灵芝孢子油减毒作用
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摘要：目的观察灵芝孢子油的扶正减毒作用。方法以正常和H22荷瘤小鼠为对象，通过检测外周血WBC数、骨髓有核细胞数、脾脏指数、胸腺指数来观察口服灵芝孢子油(2.5，1.25，0.625g/kg)对于环磷酰胺（Cy）化疗及60Co放疗的减毒作用；通过小鼠碳廓清实验、血清溶血素测定实验检测药物对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响。结果灵芝孢子油中高剂量组均可明显对抗由大剂量Cy、60Co照射造成的正常及荷瘤小鼠外周血WBC,骨髓有核细胞数，脾脏指数和胸腺指数下降(P＜0.01,P＜0.05)。灵芝孢子油各剂量均可显著提高荷瘤小鼠吞噬系数α，中高剂量组可明显提高荷瘤小鼠的血清半数溶血值（P＜0.01,P＜0.05)。结论灵芝孢子油可减低Cy和60Co所致的骨髓抑制毒性，并可显著提高小鼠细胞和体液免疫功能。
关键词：灵芝孢子油；免疫；环磷酰胺
灵芝是祖国医药宝库中的珍贵药品，我国最早的药学专著《神农本草经》将其列为“上品”。基于灵芝的确切临床治疗作用，近年来对其化学成分及作用机理进行了大量的研究，对灵芝的生殖细胞――孢子的药用价值研究也日趋深入。以往的研究表明，灵芝孢子具有显著的防癌、抗肿瘤作用，其功效是灵芝子实体的60～70倍。本实验所用灵芝孢子油是利用超临界CO2流体萃取技术从灵芝破壁孢子中提取出来并浓缩富集而得，其各种有效成分（如三萜类）的含量均较传统提取方法显著提高。本实验主要研究其对荷瘤小鼠的免疫调节及对常规放化疗的减毒作用，以期为灵芝孢子油的临床抗肿瘤辅助应用提供实验依据。
1材料
1.1药物灵芝孢子油，由广州灵芝孢子油现代中药研究开发有限公司提供，批号：050601，临用前用豆油稀释成所用浓度。云芝孢内糖肽胶囊，南京老山药业股份有限公司，批号：050104，规格：0.5g×21粒，临用前用生理盐水成所用浓度。注射用环磷酰胺，上海华联制药有限公司，规格：200mg/瓶，批号：020804。
1.2瘤株与动物H22小鼠肝癌细胞，由中科院上海药物研究所提供。ICR小鼠，雌雄各半，18~22g，由中国药科大学动物室提供,合格证号：苏动质SCXK（苏）2002-0011。
2方法
2.1灵芝孢子油对正常、H22荷瘤小鼠化疗(Cy)的减毒作用取ICR小鼠60只，按移植性肿瘤研究法［1］接种H22实体瘤，24h后随机分组，实验设：空白对照组，豆油对照组(20ml/kg)，灵芝孢子油高、中、低剂量组(2.5，1.25，0.625g/kg)ig给药，云芝胞内糖肽胶囊组(1g/kg)ig给药。另取ICR小鼠60只，不接种荷瘤，分组给药方法同上。各组给药1次/d，共7次，各组于给药第4，5天（除空白组外），连续2dipCy(100mg/kg)，于停药后24h，各组眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，同时摘取一侧完整股骨、胸腺、脾脏，分别测定骨髓有核细胞数，称胸腺、脾重，计算胸腺、脾脏系数，并进行统计学处理(t检验)。
2.2灵芝孢子油对正常小鼠、H22荷瘤小鼠60Co放疗的减毒作用取ICR小鼠60只，按移植性肿瘤研究法［1］接种H22实体瘤，24h后除空白对照组10只动物外，其余50只小鼠进行60Co照射，剂量为500rad；60Co照射后动物随机分为5组，实验设：空白对照组，豆油对照组(20ml/kg)，灵芝孢子油高、中、低剂量组(2.5，1.25，0.625g/kg)ig给药，云芝胞内糖肽胶囊组(1g/kg)ig给药。另取ICR小鼠60只，不接种荷瘤，除空白对照组10只动物外，其余50只小鼠进行60Co照射，剂量为500rad；60Co照射后动物随机分为5组，分组及给药方法同上。各组均给药1次/d，共7次，于停药后24h，各组眼眶静脉取血，镜检外周血白细胞总数，同时摘取一侧完整股骨、胸腺、脾脏，分别测定骨髓有核细胞数，称胸腺、脾重，计算胸腺、脾脏系数，并进行统计学处理(t检验)。2.3灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响取ICR小鼠50只，按移植性肿瘤研究法［1］接种H22实体型瘤。次日随机分为5组，实验设：豆油对照组(20ml/kg)，灵芝孢子油高、中、低剂量组(2.5，1.25，0.625g/kg)ig给药，云芝胞内糖肽胶囊组(1g/kg)ig给药。共给药11次。于末次给药后24h，尾静脉注射印度墨水，注入后1min及5min从小鼠眼眶后静脉丛取血，立刻吹入Na2CO3液中，于680nm处比色，按下式计算廓清指数K及吞噬系数α值。所得数据进行统计学处理(t检验)
廓清指数K=(logOD1-logOD5)/(t5-t1)
吞噬系数α=(体重/肝脾合重)×(K)1/3
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2.4灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠体液免疫功能的影响取ICR小鼠50只。按移植性肿瘤研究法［1］接种H22实体型瘤。次日随机分为5组，实验设：豆油对照组(20ml/kg)ig给药，灵芝孢子油高、中、低剂量组(2.5,1.25,0.625g/kg)ig给药，云芝胞内糖肽胶囊组(1g/kg)ig给药。共给药11d，于第7天，各组小鼠腹腔注入绵羊红细胞0.2ml/只(20%)进行初次免疫，末次给药1h后，取血，分离血清，测定并计算半数溶血值HC50，进行组间t检验，比较差异的显著性。
3结果
3.1灵芝孢子油对正常小鼠、H22荷瘤小鼠化疗(Cy)的减毒作用结果如表1~2所示，与空白组相比，Cy可显著抑制正常小鼠和荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核细胞数、胸腺系数和脾脏系数（P＜0.01）。与Cy模型组相比，灵芝孢子油中高剂量组及云芝胞内糖肽组均可对抗H22荷瘤和正常小鼠脾脏系数、胸腺系数、WBC数和骨髓有核细胞数的下降(P＜0.05或P＜0.01)。
表1灵芝孢子油对正常小鼠化疗的减毒作用(略)
与空白组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与豆油+Cy组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
表2灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠化疗的减毒作用(略)
与空白组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与豆油+Cy组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
3.2灵芝孢子油对正常小鼠、H22荷瘤小鼠60Co放疗的减毒作用结果如表3、4所示，与空白组相比，60Co可显著降低正常小鼠和荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核细胞数、胸腺系数和脾脏系数（P＜0.01）。与60Co模型组相比，灵芝孢子油中高剂量组及云芝胞内糖肽组均可明显抑制正常及荷瘤小鼠脾脏系数、胸腺系数、WBC数和骨髓有核细胞数的下降（P＜0.01，P＜0.05）。
表3灵芝孢子油对正常小鼠60Co放疗的减毒作用(略)
与空白组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与豆油+60Co组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
表4灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠60Co放疗的减毒作用(略)
与空白组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与豆油+60Co组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
3.3灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠网状内皮细胞吞噬功能的影响结果如表5所示。与豆油对照组相比，灵芝孢子油各剂量组及云芝胞内糖肽组均可显著提高H22荷瘤小鼠的廓清指数K及吞噬系数α值(P＜0.01或P＜0.05)。表明灵芝孢子油可显著提高小鼠网状内皮细胞的吞噬功能。
3.4灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠体液免疫功能的影响结果如表6所示，与豆油对照组相比，灵芝孢子油中高剂量组及云芝胞内糖肽组可显著提高H22荷瘤小鼠血清半数溶血值(HC50)(P＜0.01或P＜0.05)。表明灵芝孢子油可显著提高H22荷瘤小鼠的体液免疫功能。
表5灵芝孢子油对H22荷瘤小鼠网状内皮细胞吞噬功能的影响(略)
*P＜0.05，**P＜0.01与豆油对照组比较.n=10
4讨论
当前对恶性肿瘤的治疗是采用多种治疗手段联合应用的综合治疗模式,而放疗、化疗作为综合治疗中的重要手段，对肿瘤细胞缺乏特异性选择,在杀伤癌细胞的同时也损伤了正常细胞,致使机体免疫功能下降,骨髓造血功能明显受到抑制,引起外周WBC下降,从而影响治疗效果。肿瘤患者的免疫功能不仅与肿瘤的发生、发展密切相关，而且对判断肿瘤患者转归和预后都有重要的参考价值［2，3］。肿瘤的存在会抑制机体的细胞免疫及体液免疫功能，而放化疗治疗又会进一步加重机体的免疫抑制［4］。因此在抗肿瘤治疗中，提高机体的免疫力、降低放化疗的毒性，成为抗肿瘤治疗的一个主要方面。近年来，中药因其良好的免疫调节、减毒抗癌作用越来越引起人们的重视，从中药中寻找抗肿瘤辅助治疗的生物反应调节剂已成为当今研究的热点［4，5］。灵芝是一味在中医中沿用2000多年的中药，是祖国中医药宝库中的珍品，素有“仙草”之誉。古今药理与临床研究均证明，灵芝确有防病治病、扶正固本、延年益寿之功效，广泛用于许多慢性病的治疗，如癌症、肝炎、II型糖尿病、高血压等［7］。近年来，对灵芝属真菌的化学成分及临床作用的研究颇多，对灵芝的生殖细胞--孢子的药用价值研究也日益加强。现有的研究证明，灵芝孢子具有显著的防癌、抗肿瘤作用，其功效是灵芝子实体的60～70倍。灵芝孢子的功效成分主要有三萜类、多糖类、有机锗等［8］。灵芝孢子油是灵芝孢子的脂溶性物质，包括全部三萜类、核苷及有机锗，与部分水溶性物质（多糖类），经浓缩后的集合，具有极佳的抗肿瘤生物活性。本实验所用的灵芝孢子油是利用破壁灵芝孢子粉由超临界CO2流体萃取合超声强化提取，经进一步浓缩富集而得，其三萜类活性成分的含量高于传统的提取方法。前期体内外实验均已证实，此种方法提取的灵芝孢子油对多种肿瘤均有明显的抑制作用。本实验研究表明，灵芝孢子油中高剂量组可显著提高H22荷瘤小鼠的免疫吞噬系数α及和血清半数溶血值，说明其对小鼠网状内皮系统（RES）吞噬功能及其体液免疫功能均有明显的提高作用。灵芝孢子油对Cy和60Co照射造成的正常或H22荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核细胞数的减少、免疫器官萎缩等毒性反应,虽然不能使其完全恢复到正常水平,但均有明显保护作用。由此证明灵芝孢子油具有抗癌、扶正、减低放化疗毒性之功效，提示其在临床抗肿瘤治疗中可起到扶正减毒、改善患者生活质量的作用，有良好的应用前景和研究价值。对于灵芝孢子油提高免疫及对Cy和60Co照射减毒作用的内在机理，还有待于进一步研究。
