分离大黄酚

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【摘要】目的研究大黄酚和大黄素甲醚混合物的高效分离方法。方法采用硅胶柱色谱进行分离，薄层色谱跟踪检测，HPLC检测产品纯度。结果在以工业级柱层析硅胶（100～200目）为填充剂的色谱柱上，以石油醚乙酸乙酯甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，可以将大黄酚和大黄素甲醚完全分离。结论硅胶柱色谱可以实现大黄酚和大黄素甲醚的高效分离；产品经HPLC检测，纯度达99%以上。

【关键词】柱色谱法；大黄酚；大黄素甲醚

Abstract:ObjectiveTostudytheefficientandsimplemethodofseparationofchrysophanolandphyscion.MethodsUsingsilicagelcolumnchromatographyforseparation,TLCfortrackinganddetection,HPLCforpuritydetectionoftheproducts.ResultsChrysophanolandphyscioncouldbecompletelyseparatedbyindustrialsilicagelcolumnchromatography［100～200mesh,petroleumetherethylacetateformicacid(100∶1∶0.5)aselute］.ConclusionChrysophanolandphyscioncouldbeeffectivelyseparatedbysilicagelcolumnchromatography.Theirpuritieswere≥99%byHPLCmethod.

Keywords:columnchromatography；chrysophanol；physcion

大黄(RheumofficinaleBaill.)为常用中药,具有泻下、抗菌、抗肿瘤、抗高脂血症、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、消炎、延缓衰老、调节免疫等作用［1］。大黄的主要有效成分是其中的5种游离蒽醌类化合物（见图1），例如，大黄酸具有抗肿瘤、抗炎、抗菌及调节肾功能等作用［2］；大黄素具有抑菌、抗炎、保护肝肾、抑制血小板聚集、改善微循环、抗癌等作用［3］；芦荟大黄素具有清除氧自由基、诱导肿瘤细胞凋亡等作用［4］；大黄素甲醚可通过血脑屏障，具有很强的抗炎作用［5］；大黄酚具有抗衰老作用、止血作用［6］。大黄酸、大黄素和芦荟大黄素可以通过简单的pH梯度萃取法和重结晶得到单体，而大黄酚和大黄素甲醚在植物体内常共同存在，它们结构相似，酸性与极性相近，分离很困难。大黄酚和大黄素甲醚不仅具有较好的药理活性，而且大黄酚通过氧化反应可以转化为大黄酸，通过卤代和水解反应可以转化为芦荟大黄素；大黄素甲醚通过脱甲基化反应可以转化为大黄素。因此，大黄酚和大黄素甲醚单体的简单获取具有重要意义。我们在大黄的综合深加工研究中，得到了大量大黄酚和大黄素甲醚的混合物，并通过多次实验探索，找出了一种快捷、简单、高效的分离方法，现报道如下。

图1大黄中5种主要游离蒽醌类化合物的结构式（略）

Fig.1ThestructuresoffivemainactiveanthraquinonesofRheumofficinale

1仪器与试剂

1.1仪器

RE52cs旋转蒸发器（巩义市英峪予华仪器厂）；电子恒温水浴锅（深圳市国华仪器厂）；SHBⅢ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2试剂

大黄酚和大黄素甲醚混合物（自制，从大黄中分离得到）；柱层析硅胶（工业级，100～200目，青岛海洋化工厂）；薄层层析硅胶G（化学纯，青岛海洋化工厂）；石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；大黄酚和大黄素甲醚对照品（中国药品生物制品检定所）。

2方法与结果

2.1薄层硅胶板的制备

配制质量分数为0.3％的羧甲基纤维素钠(CMCNa)水溶液，与薄层层析硅胶G粉，按3mL∶1g的比例配制调浆，以载玻片作为载体铺板，铺好后晾干，于105℃下活化1h，放入干燥器中，备用。

2.2色谱柱的制备

取一根内径和长度合适的玻璃层析柱，用洗脱剂湿法装柱，用手轻敲柱子，使硅胶装填结实且顶端平整，有效柱长控制在20cm左右，硅胶用量为样品量的200倍。

2.3样品的制备

大黄酚和大黄素甲醚的混合物用最少量的三氯甲烷溶解，再加入适量硅胶拌样（硅胶∶样品=20∶1，质量比），待氯仿挥发干后均匀铺于柱顶。

2.4洗脱

以石油醚（60～90℃）乙酸乙酯甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，进行洗脱，洗脱液减压浓缩后可循环利用。

2.5色谱带的定位

洗脱一定时间后可以看见两段明显的色谱带，洗脱得快的那一段为大黄酚，较慢的那一段为大黄素甲醚。继续洗脱，分别得到橙红色颗粒状结晶（大黄酚）和橙黄色针状结晶（大黄素甲醚）。

2.6薄层色谱鉴定

取制备好的薄层硅胶板，以石油醚乙酸乙酯甲酸（体积比10∶1∶0.5）为展开剂，以对照品作对照，确定橙红色颗粒状结晶为大黄酚，橙黄色针状结晶为大黄素甲醚。

2.7大黄酚和大黄素甲醚纯度的HPLC检测方法(归一化法)

色谱柱为DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温为30℃，进样量为10μL，流动相为甲醇质量分数为0.1％的磷酸溶液(体积比85∶15)，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm。检测结果表明大黄酚纯度为99.01%，大黄素甲醚纯度为99.06%。色谱图见图2、3。

图2大黄酚的HPLC图（略）

Fig.2HPLCofchrysophanol

图3大黄素甲醚的HPLC图（略）

Fig.3HPLCofphyscion

3讨论

3.1大黄酚和大黄素甲醚的分离研究，国内已有多篇文献报道：将样品先用经预处理的一定粒度的磷酸氢钙柱层析，然后用苯［7］或石油醚［8］洗脱，但此操作繁琐、费时，且苯的毒性较大；用纤维素柱层析易于分离、洗脱剂较单一(水饱和石油醚)，但纤维素粉制备费时［9］；也有人用薄层硅胶常压湿柱层析，然后用石油醚丙酮或石油醚乙酸乙酯(体积比15∶1)［10］洗脱，虽然洗脱速度很快，但两者的分离度不是很理想。本文用工业级柱层析硅胶（100～200目）作柱层析进行分离，可在较短时间内获得完全分离，方法有效，简便，且洗脱剂可以循环使用，节省试剂。

3.2装柱技术和加样技术可直接影响分离效果，宜采用较低活性的吸附剂，如硅胶的活性在Ⅱ～Ⅲ级较好，对于高活性的吸附剂预先用10％的展开剂进行饱和，否则在展层过程中，溶剂前沿不易整齐，影响层带分离；加样时，一定要均匀地平铺于柱顶，否则会出现层带交叉现象。

3.3铁离子能与大黄素甲醚生成络合物，于50℃热结构易破坏。因此，在用硅胶柱层析法分离大黄素甲醚和大黄酚的过程中，应避免与铁离子的接触，特别需要控制硅胶中的铁含量，含铁量低于0.02％的层析硅胶影响较小。

3.4大黄酚和大黄素甲醚混合物的上样量一般为0.2g，量再增加就不能使它们完全分离［11］，而本文的上样量达到5g,且能得到完全分离。

3.5大黄酚和大黄素甲醚属于蒽醌类化合物，酚羟基呈弱酸性，本实验在柱层析洗脱剂和薄层展开剂中加入少量酸，目的是为了防止大黄酚和大黄素甲醚产生拖尾，从而使分离效果更佳。

【参考文献】

［1］李秀才．大黄的研究进展［J］．中国药学杂志，1998，33(10)：581．

［2］郭美姿，徐海荣.大黄酸药理作用的研究进展［J］.国外医学中医中药分册，2002，24（3）：139-142.

［3］侯晓东，施瑞城，叶丽萍.大黄素的研究现状和展望［J］.中国热带医学，2005，5（8）：1738-1740.

［4］史明，段开文.芦荟大黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展［J］.口腔材料器械杂志，2006，15（4）：217-219.

［5］韩国柱．中草药药代动力学［M］．北京：中国医药科技出版社，l999：345-346.

［6］武秀英，武庆泰，刘丽君．大黄的药理研究与临床应用［J］．中医药学报，1995，2(2)：54-56.

［7］中国科学院上海药物研究所．中草药有效成分提取与分离［M］．2版.上海：科学技术出版杜，1983：331-332．

［8］北京医学院．中草药成分化学［M］．第2版.北京：人民卫生出版社，1980：224．

［9］阚毓铭．大黄酚和大黄素甲醚分离方法的研究［J］．南京中医学院学报，1982(2)：37-39．

［10］孙阳，陈琼华．中药大黄的综合研究XV:薄层硅胶常压柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚［J］．药物分析杂志，1985，5(5)：294-295.

［11］廖华卫，李瑞珍，陈飞苑.大黄中大黄酚的提取、分离和纯化方法研究［J］．中国药房，2006，17（12）：956-958.