肺炎链球菌耐药机制
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【论文关键词】青霉素结合蛋白青霉素耐药感受态内酰胺类耐药率红霉素
【论文摘要】肺炎链球菌存在于人的喉部和鼻子的后部,大约40%的人平时就携带这种病菌,能引发肺炎、菌血症和脑膜炎,对人类的健康构成了一定的威胁,每年导致300万儿童死亡。更为严重的是,在过去用青霉素就可以杀死的肺炎链球菌,现在抵抗抗
肺炎链球菌存在于人的喉部和鼻子的后部，大约40%的人平时就携带这种病菌，能引发肺炎、菌血症和脑膜炎，对人类的健康构成了一定的威胁，每年导致300万儿童死亡。更为严重的是，在过去用青霉素就可以杀死的肺炎链球菌，现在抵抗抗生素的能力越来越强。科学家则希望通过对肺炎链球菌的基因测序，更好地认识这种细菌并开发出新的抗生素。近年来肺炎链球菌对抗生素耐药性呈上升趋势，并已出现多重耐药菌株，是临床感染控制中非常棘手的难题。
1耐药性的流行概况
在美国，上世纪80年代肺炎链球菌总的青霉素耐药率不到5%，而且均为低水平耐药（中介），到90年代初，总的青霉素耐药率迅速上升到17%，目前已经超过30%。Gordon等在1997年-2001年研究表明肺炎链球菌中耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP）检出率为16.7%，对复方磺胺甲唑的耐药率（R%）是25.0%。1997年-2000年，我国文献报道的肺炎链球菌耐药率（R+I）还仅在8.8%~22.5%之间，但在最近的调查中，肺炎链球菌对青霉素的耐药率（R+I）已高达42.7%，显示出快速上升的势头。还有一些最新调查显示，肺炎链球菌对红霉素的耐药率超过了70%。目前，对青霉素耐药的肺炎链球菌的数量报道不一，与地区分布有关[1、2]。广谱头孢菌素（如头孢曲松、头孢氨噻）已成功用于青霉素耐药的肺炎链球菌引起的严重感染，但对这些因子的抗药性也似乎有所增加。肺炎链球菌已对多种抗菌药物产生广泛耐药，包括β内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。肺炎链球菌对抗生素的耐药率在逐年增长，其中尤以青霉素和红霉素最受人们关注。
2影响耐药性的相关因素
耐青霉素G肺炎链球菌（PRSP）分离率近年来已在世界范围明显上升，特别是某些欧洲国家，美国一些地区，东南亚的某些国家地区PRSP已高达40%~50%[3、4]。肺炎链球菌对青霉素耐药最早发现于上世纪60年代中期，但引起人们注意的是在1977年在南非首次发生青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）引起的肺炎暴发流行[5]。以后世界各地都不断分离出PRSP，并使其成为耐药阳性球菌感染中引人注目的焦点之一。肺炎链球菌的血清型与青霉素的耐药性存在着一定关系，见表1。PRSP分离率上升与β内酰胺类抗生素如头孢菌素、非β内酰胺类抗生素如大环内酯类等抗生素大量使用及某些治疗方案不合理有很大关系。非β内酰胺类抗生素大环内酯类在临床上治疗呼吸道感染用得非常广泛，对诱导肺炎链球菌的耐药性也起着很大作用。如台湾省[6]用大环内酯类作为治疗呼吸道感染的一线药物导致所分离的PRSP对大环内酯类的耐药率高达98%。
3耐药性的发生机制
肺炎链球菌对青霉素与其他β内酰胺类抗生素的耐药机制主要是青霉素结合蛋白PBPS的改变。肺炎链球菌有6个PBPS，分子量43~100kDa，PBP-la与PBP-lb分子量均为100kDa，PBP-2a（89.4kDa），PBP-2x（82kDa），PBP-2b（78kDa），PBP-3（43kDa）。敏感肺炎链球菌的PBP-la/lb、PBP-2a/2x/2b都很容易被β内酰胺类抗生素结合而杀菌。肺炎链球菌耐药株PBP-la，2x，2a与2b这4个分子量较大的PBPS则与青霉素的亲和力明显降低。编码表达这几个PBP蛋白的基因为pbpla，pbp2x和pbp2b，这些耐药基因可在同种肺炎链球菌之间转移，横向转移，如由肺炎链球菌把耐药基因转移至草绿色链球菌，则pbp2b基因起着重要的作用。pbpla，pbp2x这两个基因都在体外一步法证明可把肺炎链球菌对超广谱头孢霉素的耐药性转移到敏感菌株中去。肺炎链球菌对青霉素耐药的作用过程包含了PBPS蛋白一系列变异。在一些青霉素耐药的菌株中的PBPS的结构有所改变，与β内酰胺类抗生素的亲和性降低，从而降低了对抗生素的敏感性。另外研究发现肺炎链球菌PBPS基因突变，可引起相对低水平耐药（在脑膜炎的治疗中可采用大剂量治疗）。人们发现β内酰胺类抗生素对肺炎链球菌的作用有两种方式：一种是以哌拉西林为代表的裂菌式；另一种是以头孢氨噻为代表的作用方式，这些头孢菌素类抗生素杀菌并不溶菌，这表明β内酰胺类抗生素作用于肺炎链球菌存在一些非PBPS相关的作用机制。目前人们已经发现了一些非PBPS的耐药相关基因，但并不清楚它们的作用机制。值得注意的是，这些与非PBPS基因相关的肺炎链球菌耐药菌株都是感受态缺陷菌株，提示细菌的感受态可能与非PBPS途径的耐药机制相关。感受态是肺炎链球菌在其生长的某一阶段自然形成的一种状态[7]，它可以摄取周围裸露的DN段。这类似人们熟悉的在实验室制备大肠杆菌的感受态，不同的是大肠杆菌不能自然形成此状态。肺炎链球菌的感受态是由一个叫作感受态刺激因子的17肽诱导形成的。最早发现的一个非PBPS的耐药基因是ciaH，为一种组氨酸蛋白激酶。人们发现在头孢噻肟耐药的肺炎链球菌中，有3株感受态缺陷菌株的PBPS没有异常改变，而发现ciaH的基因有变化。转化变异的ciaH到抗生素敏感的肺炎链球菌中，转化细菌同样程度耐药，提示细菌的耐药与ciaH的变异相关。另一研究则发现在哌拉西林耐药菌株中存在另一个基因cpoA的变化，这些菌株同样是感受态缺陷菌株。研究发现，与ciaH不同，cpoA的变异体仍有一定的感受态诱导活性，只是在较晚的时候发生。与非PBPS相关变异的耐药基因都与细菌的感受态相关，这提示肺炎链球菌的感受态可能影响了它们的表达，但目前的研究都只限于已发现的两种基因ciaH和cpoA对细菌感受态的影响，并没有研究感受态是否影响它们的表达。对头孢氨噻和哌拉西林的最低抑菌浓度监测的实验结果表明，野生菌株与其感受态缺陷菌株的MIC值的确有差异。提示感受态缺陷可影响菌株对β内酰胺类抗生素的敏感性，但对不同菌株的影响结果却不尽相同。目前所知的非PBPS类耐药基因只有ciaH和cpoA基因，而它们都与感受态相关。研究认为ciaH系统控制了细菌脂质转运的水平，因而该系统对胞壁质的合成有一定的调控作用。一些学者认为ciaH变异可能导致自身的异常激活，从而刺激细菌萜醇的合成，使脂质联结的胞壁质前体水平升高，增加了胞壁质的合成。而β内酰胺类抗生素可能诱导变异的ciaH活化，产生上述反应，以抵消细胞壁的损伤，使细菌表现出耐药性增高。
美国研究人员发现，在1994年到1999年间，对大环内酯类耐药的肺炎球菌增加了3倍。为了确定肺炎球菌对大环内酯类耐药的机制，研究人员在亚特兰大对4148个肺炎球菌的分离株进行了长达6年的血清定型和药敏试验。他们指出大环内酯耐药菌株的比例从1994年的16%增加到1999年的32%。研究人员发现，99%的大环内酯耐药菌株存在mefE或核糖体甲基化酶基因ermAM。在6年的监测中，ermAM血清型在细菌分离株出现率比较稳定，而mefE的出现率从1994年的9%增加到1999年的26%。到1999年，红霉素对93%带有mefE基因离株的最大抑制浓度增大到8mg/ml。近年来的研究表明，肺炎链球菌对大环内酯类抗生素耐药的机制涉及到多个方面，靶位改变由耐药基因erm变为mls型耐药。根据表达方式的不同，又分为cMLS内在型耐药和iMLS诱导型耐药。在肺炎链球菌中的elm基因绝大多数为ermB基因，少数由ermTR基因介导。我国以ermB基因介导的内在型耐药为主，对红霉素的耐药水平较高，对林可霉素类和链阳菌素B呈交叉耐药。我国有研究显示，148株红霉素耐药株中，耐药基因以ermB基因（79.1%）介导为主；耐药表型以MLS型耐药（89.2%）为主，其中cMLS占85.1%，iMLS占4.1%，为检测到ermTR基因。ermB基因被转座子携带，例如Tn917和Tn1545。在对日本人84株肺炎链球菌的研究显示出对大环内酯类耐药与Tn917或Tn1545携带的erm基因有关。大环内酯类耐药株被分成以下2组：第1组（19株）显示对红霉素有高度耐药性，但是对罗奇达敏感，是由于Tn1545上ermB基因的存在。第2组（65株）显示对这两种抗生素均有高度耐药性，也是由于Tn917上ermB基因的存在。2组中没有一株对大环内酯类持续耐药，第2组中菌株的ermB基因促进区都有一个缺失并且在主要肽键上还有TAAA插入子。脉冲凝胶电泳和血清学分型显示Tn1545是克隆扩散而Tn917是水平性克隆性扩散，得出的结论是，日本肺炎链球菌大环内酯类耐药株主要是ermB基因被Tn917携带扩散。
在许多欧洲国家，肺炎链球菌对大环内酯类的耐药水平已经超过对青霉素G的耐药水平。国外学者认为，大环内酯类抗生素的广泛应用可能是红霉素耐药增加的主要原因，回顾过去19年大环内酯类抗生素的使用和肺炎链球菌的耐药情况显示：红霉素的耐药与大环内酯类药物的消耗有很高的相关性，而红霉素的不同耐药机制与不同类型大环内酯类抗生素的应用并无关联。其不同耐药机制的地区差异是否与多药耐药株的克隆传播有关，需进一步研究。还有学者报道，携带ermB基因的肺炎链球菌对红霉素的MIC值多大于32μg/ml，而携带mefA基因的肺炎链球菌MIC值多小于32μg/ml。根据不同耐药与红霉素耐药高低的关系，有学者提出，克拉霉素、阿奇霉素因其特殊的药代动力学，在组织和感染部位的浓度较高，故治疗携带mefA基因的耐红霉素肺炎链球菌应有效，但目前尚无动物实验或临床试验证实，仍需进一步研究。
肺炎链球菌对头孢菌素耐药的机制为：肺炎链球菌与其他耐药菌（如草绿色链球菌和其他肺炎链球菌）的脱氧核糖核酸结合后导致西林结合蛋白编码的基因改变，产生的西林结合蛋白可减弱肺炎链球菌对β内酰胺类抗生素的亲和力耐药。从临床标本中分离出的92株肺炎链球菌进行了药敏试验，结果青霉素耐药株占25%，头孢菌素、四环素和氯霉素随青霉素的MIC升高而对肺炎链球菌的敏感性下降。青霉素敏感株的6%、中度耐药株的57%和高度耐药株的100%对1种以上的其他抗生素耐药。全部菌株对万古霉素敏感。12株多种抗生素耐药者均对青霉素中度以上耐药。所以万古霉素是治疗青霉素耐药肺炎链球菌感染的首选抗生素。另外，在肺炎链球菌对喹诺酮类耐药性研究中发现，在分离的81株左旋氧氟沙星耐药株中78株（96.3%）经分析有多数喹啉耐药决定区gyrA、gyrB、parC和pare基因突变。对喹诺酮类的耐药机制为：DNA回旋酶变异和药物排出。前者由gyrA、gyrB、parC和pare基因介导，后者由pmrA基因介导。根据大批量流行病学调查研究，应用分子技术显示链球菌抗生素耐药性扩散是克隆性扩散。
我国的研究还发现，无论是儿童还是成年人分离的肺炎链球菌，对青霉素、红霉素耐药均呈迅速上升趋势，通过对新生儿呼吸道的20株对青霉素耐药的肺炎链球菌与青霉素耐药相关的青霉素结合蛋白2编码序列pbp2B基因，与红霉素耐药相关erm，mefA基因进行了检测与分析，发现20株新生儿临床分离的肺炎链球菌苯唑西林表型耐药率达100%，均有pbp2B基因突变。获得erm基因的细菌可同时对大环内酯类-林可霉素-链阳菌素B耐药，细菌也可因获得mef基因表达主动外排转运使红霉素从细菌内向外排出而耐药，此机制仅耐红霉素。20株耐青霉素的肺炎链球菌对红霉素的耐药率达85%，均检出mefA/B，17株检出mefA基因。这项研究提示一线药物已不能完全控制该地区的肺炎链球菌感染。
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