仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌作用

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摘要：【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠lewis肺癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。【方法】将50只Lewis肺癌荷瘤小鼠分为仙鱼汤高、中、低剂量组（剂量分别为1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1），环磷酰胺（CTX）组（剂量为20mg·kg-1·d-1），荷瘤模型组；计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率；制备单细胞悬液，采用流式细胞仪检测各组小鼠Lewis肺癌细胞周期、细胞凋亡率；采用免疫组化法检测各组Lewis肺癌小鼠的bcl2基因的表达。【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组，肿瘤细胞凋亡率均高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），仙鱼汤各组随着药物剂量的增大，抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于S期的细胞比例均低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），呈现明显的G0/G1期阻滞现象。仙鱼汤各剂量组bcl2染色强度指数显著低于模型组（P＜0.01）。【结论】仙鱼汤具有抑制小鼠Lewis肺癌生长的作用，其机理可能与通过降低bcl2表达从而促进肿瘤细胞凋亡有关。

关键词：仙鱼汤／药理学肺肿瘤／中药疗法细胞凋亡基因表达调控细胞培养

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方，具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效，多年的临床应用已证实其具有较好的临床疗效［1-2］。本研究通过动物实验，进一步研究了仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用，并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。现报道如下。

1材料与方法

1.1动物C57BL/6J小鼠，雌雄各半，体质量18～22g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：0020535）。

1.2瘤株小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，广州中医药大学第一附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。

1.3药物与制备仙鱼汤组成：仙鹤草15g，鱼腥草30g，猫爪草30g，山海螺30g，党参15g，三七片10g，山慈菇10g，浙贝母15g，守宫5g，天冬15g，黄芪30g，炙甘草5g。由广州中医药大学新药研究中心制备，按照传统煎煮法煎煮，低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表面积与计量换算法计算［3］，低剂量组1.092g/mL，中剂量组2.184g/mL，高剂量组4.368g/mL，分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍。制备后于4℃冰箱中贮存备用。环磷酰胺（CTX）注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品（批号：20060206），200mg/支，临用前用生理盐水溶解，稀释浓度为2mg/mL，根据CTX的半数致死量（LD50）为472mg/kg，注射用量为LD50的1/3～1/5，故小鼠给药剂量设为20mg·kg-1·d-1。

1.4主要试剂与仪器碘化丙啶（PI）染液为晶美生物工程有限公司产品；bcl2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色（SABC）试剂盒（SA1022）均为博士德生物工程有限公司产品；RPMI1640培养基为Gibco公司产品；二甲苯、乙醇，均为市售分析纯；超净工作台（苏净集团安泰公司）；冷冻桌面离心机（Eppendorf5810RCentrifuge）；解剖显微镜（北京电子光学设备厂）；37℃电热恒温水浴箱（上海恒丰仪器仪表有限公司）；ALTRA型流式细胞仪（美国Beckmancoulter公司）；CSⅣ型烤片机（孝感市电子仪器厂）；亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）。

1.5Lewis肺癌荷瘤小鼠模型复制于液氮罐中取出Lewis肺癌细胞株1支，置于37℃电热恒温水浴箱内，轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加体积分数10％小牛血清RPMI1640培养基，常规离心，制成瘤细胞混悬液，台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。消毒小鼠右前腋，取0.2mL（约1×106～2×106个瘤细胞）接种于皮下。传代3次。在无菌条件下剥离Lewis肺癌荷瘤鼠皮下瘤块，选取生长良好的瘤组织，剪碎、称质量，用细胞匀浆器制成匀浆，按体积比1：3加生理盐水制成瘤细胞混悬液，接种于C57BL/6J小鼠右前肢腋窝皮下，每只0.2mL（约1×106～2×106个瘤细胞）。

1.6分组及给药接种24h后随机分为5组:仙鱼汤高剂量组（剂量为1.747g/kg）、仙鱼汤中剂量组（剂量为0.874g/kg）、仙鱼汤低剂量组（剂量为0.437g/kg）、CTX阳性对照组（剂量为20mg/kg）、荷瘤模型组。中药各组均予以0.4mL中药灌胃，CTX组予以0.2mL腹腔注射，荷瘤模型组予以0.4mL生理盐水灌胃，均每日1次，给药14d。

1.7观察指标及检测方法

1.7.1小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。

1.7.2抑瘤率末次给药后24h，Lewis荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，用眼科剪分离剥取肿瘤，电子天平称质量，计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率［4］：p抑瘤=（1－m实验组/m模型组）×100%。

1.7.3细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织，加入生理盐水洗净血迹后倒掉，再加入1mL生理盐水，用眼科剪剪碎组织，吸管轻轻吹打，过300目筛，收集单细胞悬液于流式专用管，加入2mL中性磷酸盐缓冲溶液（PBS），1300r/min离心5min洗涤2次，调整细胞计数约1×106/mL，加入体积分数70％冰乙醇2mL吹打后封口固定，保存于4℃冰箱24h。将固定的单细胞悬液离心，去固定液，加入PBS重新悬浮，洗涤2次，300目筛网过滤1次，加入1mLPI染液（终浓度100mg/L），4℃避光染色30min，流式细胞仪检测，收集50000个细胞，应用multicycle软件分析凋亡率［5］。

1.7.4病理检查肿瘤组织经体积分数10％福尔马林固定24h后常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。

1.7.5bcl2阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后，4μm厚连续切片，行SABC法免疫组织化学染色，用PBS液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察，bcl2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野（400）下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数（stainingintensityindex，pSII）。pSII＝（pA强度瘤细胞×0）＋（pB强度瘤细胞×1）＋（pC强度瘤细胞×2）＋（pD强度瘤细胞×3）。其中A强度代表细胞浆无特异性染色；B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色，染色较浅；C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色；D强度代表细胞浆呈特异性深棕色，染色较深。染色强度指数（pSII）的范围在0～3［6］。

1.8统计学分析采用SPSS11.5统计软件处理。

2结果

2.1一般状况的观察实验结束后，模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小，活动少，喜聚群，毛发缺少光泽；CTX组小鼠于实验5～7d开始出现脱毛，进食减少；仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组，活动力优于CTX组及模型组。

2.2各组抑瘤率比较表1结果表明，仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大，瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率逐渐增高。表1各组Lewis肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较（略）

Table1Comparisonoftumormassweightandtumorinhibitoryrateindifferentgroups

统计方法：单因素方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，与模型组比较

2.3各组细胞凋亡率及细胞周期分析仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组小鼠Lewis肺癌细胞凋亡率均高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），各仙鱼汤组随着剂量的增大，凋亡率亦逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于G0/G1期细胞的比例均高于模型组，其中仙鱼汤高剂量组、CTX组与模型组比较，差异有显著性意义（P＜0.01）。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于S期细胞的比例均显著性低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），呈现明显的G0/G1期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于G2/M期细胞的比例与模型组比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。结果见表2、图1。

2.4光镜观察模型组癌细胞大小和形态很不一致，可见瘤巨细胞；癌细胞核体积增大，细胞核和细胞浆比例增大，核的大小、形状、染色不一，可见巨核、多核，核染色深，核染色质呈粗颗粒状，分布不均匀；核仁肥大，数目增多，核分裂相增多，可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相，间质内淋巴细胞少见（图2-a）。CTX组可见大片坏死，间质见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润，纤维组织反应性增生（图2-b）。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大，间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润，可见较多的细胞凋亡小体（图2-c、d、e）。

2.5各组bcl2染色强度指数凋亡相关基因bcl2的阳性产物主要位于细胞浆，可见大量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组bcl2的染色强度指数均显著低于模型组（P＜0.01），并呈剂量依赖性，而CTX组与模型组比较差异无显著性意义（P＞0.05）。结果见表3、图3。

表2各组小鼠Lewis肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析（略）

Table2Comparisonofcellapoptosisratioandcellcycleanalysisindifferentgroups

统计方法：单因素方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，与模型组比较

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图1各组凋亡率检测流式细胞图谱比较（略）

Figure1Resultsofcellapoptosisratiodetectedbyflowcytometerindifferentgroups

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图2各组肿瘤组织形态比较（HE染色，×400）（略）

Figure2Morphologicalchangesoftumorcellsunderlightmicroscopeindifferentgroups（HEstaining，×400）

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图3各组bcl2阳性表达比较（免疫组化，×400）（略）

Figure3Positiveexpressionofbcl2indifferentgroupsdetectedbyimmunohistochemicalmethod

表3各组bcl2染色强度指数比较（略）

Table3Comparisonofstainingintensityindexofbcl2indifferentgroups

统计方法：单因素方差分析；①P＜0.01，与模型组比较

3讨论

多数学者认为，肺癌发生发展的中医病机可以用"痰、瘀、虚"3个字高度概括。其中正虚是肺癌发生的基础，《医宗必读》云："积之成者，正气不足，而后邪气踞之。"正虚又以脾虚为主，"脾为生痰之源，肺为贮痰之器"。正是脾虚导致痰浊内生，进一步血停成瘀，瘀血内生，痰瘀内阻，蕴积肺部，日久而发为本病。

广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发，以健脾清肺、化痰祛瘀为治疗大法，自拟了治疗肺癌的经验方"仙鱼汤"。方中君药为党参，具有补中益气、健脾益肺、生津养血的功效，为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参，以补肺脾之气；浙贝母清热化痰、开郁散结；猫爪草散结消肿；三七片化瘀散结止痛，共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌；鱼腥草清热解毒、消痈排脓；天冬养阴清肺生津；山海螺解毒消肿、排脓祛痰；山慈菇清热解毒、化痰消肿散结；守宫散结止痛，共为佐药。炙甘草调和诸药，为使药。综合全方，扶正祛邪，攻补兼施，使祛邪而不伤正，共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。

肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关，而且与细胞凋亡的调控失常有关。人类细胞的凋亡机制十分复杂，目前已鉴定出了构成凋亡途径的多种成分，揭示出凋亡是受多种基因调控的，例如p53、p16、cmyc、bcl2、bax等相关基因均参与了细胞凋亡的调控［7］。bcl2是一种凋亡相关基因，被激活的bcl2基因的主要作用是抑制细胞凋亡，下调bcl2基因的表达，对肿瘤细胞有显著的生长抑制作用。bcl2可能通过阻断凋亡的公共信号传递通路（如抑制线粒体释放细胞色素C）达到抑制或阻断多种细胞及细胞系的细胞凋亡过程。随着该基因蛋白产物的过度表达，使得细胞增殖与凋亡的平衡发生紊乱，从而阻断细胞凋亡的最后共同通道，从而抑制细胞凋亡，导致癌变［8－11］。

本研究通过动物移植性肿瘤实验法探讨仙鱼汤对Lewis肺癌生长及肿瘤细胞凋亡的作用。结果表明，仙鱼汤具有一定的抗肿瘤作用，而且其抑瘤作用随着剂量的增加而增强。从HE染色的病理切片中发现，不同剂量仙鱼汤组可见癌巢内坏死面积增大，间质可见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润，可见较多的细胞凋亡小体。进一步采用流式细胞仪检测凋亡率，结果表明仙鱼汤具有促进小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的作用，并且随着剂量的增加作用也逐渐增强。仙鱼汤各剂量组处于G0/G1期细胞的比例均高于模型组，处于S期细胞的比例均低于模型组，呈现明显的G0/G1期阻滞现象，提示仙鱼汤可能使G1期细胞不能通过细胞周期检测点进入S期，从而发生G0/G1期阻滞，阻断DNA复制，干扰肿瘤细胞周期正常进行，以起到抑制肿瘤的作用。免疫组化检测结果显示，仙鱼汤各剂量组bcl2蛋白表达均显著低于模型组，并随着仙鱼汤剂量的加大，肿瘤组织bcl2的染色强度指数也逐渐降低。本研究实验结果提示仙鱼汤可能通过降低bcl2表达的途径促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用，对临床用药具有一定的指导意义。

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