测定垂盆草总黄酮含量

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【摘要】目的建立垂盆草中总黄酮含量的测定方法。方法采用紫外分光光度法，测定波长为501nm。结果总黄酮检测浓度在0.01036～0.08288mg/mL范围内与吸光度线性关系良好(r=0.9998)，平均加样回收率为98.62%(RSD=1.11%，n=6)。结论本方法用于垂盆草中总黄酮的含量测定，结果准确、可靠、稳定。

【关键词】紫外分光光度法；垂盆草；总黄酮；含量测定

垂盆草(SedumsarmentosumBunge)又称卧茎景天，系景天科多年生草本植物垂盆草的新鲜或干燥的全草，我国大部分地区均有分布。该药味甘、淡、性凉，具有清热解毒、利尿消肿、排脓生肌之效，主治丹毒溃疡，小便不利及急、慢性肝炎等。据有关文献报道，垂盆草中含有氰苷、黄酮类、甾醇类和三萜类等化合物［1，2］。潘金火等［3，4］对垂盆草的保肝降酶活性成分进行了一系列的研究，证明垂盆草中具有保肝降酶作用的活性成分主要存在于H2O部分和nBuOH部分（主要含苷类和总黄酮），进而确认其中的总黄酮是垂盆草中保肝降酶的主要活性组分之一。本文采用经典的比色法对垂盆草中的总黄酮含量进行测定，以为其后继的开发利用提供依据。

1仪器与试药

UV2401型可见紫外分光光度计(日本岛津公司)；bp211D型十万分之一天平(德国赛多利斯公司)；索式提取器等。

芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:086-9303)；垂盆草(购于安徽省毫州市药材总公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室王春根教授鉴定为SedumsarmentosumBunge的干燥全草，粉碎至40～60目)；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇等为分析纯。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备

精密称取于120℃下减压干燥至恒重的芦丁对照品10.36mg，置50mL容量瓶中，加80%（体积分数）乙醇35mL超声使之完全溶解，冷却至室温，以80%（体积分数）乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度0.2072mg/mL的芦丁对照品溶液，冷藏，备用。

2.2供试品溶液的制备

精密称取垂盆草药材粉末1.0g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）100mL在85℃水浴温度条件下回流提取至无色，弃去石油醚，药渣挥干石油醚，再用80%（体积分数）乙醇100mL在100℃水浴温度条件下回流提取6h，冷却后，用80%（体积分数）乙醇定容至100mL,备用。

2.3定性鉴别反应

2.3.1氨水反应

取样品溶液点于滤纸上，将滤纸在氨水上方熏15min，立即置紫外光下观察(254nm)，呈黄绿色荧光斑点。

2.3.2三氯化铝反应

取样品溶液点于滤纸上，滴加5%（质量分数）三氯化铝甲醇溶液，吹干呈灰黄色，在紫外光下(254nm)观察，呈黄绿色荧光斑点。

2.3.3盐酸-镁粉反应

取样品1mL，加少许镁粉，再滴加几滴浓盐酸，水浴加热2min后显红色。

2.4测定波长的选择

精密量取对照品溶液3mL和供试品溶液5mL，分别置10mL容量瓶中，加5%（质量分数）亚硝酸钠溶液0.4mL，混匀，放置6min；加10%（质量分数）硝酸铝溶液0.4mL，放置6过min；加4%（质量分数）氢氧化钠溶液1.0mL，用80％（体积分数）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，以80％（体积分数）乙醇为空白同法配制空白对照液。在400～700nm波长处扫描，对照品与供试品溶液显色后均在501nm左右波长处有最大吸收，故将501nm作为测定波长。紫外光谱图见图1。

1．供试品;2．芦丁对照品;3．阴性对照

图1紫外扫描图谱（略）

Fig.1UVSpectrum

2.5专属性试验

取“2.2”项下供试品溶液5mL,置10mL容量瓶中，加80%（体积分数）乙醇至刻度，以80%（体积分数）乙醇溶液为空白对照液，在400～700nm波长处扫描。未经显色的供试品在501nm左右波长处基本无吸收，说明此显色方法的专属性较强。紫外扫描光谱见图1。

2.6标准曲线的绘制

分别精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，各置10mL容量瓶中，分别加80%（体积分数）乙醇至5mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.4mL，混匀，静置6min；加入10%（质量分数）硝酸铝溶液0.4mL，摇匀，静置6min，加入4%（质量分数）氢氧化钠溶液1.0mL，再加80%（体积分数）乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以80％（体积分数）乙醇为空白同法配制空白对照液。分别于501nm波长处测定吸光度，以吸光度值(A)对质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程ρ=0.0865A+0.0012(r=0.9998)。结果表明，芦丁检测浓度在0.01036～0.08288mg/mL范围内线形关系良好。

2.7精密度试验

取“2.1”项下对照品溶液5mL，置25mL容量瓶中，按“2.4”项下的方法显色，于501nm波长处测吸光度5次。结果，吸光度平均值为0.4616，RSD=1.94%，表明该方法精密度良好。

2.8稳定性试验

取“2.2”项下供试品溶液5mL,置10mL容量瓶中，按“2.4”项下的方法显色，于0、20、40、60、80、100、120min时测定吸光度。结果RSD=1.16％。表明样品显色后120min内稳定性良好。

2.9重现性试验

取药材样品1.0g，共6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备各供试品溶液，各取5mL再按“2.4”项下的方法显色，于501nm波长处测定吸光度。按标准曲线法计算，结果，总黄酮的平均含量为1.21%，RSD=1.67%，表明本方法重现性良好。

2.10加样回收率试验

精密称取于120℃下减压干燥至恒重的芦丁对照品50.86mg，置50mL容量瓶中，加80%（体积分数）乙醇35mL超声使之完全溶解，冷却至室温，以80%（体积分数）乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度1.0172mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。取垂盆草药材约0.5g，共6份，精密称定，置索氏提取器中，分别加入浓度为1.0172mg/mL的芦丁对照品溶液6mL，按“2.2”项下方法制备各供试品溶液。取各供试品溶液5mL，再按“2.4”项下的方法显色，于501nm波长处测定吸光度，采用随行标准，标准曲线法定量，结果见表1。

2.11样品含量测定

取3个批号的垂盆草药材约1.0g,每批两份，精密称定，按“2.2”项下的方法制备各供试品溶液，各取5mL再按“2.4”项下的方法显色，于501nm波长处测定吸光度。按标准曲线法计算，结果3个批号070101、070111、070121的总黄酮含量分别为1.21%、1.24%和1.20%。

表1芦丁加样回收率试验（略）

Tab.1Resultsofrecoverytest

3讨论

提取总黄酮可采用不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮等作溶剂，但黄酮类化合物基本不溶于石油醚［5，6］，故先用石油醚脱脂，再选用80%（体积分数）乙醇作溶剂，可将黄酮苷和苷元较完全地提取出来，并避免和减少多种水溶性成分的溶出。实验结果表明，在该条件下总黄酮含量较高，为1.22％。垂盆草中黄酮类化合物具有很好的保肝降酶作用，所以垂盆草有很好的开发利用价值。

【参考文献】

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社，2005.148．

［2］魏太明，阎玉凝，关昕璐，等．垂盆草的化学成分研究I［J］．北京中医药大学学报，2003，26（4）：59-60．

［3］潘金火，何满堂，许惠琴，等．垂盆草中保肝降酶活性组分的筛选［J］．中国药事，2002，16(6):365-366.

［4］潘金火，何满堂，罗兰，等．垂盆草不同提取部位保肝降酶试验［J］．时珍国医国药，2001，12(10):888-890.

［5］陈晓青，蒋新宇，刘佳佳．中草药成分分离分析技术与方法［M］．北京:化学工业出版社，2006：59．

［6］潘金火.垂盆草的化学、药理及其注射液制备工艺和质量标准研究［D］.南京:南京中医药大学,2000.