脑得生丸葛根异黄酮提取
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【摘要】目的优选脑得生丸中有效成分葛根异黄酮的提取工艺。方法以正交设计安排试验，采用高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷的含量，并以此为指标考察溶剂浓度、溶剂用量、提取时间3个因素对异黄酮提取率的影响。结果用12倍量的体积分数为40%的乙醇回流提取2次，每次1h的条件为最佳提取工艺。结论本提取工艺设计合理，稳定，可为脑得生丸的进一步开发提供可靠的实验依据。
【关键词】脑得生丸；异黄酮；葛根；大豆苷；提取工艺
脑得生丸收载于《中国药典》2005年版一部，由三七、川芎、红花、山楂和葛根等加工而成的蜜丸［1］。具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效，是治疗脑动脉硬化、脑中风及脑出血后遗症的常用药。葛根为豆科植物野葛［Puerarialobata(Willd.)Ohwi］的干燥根，主要含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类成分，能改善冠脉、脑和外周血循环，抑制血小板聚集，降低血压，降低心肌耗氧量［2，3］。由于脑得生丸处方所含有效成分的极性差别较大，为进一步纯化的需要，本课题组将其处方分为葛根、红花和三七、川芎、山楂两个部分，分别进行提取工艺研究。本文对葛根和红花这部分进行报道，以葛根素、大豆苷作为异黄酮类成分的定量指标，探讨了脑得生丸中葛根异黄酮的最佳提取工艺条件。
1仪器与试药
1．1仪器
Waters2695型高效液相色谱仪；Waters2996二级管阵列检测器；WatersEmpower色谱工作站；RE52CS旋转蒸发仪和B220型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；十万分之一电子分析天平（SHIMADZU）；纯水制备系统（重庆艾科浦）；SHBIV22B循环水多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
1．2试药
色谱甲醇，自制纯净水，其它试剂均为分析纯；葛根和红花药材购于河南省药材总公司，由我院生药教研室李书渊教授分别鉴定为豆科植物野葛［Puerarialobata(Willd.)Ohwi］的干燥根和菊科植物红花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花；葛根素和大豆苷对照品（批号：7522200108，中国药品生物制品检定所）。
2方法与结果
2．1色谱条件
以十八烷基键合硅胶柱为色谱柱；以甲醇水(体积比20∶80)为流动相；检测波长为250nm；流速1.0mL/min；柱温30℃。
2．2对照品溶液的配制
精密称取葛根素和大豆苷对照品，分别置10mL容量瓶中，加入甲醇5mL，超声溶解后，用甲醇定容至刻度，制得葛根素质量浓度为0.512mg·mL-1，大豆苷质量浓度为0.925mg·mL-1，密封保存，备用。
2．3药材溶液的制备
取葛根药材粉末(过3号筛)，精密称定，置锥形瓶中，精密加体积分数为50%的甲醇50mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用体积分数为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2．4标准曲线的制备
分别精密移取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0mL置10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液。进样体积10μL,按色谱条件测得进样量与峰面积,计算回归方程，结果见表1。
表1两种异黄酮的回归方程和线性范围（略）
Tab.1RegressionequationsandlinearrangesoftwokindsofIsoflavone
2．5提取工艺条件优选［5］
按复方脑得生丸处方量的1/5，称取红花18.2g与葛根52.2g，等量9份药材。按正交设计安排试验(见表2)，回流提取2次，合并滤液，回收溶剂至500mL，定量移取25mL，置1000mL容量瓶中，加体积分数为50%的乙醇至刻度，滤过，取续滤液作为正交试验的供试样品溶液。进样10μL,照“2.1”项下色谱条件测定。由外标法分别计算葛根素和大豆苷含量，两者之和为异黄酮的含量。结果见表3。
表2因素和水平表（略）
Tab.2Factorsandlevels
2．6阴性干扰试验
称取红花药材18.2g，加体积分数为40%的乙醇12倍量，回流提取2次，1h/次。以下操作同“2.5”项操作。色谱图见图1。
A.对照品;B.供试样品;C.阴性样品
1.葛根素;2.大豆苷
图1高效液相色谱图（略）
Fig.1HPLCchromatograms
表3正交实验L9(3)4结果分析表（略）
Tab.3AnalysisoftheorthogonalexperimentL9(34）
*相当于每克葛根药材中的含量
表4方差分析表（略）
Tab.4Analysisofvariance
3讨论
3．1由表3中的R值可看出,影响异黄酮含量提取的主次因素依次为溶剂浓度>提取时间>溶剂用量。表4的方差分析表明，溶剂浓度对试验有显著性意义，提取时间次之，溶剂用量影响相对较小。但采用低浓度乙醇回流提取时杂质较多，结合生产需要，确定脑得生丸中异黄酮类成分的优选提取工艺为A1B2C2,即：选用12倍量的体积分数为40%的乙醇，回流提取2次，每次1h。按此工艺进行，以葛根素和大豆苷为指标，相对于葛根药材，其异黄酮的转移率可达到90%以上。
3．2本研究首次以葛根素和大豆苷为指标，采用高效液相色谱法考察脑得生丸中异黄酮的提取工艺。该方法与文献［6,7］所采用的UV法相比，结果更准确，所优选的提取工艺切实可行。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：572.
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［3］曹钟灵，李建北，张东明.葛属植物中异黄酮类化合物的研究进展［J］.中药材，2005,28(1):67～71.
［4］祝世发，陈文，江发寿，等.葛根中葛根素的提取工艺研究［J］.时珍国医国药，2004,15(3):114.
［5］周永治，马志庆.医药数理统计［M］.2版.北京：科学出版社，2005.
［6］杨世军，张会香，周怡静.葛根中异黄酮的提取与纯化工艺研究［J］.食品科学，2004，25(8):124～127.
［7］李青坡，王永圣，游剑，等.葛根总异黄酮提取工艺的研究［J］.中国药业，2004，13(5):46～47.
