木瓜多糖鉴定

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摘要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、复合提取法从木瓜中提取多糖，经过分离纯化后，进行IR鉴定。为木瓜多糖的工业化生产提供了一定的理论依据。

关键词：木瓜；多糖；提取；分离；鉴定

0前言

多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是一种具有广泛生物活性的大分子。从各种中草药和其他植物中都可以提取分离出多糖，我国近年来对植物多糖，特别是具有中国特色的中草药多糖的药物活性已有广泛报道。

木瓜原名番木瓜，始载于《名医别录》，属蔷薇科木瓜属植物，是我国特有果木之一，主要生长在亚热带温暖湿润的山区地带，是一种药食同源的植物，性温味酸。现代医学证明：木瓜果实中含有丰富的糖分、番木瓜碱、木瓜蛋白酶，并含有17种以上的氨基酸及多种微量元素。目前已有大量木瓜产品上市，如木瓜饮料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜脯等，深受人们的喜爱。

湖北建始县盛产木瓜，但是创收的途径主要是通过销售鲜木瓜或干木瓜，其他相关产品的开发并不多见。从木瓜中提取和分离鉴定具有保健和药理活性的功能性成分，对于提高木瓜的经济价值，解决目前农民木瓜丰产不丰收、大量木瓜急待加工开发的问题具有积极的意义。

本实验对木瓜中多糖进行研究，拟对其提取工艺进行优化，并对粗多糖进行分离纯化鉴定组成和结构进行初步表征，为进一步提高木瓜的附加值提供试验依据。

1材料与方法

1.1材料

（1）原料：湖北省建始县干木瓜片，粉碎机粉碎

（2）仪器：TDL-5-A台式离心机，UV-7504紫外-可见分光光度计，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，紫外扫描仪，付立叶变换红外光谱仪，Prostar高效液相色谱仪等。

（3）试剂：石油醚（沸程60-90℃），丙酮，乙醇（95%），戊醇，三氯甲烷，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，硫酸，盐酸，苯酚，葡萄糖，乙醚，三氟三氯乙烷，三氯醋酸，碘液，硫酸铜，酒石酸钾钠，D-半乳糖，溴化钾，碳酸钡。

1．2方法

（1）多糖的测定：用苯酚-硫酸法对多糖测定。

（2）多糖的提取：①不同提取多糖方法的比较。分别用索氏抽提法，水提醇沉法，乙醇回流提取法，复合提取法提取木瓜中的多糖，并比较多糖得率，选择较好的水提醇沉法进行优化处理。

②水提醇沉法提取多糖工艺的优化

单因素试验

a温度对提取率的影响：加水量为30ml，水提时间为30分钟，分别在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃的水浴条件下，提取多糖，用苯酚-硫酸法测定其含量，

b加水量对提取率的影响：水浴温度为90℃，水提时间为30分钟的条件下，改变加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法进行测定，

c水提时间对提取率的影响：水浴温度为90℃，加水量为40ml的条件下，不同的水提时间对多糖得率的影响，

正交试验

根据单因素实验的结果，选取合适的水平，对其进行优化处理。

（3）多糖的分离、纯化。

①蛋白质的去除：分别用Sevage法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除样品中的蛋白质。

②低聚糖等小分子杂质的去除：通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。

③多糖的柱层析纯化：采用DEAE-52纤维素离子交换柱柱层析方法进行。

依次用0.5mol／L的NaOH、HCl和蒸馏水处理填柱材料至中性，反复处理三次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱。用pH=7.6PBS溶液平衡48小时。称取粗多糖1.0g，溶于少量蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液过柱。用0.1-2.0mol／L的NaCl-PBS溶液梯度洗脱，控制流速为1ml／min，采用部分收集器按5ml／tub收集。以苯酚-硫酸法测吸光值（490nm）作洗脱曲线，根据吸光值将同一组分合并。

（4）多糖的鉴定。

①淀粉的碘反应：将纯化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2ml，水浴加热，观察颜色是否有变化，同时做淀粉的对比试验。

②溶解性：称取纯化后的多糖0.5g，加入3ml的水，常温下搅拌，观察其溶解性。

③还原糖的测定：取0.1mg／ml的多糖溶液50ml于试管中，在80℃的恒温水浴锅中保温30分钟，吸取6ml，加入4ml的斐林试剂（等体积的斐林试剂A液和斐林试剂B液混合），于590nm处比色。

④蛋白质的测定：将纯化得到的多糖在190-400nm处进行UV扫描，观察在250-280nm处没有吸收峰，判断是否有核酸和蛋白质的存在。

⑤IR鉴定多糖中糖苷键的类型：将多糖与溴化钾烘干后，称取多糖2mg与100mg的溴化钾研磨，压片，置于红外图谱分析仪中作红外分析。

⑥HPLC鉴定多糖中单糖的组成：用高效液相色谱法对木瓜多糖的单糖组成进行定性鉴定。

样品的处理：称取纯化后的多糖10.0mg，加1mol／L的硫酸2ml，充N2后于100℃水浴加热5h，用BaCO3中和，膜过滤后作为待测样品。

标准液的配制：称取葡萄糖、半乳糖25mg，分别溶于5ml的蒸馏水中，配成5mg／mL的标准液，膜过滤后待用。

色谱条件：以AglientZorbaxCarbohydrate(4.6×250㎜,5um)糖分析柱为固定相，80%的乙腈为流动相，流速1.0mL／min，柱温25℃。利用示差检测器进行检测，进样量为20uL，分别对葡萄糖和半乳糖标样及样品进行检测。

2结果与分析

2．1标准曲线的建立

本研究采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标准建立标准曲线，见图2-1。

由上图可知，回归方程为y=0.0552x+0.0383，R2=0.9981。线性关系较好，可以以此来测定多糖的含量。

2．2多糖的提取

（1）不同提取多糖方法的比较。

对四种提取法方法进行对比，由吸光值可得其相对得率，结果见图2-2。

图2-2不同提取方法提取率的比较

比较以上四种提取方法，本研究选定较好的水提醇沉淀法作为提取木瓜中多糖的方法，并在单因素试验的基础上，通过正交试验进行优化提取工艺。

（2）单因素实验。

①温度对提取率的影响。

由图2-3可以得到，在相同的加水量及水提时间的条件下，在90℃时多糖的得率较高，提取效果较好，分析其原因，可以知道，升温有利于粗多糖得率提高，为获得较高提取率，应选择较高温度，但是温度超过90℃时，不仅多糖的生物活性有可能遭到破坏，而且考虑到大幅度升温会带来能源消耗。综合考虑效比，选择85℃、90℃、95℃作为正交试验的因素水平。

②加水量对提取率的影响。

水浴温度为90℃，水提时间为30分钟的条件下，改变加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法进行测定，结果见图2-4。

由图2-4可以得到，在相同水浴温度及水提时间的条件下，加水量为40ml时，多糖的得率相对较高，效果较好。在加水量为25ml或30ml时，由于水提的效果并不好，从而影响到醇沉效果，多糖的得率并不高，但加水过大，提取率反而下降，因此，加水量过少或过多均会造成多糖得率的降低。可以选择加水量30ml、45ml、60ml作为正交试验的三个水平。

③水提时间对提取率的影响。

水浴温度为90℃，加水量为40ml的条件下，不同的水提时间对多糖得率的影响，结果见图2-5。

由图2-5可知，水提时间越长，粗多糖的得率越高，当时间超过30分钟时，提取率增加量开始减少，在40分钟时，提取率最大，考虑到能源消耗、生产周期延长都会增加生产成本，水提时间不宜过长，因此选择15min、20min、30min作为正交试验的三个水平。（3）正交结果。

极差的大小反映出各因素对指标的影响程度，对多糖得率的影响因素的主次顺序为水浴温度>加水量>水提时间。因素A的最佳水平为第二水平即水浴温度90℃时效果最好，因素B加水量以第二水平的45ml最佳，因素C水提时间以第二水平的20分钟较好。因此，最优搭配为A2B2C2。按此工艺提取多糖其得率为7.8％。

2．3多糖的分离、纯化

（1）蛋白质的去除。

①Sevage法

用氯仿等有机溶剂使蛋白质变性离心除去，该方法能防止多糖的降解，但除蛋白效率低，需重复多次才能除尽，同时会消耗大量的有机溶剂，并不适合于工业化大生产。

②三氟三氯乙烷法

将多糖采用三氟三氯乙烷法除去蛋白，进行UV扫描结果可以看出，此法脱蛋白的效率不高，而且溶液沸点较低，易挥发，不宜大量应用。

③三氯醋酸法：将多糖采用三氯醋酸法除去蛋白后进行UV扫描显示，尽管三氯乙酸法除去蛋白的反应较为剧烈，可能会引起多糖的降解，使得率降低，但是三氯乙酸法除蛋白效果较好。所以本研究采用此法进行多糖脱蛋白处理。

（2）多糖的柱层析纯化：将采用三氯醋酸法去蛋白后的多糖，进一步采用DEAE-纤维素52进行纯化，结果显示经过DEAE-纤维素52纯化后，洗脱产物为单一组分。合并洗脱液，真空浓缩，冷冻干燥，可得到纯化的多糖。

2.4多糖的鉴定

（1）淀粉的碘反应：结果显示，溶液没有变蓝的现象，说明溶液中不含淀粉。

（2）溶解性：通过搅拌，没有不溶物出现，说明其溶解性良好。

（3）还原糖的测定：在590nm处比色，吸光值为0.012，说明还原糖的含量低。

（4）蛋白质的鉴定。

通过图谱可以得知，在纯化后的样品中于250-280nm处没有吸收峰，说明其不含蛋白质、核酸及多肽类物质。

（5）IR鉴定多糖中糖苷键的类型。

将纯化得到的木瓜多糖进行红外光谱扫描，结果显示纯化的产物具有典型的多糖特征光谱。经推测本研究纯化得到的木瓜多糖很可能是α-D型吡喃糖。

（6）多糖的单糖组分鉴定。

多糖水解后的HPLC分析见图2-7。

图中所示结果显示木瓜多糖水解后的产物只有一个峰，提示木瓜多糖可能只是由一种单糖组成。而且，样品在水解后生成的单糖并非葡萄糖与半乳糖，吸收峰的主要部分在葡萄糖与半乳糖以外。具体单糖组分还需要进一步研究加以确定。

3结论

（1）通过正交试验对水提醇沉法进行优化，最佳提取条件为水浴温度90℃、加水量为45ml、水提时间为30分钟。多糖的得率为7.8％。

（2）多糖的脱蛋白的分离过程中，以三氯醋酸法的去蛋白效果最好。再经过纤维素DEAE-52柱层析进行纯化，能得到精制的木瓜多糖。不含有淀粉和蛋白质，游离糖的含量也很低。

（3）IR鉴定结果表明本研究得到的木瓜多糖可能是α-D型吡喃糖，HPLC对单糖组分进行鉴定，提示其组成为非葡萄糖和半乳糖组成的单一单糖组成，具体单糖类型有待进一步研究鉴定。

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