大青叶中靛玉红含量测定

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【关键词】大青叶

SFEtechnologyofindirubinfromDaqingyeandcontentdeterminationofindirubin

【Abstract】AIM:TouseHPLCforthecontentdeterminationofindirubininsupercriticalfluidextraction(SFE)materialfromDaqingyeandtooptimizetheprocessofSFE.METHODS:Contentofindirubinwasusedasindextoevaluatethetechnologiesbasedonorthogonaldesign,inwhich4factorsconsideredwereextractiontemperatureandpressure,separationtemperatureandpressure.AHPLCsystemwasusedtodeterminethecontentofindirubin.RESULTS:Optimalprogramwasasfollows:extractiontemperature50℃andpressure40MPa,separationtemperature40℃andpressure8MPa.Theaveragerecoveryofindirubinwas102.8%andRSDwas1.48%.CONCLUSION:Theextractiontemperature,extractionpressureandseparationpressureallhavesignificanteffectsontheextractionrateofindirubin.TheHPLCmethodissimple,preciseandsuitableforthecontentdeterminationofindirubininSFEmaterialofDaqingye.

【Keywords】Daqingye;SFECO2;indirubin;chromatography,highpressureliquid

【摘要】目的：建立用HPLC测定大青叶的超临界萃取物中靛玉红含量的方法，对萃取工艺进行优选.方法：采用超临界萃取法进行L9(34)正交实验.以靛玉红含量考察萃取温度、萃取压力、分离温度及分离压力四个因素的影响.采用HPLC法测定萃取物中靛玉红含量.结果：最佳萃取工艺为萃取温度50℃,萃取压力40MPa,分离温度40℃及分离压力8MPa.靛玉红平均回收率为102.8%，RSD为1.48%.结论：萃取温度、萃取压力及分离压力对大青叶中靛玉红的萃取都有显著影响.HPLC法操作简便，结果准确，可作为超临界萃取大青叶中靛玉红的质量控制方法.

【关键词】大青叶；CO2超临界萃取；靛玉红；色谱法，高压液相

0引言

靛玉红主要来源于植物马蓝(Baphicacanthuscusia)、蓼蓝(Polygonumtinctorium)及菘蓝(Isatisindigotica)的中药材如大青叶、板蓝根、青黛等，靛玉红是其主要有效成分.靛玉红有治疗慢性髓性白血病作用，是一种应用前景广阔的抗肿瘤成分［1］.

靛玉红在中药材中含量很低，为减少药物使用量，提高生物利用度，我们用超临界流体萃取（SFE）法对大青叶中的靛玉红进行分离提纯，同时建立萃取物中靛玉红含量的HPLC测定方法，优化靛玉红SFE工艺.

1材料和方法

1.1材料GoldenSystem高效液相色谱仪（美国Beckman公司），配125型高压双泵，168型二极管阵列检测器；色谱柱:SynersiFusionRP柱（4.6mm×250mm，4μm，美国Phenomenex公司）；FY2215006超临界萃取仪（南通市飞宇石油科技开发有限公司）；R200D电子分析天平（德国Satorius公司）；旋转蒸发仪（EYELAASPIRATORA3SRIKAKIKATCO.LTD）.大青叶购自西安药材市场，按照中国药典（2005年版）有关大青叶项下鉴定本品为合格药材；靛玉红对照品购自中国药品生物制品检定所，批号717200204；甲醇为HPLC级（美国FISHER公司），水为超纯水，其余试剂均为AR级.

1.2方法

1.2.1SFE正交实验设计采用L9(34)设计，选择萃取温度、萃取压力、分离温度及分离压力四个因素，每个因素取3水平.分别为萃取温度40,50及60℃；萃取压力20,30及40MPa；分离温度30,40及50℃；分离压力8,10及12MPa.

1.2.2供试品溶液的制备打开超临界萃取仪，按1.2.1的设计设置萃取仪温度参数，预热完毕后将精密称取的大青叶50g放入萃取缸Ⅱ，按1.2.1的设计将压力值调整到需要的参数，同时向副泵系统下的夹带剂缸中加入氯仿100mL，开动副泵，开始萃取.每半小时收集一次分离液，至2h内连续收集不到液体时停止该次实验.将收集到的分离液在旋转蒸发仪上蒸干，用甲醇定容于10mL容量瓶中，作为供试品溶液.

1.2.3色谱条件以甲醇0.015mol/L醋酸铵（72∶28）（用醋酸以1∶150的比例调节pH值）为流动相；流速为1.0mL/min；检测器灵敏度：1.0AUFS；柱温20℃；检测波长289nm.理论板数按靛玉红峰计算不低于4000.对照品及样品色谱图不同(图1,2).

图1靛玉红对照品的色谱图（略）

图2样品色谱图（略）

1.2.4线性考察精密称取靛玉红对照品10mg，用甲醇定容于50mL容量瓶中，超声5min，制成0.2g/L的对照品溶液，分别精密吸取该对照品溶液3,2,1,0.5及0.2mL于5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度.各取以上5个对照品溶液20μL进样于HPLC系统中，以色谱峰面积对靛玉红进样浓度作线性回归，得回归方程Y=10.83427+0.68547X,r=0.9994.靛玉红在8~120mg/L内，线性关系良好.

1.2.5精密度测定取线性关系中同一对照品液连续进样5次，每次20μL，靛玉红峰面积RSD为1.74%.

1.2.6稳定性实验将同一供试品液在0,1,2,4,12h各进样一次测试峰面积，结果RSD为2.65%，表明样品溶液在12h内稳定.

1.2.7重复性实验取同一供试品液5份，依法测定，结果靛玉红平均含量为17.33μg/g，RSD为2.07%.

1.2.8加样回收率实验精密量取已知含量的同一供试品液3份，每份1mL，分别精密加入0.4mL浓度为0.04g/L的对照品溶液，按样品含量测定方法操作，平均回收率为102.8%,RSD为1.48%.

1.2.9样品测定精密吸取上述正交实验提取的供试品溶液各20μL进样,按1.2.3色谱条件进行测定.

2结果

外标法计算靛玉红含量（表1），并计算每个因素每水平的靛玉红含量（表2）.

表1不同工艺的靛玉红含量（略）

表2每个因素每水平的靛玉红含量（略）

K值为每因素每水平的三个值之和，如K1为每因素水平为1时的三个值的和，余同.R为级差，即K1,K2和K3三个值中最大值与最小值之差.

对实验数据进行方差分析，结果萃取温度、萃取压力及分离压力对靛玉红的回收率均有显著影响（P<0.05）.将级差R值依大小排列，则影响靛玉红含量的四因素主次顺序为萃取温度>萃取压力>分离压力>分离温度.以每个因素每水平的K值中的最大值得知：最佳工艺为萃取温度50℃、萃取压力40MPa、分离温度40℃及分离压力8MPa.按最佳工艺条件萃取了三份大青叶（50g）进行验证试验，结果靛玉红平均含量为21.87μg/g，表明该工艺稳定，测定值在较高范围.

3讨论

3.1萃取实验条件的选择在设计正交实验时，为更准确地定位萃取温度的水平范围，在SFE的预实验中做过萃取温度最高60℃和最低30℃（其他条件固定不变）的靛玉红回收率比较，结果发现高温萃取回收率较高，故在正交设计中舍去萃取温度30℃这个水平.另三个因素的水平设定是依据仪器的工作参数而定的.在选择夹带剂时曾做过氯仿和甲醇的比较，因为靛玉红在冷甲醇中易析出，故本实验选择氯仿为萃取夹带剂.在预实验中考虑了萃取时间和CO2流量的影响，结果不同的实验条件下，分离液的流出没有固定的时间规律，萃取仪CO2流量在2L/h左右,不可调节,故未将萃取时间和CO2流量两因素纳入正交实验设计中.

3.2HPLC条件的选择靛玉红在242,292,362,544nm处有吸收［2］，而本实验中靛玉红的紫外最大吸收波长为289nm.实验曾用乙腈与水配比作流动相，在反相色谱中用有机碱三乙胺调节峰形，结果效果不理想.最后用甲醇比水加入醋酸铵，用酸适当调整pH值，所得结果峰形理想，分离效果好.曾直接以氯仿作溶剂进样，结果氯仿有较强的吸收峰，改为甲醇作溶剂后得以改善.

查阅文献未见类似有关大青叶中靛玉红SFE工艺的报道.而大青叶中含有的其他活性成分［3］是否被萃取出来，其含量如何，则有待进一步研究.

【参考文献】

［1］唐俐，段积华.靛玉红及其衍生物的研究［J］.重庆医科大学学报,2000,25(2):219-221.

［2］李彬,郑国平.高效液相色谱法测定锡类散中靛玉红的含量［J］.药物鉴定,2004,13(5):39-40.

［3］陈海红，孙建宇.大青叶的研究进展［J］.中国药业，2004,13(8):79-80