5000的超滤膜，最终工艺定为超滤设备压力控制在0.05～0.07MPa，循环流速控制在2d/s左右，将原药材100g，水煎煮后合并提取液，高速离心后，进行超滤，收集超滤液。浓缩干燥，测最终纯化后提取物干膏得率为6.12%，其中绿原酸为44.10mg/g。

3.2文献［3,4］报道超滤法较醇沉法更能有效地保留有效成分,并能提高口服液的稳定性和澄明度。文献报道中多选用分子量截留值为10000的超滤膜,绿原酸得率为95.37%［1］。我们发现药物中大部分有效成分分子量皆小于5000,故采用5000分子量的超滤膜,结果纯化效果更佳，实验过程中药液杂质少，透明度高，因此超滤仪器的清洗及超滤膜的再生也较10000级超滤膜简单快速,可大大缩短工艺的时间。最终产品得率高，符合工艺要求。

【参考文献】

［1］刘振丽，张秋海，欧兴长．超滤及醇沉对金银花中绿原酸的影响［J］．中成药，1996，18（2）：5.

［2］孟根达莱,刘栓娣,青格乐.醇沉工艺对中成药质量的影响［J］.中成药,1996,18(3):516.

［3］刘振丽,张秋海,欧兴长.超滤与醇沉对中研I号冲剂有效成分影响的对比研究［J］.中草药,1998,29(7):451.

［4］刘振丽,张秋海,欧兴长.超滤条件对中药四妙勇安汤超滤的影响［J］.膜科学与技术,1999,19(2):554-556.